基于天然poIFN-α17突变的高活性猪干扰素α17m的制备及其体外抗病毒活性

为获得高抗病毒活性的猪α亚型干扰素(porcine interferon α,poIFN-α),将天然的poIFN-α17进行突变和合成,并将突变后的猪poIFN-α17基因命名为poIFN-α17m,合成poIFN-α17和poIFN-α17m基因后将其克隆入pVB220大肠杆菌表达载体,将该载体转化DH5α感受态细胞,进行温度诱导表达后,收集菌体进行SDS-PAGE。将表达的蛋白采用Ni琼脂糖凝胶纯化后,采用Western blot检测重组poIFN-α17和poIFN-α17m的反应原性,在PK-15细胞上检测其对VSV和PRV的抗病毒活性,检测重组poIFN-α17和poIFN-α17m蛋白对下游干扰素刺激基因(interferon stimulating genes, ISGs)Mx1、OAS1、ISG15的诱导激活作用。结果显示,成功构建了pVB220-IFN-α17和pVB220-IFN-α17m表达载体,实现了poIFN-α17和poIFN-α17m在大肠杆菌中的表达。该蛋白具有良好的反应原性,且重组poIFN-α17m在PK-15细胞上对水泡性口炎病毒(vesicul...     

猪IFN-α14的表达、纯化及抗病毒活性分析

干扰素(interferon, IFN)是一类具有抗病毒和免疫调节功能的细胞因子,目前已经应用于多种人和动物病毒病的预防和治疗。不同猪干扰素亚型的抗病毒活性差异较大,为了解猪IFN-α14的抗病毒活性,将猪IFN-α14基因序列进行分析,去除信号肽、优化密码子,并采用基因合成的方法合成了猪IFN-α14亚型基因,将其克隆入pCSMH原核表达载体,优化诱导条件,利用Ni琼脂糖凝胶纯化柱进行亲和层析,获得高纯度的重组猪IFN-α14蛋白,Western blot检测证明重组蛋白具有较好的特异性。用不同浓度的重组猪IFN-α14处理Vero细胞后,接种1 000 TCID₅₀猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV),24 h收集细胞和上清,通过荧光定量检测细胞内病毒的RNA水平,同时测定细胞上清中病毒的TCID₅₀。猪IFN-α14蛋白被成功表达并纯化,证明了10μg/L的重组猪IFN-α14干扰素能够显著抑制PEDV的复制。与本实验室前期表达纯化的猪IFN-α2、8相比,猪IFN-α14抑制P...     

重组鸭α-干扰素的表达与鉴定

根据大肠杆菌密码子的偏好性,试验对GenBank中已经发表的鸭α-干扰素基因序列进行密码子优化,人工合成后构建原核表达质粒pET30a-DuIFNα-ELP;将重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达制备DuIFNα-ELP;通过SDS-PAGE切胶方法得到纯化的DuIFNα-ELP;纯化产物免疫小鼠后收获血清,用Western blotting验证免疫血清的特异性,并用ELISA法检测其特异性抗体滴度。根据类弹性蛋白多肽(ELP)温度敏感的可逆相变特性,通过重复可逆相变循环(ITC),在高盐离子浓度和临界温度下纯化重组蛋白,并采用微量细胞病变抑制法在MDCK/VSV系统中检测重组蛋白的抗病毒活性。结果表明:合成的重组鸭α-干扰素基因能成功表达,重组蛋白DuIFNα-ELP约80 ku,免疫小鼠可产生特异性抗体,抗体效价为1∶1000000。抗病毒试验检测重组DuIFNα-ELP的抗病毒活性为1.0×106U/mL,比活性为1.25×106U/mg。这一结果为研制广谱、安全、高效的基因工程鸭α-干扰素提供参考,也为检测体内外DuIFNα的表达奠定了基础。     

吉林白鹅α干扰素在大肠杆菌中的表达及抗病毒活性检测

用PCR方法扩增了吉林白鹅α干扰素(IFN-α)成熟肽编码序列,将IFN-α片段定向插入原核表达载体pGEX-6p-1中,构建重组质粒pGEX-IFN-α,将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞里,在IPTG诱导下表达可溶性的融合蛋白(GST-IFN-α)。SDS-PAGE、Western-blot检测结果表明,重组吉林白鹅IFN-α融合蛋白(rGoIFN-α)的分子量大小约为43ku,能与IFN-α抗血清发生特异性结合反应。重组吉林白鹅α干扰素经谷胱甘肽Sepharose-4B亲和柱层析纯化后,在鸭胚成纤维细胞上抗鹅细小病毒的活性为3.32×105 U/mg,本试验结果表明,该表达系统能够表达重组鹅α干扰素,且表达的重组鹅α干扰素具有一定的抗病毒活性。     

脂多糖对猪繁殖与呼吸综合征病毒诱导的抗病毒免疫反应的影响

为研究脂多糖对猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)诱导的抗病毒免疫反应的影响,本研究采用100 TCID₅₀的PRRSV感染猪肺巨噬细胞（porcine alveolar macrophage,PAM）,感染12 h后用100 ng/mL脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)处理感染细胞,分别培养12、24、36、48 h后收集细胞及上清,同时设PRRSV组、LPS组和PAM细胞组,用河南农业大学兽医微生物研究室已建立的Real-time qPCR方法对LPS+PRRSV组和PRRSV组中PRRSV复制水平及各组PAM细胞中IFN-α、TNF-α mRNA转录水平变化进行定量分析。结果显示,LPS+PRRSV组与PRRSV组相比,PRRSV拷贝数12～48 h均较低,IFN-α mRNA转录水平显著升高（P＜0.05）,TNF-α mRNA转录水平升高,在48 h时转录水平降低。而与LPS组相比,LPS+PRRSV组IFN-α mRNA转录水平在12 h时升高,24、36、48 h均降低。结果表明,PRRSV感染PAM细胞经LPS刺激后,IFN-α、TNF-α mRNA转录水平显著升高（P＜0.05）,从而抑制了PRRSV在PAM细胞内的复制。     

猪干扰素-α表达质粒和多聚左旋氨基酸共聚物对PRRSV弱毒疫苗诱导产生中和抗体的影响

研究非病毒载体多聚左旋赖氨酸(PLL)与猪干扰素α(PIFNα)重组质粒的聚合物PLL-pVAX1-PIFNα对PRRSV弱毒疫苗诱导产生中和抗体的影响。本文首先构建了猪干扰素α真核表达质粒pVAX1-PIFNα,并将此重组质粒在293T细胞中转染,经Western blot验证PIFNα在细胞上清中分泌表达;将pVAX1-PIFNα与PLL以适当的比例聚合后,联合PRRSV弱毒疫苗免疫动物,应用ELISA抗体试剂盒检测PRRSV抗体的水平。结果表明:联合聚合物PLL-pVAX1-PIFNα注射免疫组的抗体水平明显高于其他各组,说明PLL与pVAX1-PIFNα表达质粒的聚合,显著提高了pVAX1-PIFNα表达质粒联合PRRSV弱毒疫苗免疫后诱导机体产生抗体的能力。     

重组鸡α-干扰素的表达及其生物活性的初步研究

为获得重组鸡α-干扰素并对其进行生物活性研究,本试验对重组大肠杆菌进行诱导表达,收集重组鸡α-干扰素包涵体后进行复性纯化及免疫印迹试验,并通过测定病毒EID₅₀,在接种H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的鸡胚中进行干扰素抗病毒活性试验,运用微变量细胞病变抑制法进行重组鸡α-干扰素抗病毒效价的测定。结果显示复性后重组鸡α-干扰素的免疫印迹试验成功获得了预期条带,在鸡胚中重组鸡α-干扰素具有显著的抗H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒等活性作用。在CEF/VSV细胞系上测定重组鸡α-干扰素的抗病毒效价为1.5×2¹⁰ U/mg左右,高浓度重组鸡α-干扰素具有一定的细胞毒性。结果表明重组鸡α-干扰素蛋白具有免疫原性和抗原性,在鸡胚内具有较好的抑制或杀灭H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的效果,呈广谱性,抗病毒效价较高,为下一步抗病毒制品的创制奠定基础。     

重组牛α-干扰素的原核表达与纯化

为在大肠杆菌表达系统中高效表达牛α-干扰素(bovine interferon-α,Bo IFN-α),将经密码子优化后的牛α-干扰素成熟蛋白基因合成并克隆到表达载体p Cold II中,转化大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,获得可溶性的表达蛋白。对重组菌表达条件进行优化,结果显示在IPTG浓度为0.64 mmol/L,诱导温度为15℃,诱导时间为9 h的条件下,可溶性目的蛋白的表达量最高。重组蛋白经镍柱纯化后的纯度为99.2%,表达量为36 mg/L菌液。重组蛋白在MDBK细胞上抗水泡性口炎病毒的活性为1×106U/mg。     

在大肠杆菌中高效表达具有抗病毒活性的可溶性犬α7干扰素

为了在大肠杆菌表达系统中高效表达具有抗病毒活性的犬0干扰素(CaIFN-α),本研究从犬肝脏中PCR获得CaIFN-α第7亚型(CaIFN-α7)基因,通过重叠延伸PCR方法在CaIFN-α7的N端融合连接内含肽SspDnaB intein (SDI)基因,并将该融合基因连接至pMAL-c2X载体中,构建含有内含肽和麦芽糖结合蛋白基因的CaIFN-α重组质粒.重组质粒在大肠杆菌Rosetta中经IPTG诱导高效表达可溶性CaIFN-α蛋白,经直链淀粉树脂亲和层析纯化后可以得到纯度较高的目的蛋白.重组蛋白经MDCK-CDV检测系统证明具有生物学活性,为该干扰素的大量生产及临床应用奠定了基础.     

猪干扰素α的原核可溶性表达及抗PEDV活性

旨在利用原核表达系统高效表达具有抗病毒活性的可溶性重组猪干扰素α(soluble recombinant porcine interferon-α,srPoIFN-α)。通过PCR方法扩增姜曲海猪IFNα基因成熟肽序列,将其分别克隆至原核表达载体pCold-Ⅱ、pET22b、pET30a和pET30a-ELP中并在大肠杆菌中进行表达;通过Western blot结合Image J软件或BCA定量分析不同表达载体、密码子偏好优化、培养基类别、纯化方式等因素对猪干扰素α基因在大肠杆菌中可溶性表达的影响,鉴定提高srPoIFN-α表达的有利因素;利用VSV-GFP和PEDV检测srPoIFN-α的抗病毒活性。结果显示,原核表达载体pET30a、密码子优化、HB-PET自诱导培养基和磁珠纯化均能显著提高srPoIFN-α产量(P<0.001);srPoIFN-α有效抑制VSV-GFP复制的稀释倍数为2^-8.1,与重组人干扰素α2b标准品的比活为1.71×10⁸ IU/g,有效抑制PEDV复制的稀释倍数为2^-10.29,抗P...     

重组鸡α-干扰素的表达与抗病毒活性分析

为了表达具有抗病毒活性的重组鸡α-干扰素(IFN-α),试验根据大肠杆菌密码子的偏好性,对鸡IFN-α的成熟肽基因序列进行优化,合成后连接至原核表达载体pET30a-ELP,经体外诱导后表达重组蛋白ELP-ChIFN-α,借助重复可逆相变循环(ITC)法进行纯化;纯化蛋白经过变性、复性处理后进行安全性评价,采用微量细胞病变抑制法在犬肾细胞(MDCK)/水疱性口炎病毒(VSV)系统中进行蛋白抗病毒活性的检测。结果表明：合成的重组鸡IFN-α成熟肽基因能在原核表达系统中成功表达;不同浓度的重组蛋白ELP-ChIFN-α对细胞的生长抑制率为0;重组蛋白ELP-ChIFN-α在MDCK/VSV系统中具有抗病毒活性,活性为1.2×10⁶ IU/mg。说明原核表达的重组鸡IFN-α有较好的抗病毒活性,可作为鸡的抗病毒生物药物进一步开发研究。     

吉林白鹅α干扰素基因的原核表达及抗血清的制备

采用PCR方法扩增了吉林白鹅α干扰素（JL-GolFN—α）成熟肽编码序列,将IFN—α片段定向插入原核表达载体pGEX-6p-1中,构建重组质粒pGEX—IFN—α,将重组质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）的感受态细胞里,在IPTG诱导下表达可溶性的融合蛋白（GST—IFN—α）。SDS—PAGE、Western—blot检测结果表明,重组吉林白鹅IFN—α融合蛋白（rJL—GoIFN-α）的分子量大小约为43ku,表达量占菌体总蛋白的25％。重组吉林自鹅仅干扰素,经谷胱甘肽Sepbarose-4B亲和柱层析纯化后,经过透析复性,得到纯化的目的蛋白,含量可达0．25mg／mL。将复性蛋白免疫新西兰白兔3次,制备高滴度的鹅IFN—α抗血清。本实验表达和纯化了鹅的IFN—α,并制备了兔抗鹅的IFN—α抗血清,为下一阶段鹅α干扰素重组蛋白的应用奠定了基础。     

Poly(I:C)对PRRSV诱导的抗病毒免疫反应的影响

为了研究聚肌苷胞对猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)诱导的抗病毒免疫反应的影响,本研究采用200个TCID50的PRRSV感染猪肺巨噬细胞(porcine alveolar macrophage,PAM),吸附1h后用100μg/L的聚肌苷胞(poly(I:C))处理细胞,分别培养12、24、36、48h后收集细胞及上清,同时设PRRSV感染对照组、poly(I:C)刺激对照组和健康细胞对照组,用实验室已经建立的Real-time qPCR方法对poly(I:C)刺激PRRSV感染组和PRRSV感染对照组中PRRSV复制水平及各组PAM细胞中IFN-α、TNF-αmRNA转录水平变化进行定量分析。结果显示,PRRSV在感染PAM细胞后12~24h期间可促进PAM细胞IFN-αmRNA的转录,36~48h期间抑制PAM细胞IFN-αmRNA的转录;TNF-αmRNA转录水平在12、48h后略微升高,在24、36h后均略微下降。Poly(I:C)处理PAM细胞后IFN-α、TNF-αmRNA转录水平均上调。Poly(I:C)+PRRSV组IFN-αmRNA的转录水平与PRRSV组相比在12~36h均显著升高,在48h后则显著下调。Poly(I:C)+PRRSV组TNF-αmRNA转录水平与PRRSV组相比,12~36h后均升高,在12h升高较显著,48h后则显著下调。结果表明,PRRSV感染PAM细胞经Poly(I:C)刺激后IFN-α、TNF-αmRNA转录水平在12~36h后显著升高,从而抑制了PRRSV在PAM细胞内的复制。     

抗鹅α干扰素单克隆抗体的制备及初步鉴定

以含有鹅α干扰素(IFN-α)基因的真核表达载体pcDNA3.1-GOWN-α免疫BALB/c鼠,采用杂交瘤技术制备抗鹅α干扰素单克隆抗体(McAb),并对其部分生物学特性进行初步研究.实验获得2株抗鹅IFN-α的单克隆抗体.经鉴定,Ig亚类均为IgM,轻链为κ链;腹水效价均达到10-4以上;Western blot证实2株McAb均能与重组IFN-α发生反应,出现特异性条带;其中一株单抗能与鹅脾细胞诱导产生的天然干扰素反应;杂交瘤细胞株连续传20代以上及冻存后复苏,细胞生长良好,效价稳定.抗鹅IFN-α单克隆抗体的制备,为研究和检测IFN-α提供了一种重要的手段,并为其在免疫机制研究、免疫功能检测、纯化IFN-α等领域提供了广泛的应用价值.     

PRRSV感染对猪肺泡巨噬细胞IFITM3基因转录的影响

干扰素诱导跨膜蛋白3(interferon inducible transmembrane proteins 3,IFITM3)作为抗病毒蛋白可以抑制多种病毒的感染,本研究针对猪IFITM3基因设计特异性引物,构建重组质粒并作为阳性标准品,建立了检测IFITM3基因的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法最低检出下限为10~2 copies/μL,且线性关系好(R~2≥0.997),敏感性高,特异性强,重复性好,批内、批间变异系数均小于3%。将猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAM)细胞,在不同感染时间对细胞中IFITM3 mRNA进行检测。结果显示,PRRSV感染早期IFITM3转录水平保持不变,在感染后转录水平逐渐升高。IFITM3 mRNA在PRRSV感染PAM过程中转录变化,可能是PRRSV宿主免疫逃逸的机制之一。     

奶牛α-干扰素克隆表达和生物学活性分析

提取经植物血凝素诱导培养的我国健康奶牛外周血淋巴细胞总RNA,应用RT-PCR方法扩增出奶牛α-干扰素(BoIFN-α)成熟蛋白基因并将其克隆到pMD18-T载体上,测序结果表明,扩增片段为牛α-干扰素成熟蛋白序列,与GenBank上发表的干扰素序列同源性为100%。将其重组到原核表达载体pET32a(+)上,并在大肠杆菌BL21中实现了高效表达,表达产物以His-Tag融合蛋白的形式存在。用镍亲和层析法对蛋白进行纯化,并利用VSV-MDBK/IBRV细胞系统分析其生物活性。重组奶牛α-干扰素对VSV的抗病毒活性为4.26×105U/mL,对IBRV的抗病毒活性为8.91×104U/mL。结果表明,重组奶牛α-干扰素特异性好,而且抗病毒活性比较稳定。     

猪干扰素α-1基因的原核表达与多克隆抗体制备

[目的]利用大肠杆菌原核表达系统对猪干扰素α-1(Po IFNα-1)基因进行表达,制备Po IFNα-1重组蛋白多克隆抗体。[方法]根据Gen Bank发表的Po IFNα-1核苷酸序列,合成密码子优化的Po IFNα-1基因,构建Po IFNα-1基因的p ET-28a原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌后,利用IPTG进行诱导表达。表达的Po IFNα-1重组蛋白纯化后,免疫昆明系小鼠,制备多克隆抗体。采用Western blot技术检测Po IFNα-1重组蛋白的多克隆抗体与天然Po IFNα-1的反应性。[结果]合成的Po IFNα-1基因在大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中成功表达,针对Po IFNα-1重组蛋白的多克隆抗体能够识别天然的猪干扰素α-1。[结论]合成的Po IFNα-1基因在大肠杆菌中获得了成功表达,为后续研究奠定了基础。     

SHP1在PRRSV诱导的抗病毒免疫反应中的作用

为了探究SHP1在猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)诱导的抗病毒免疫中的作用,本研究采用200个TCID50的PRRSV感染猪肺巨噬细胞(porcine alveolar macrophage,PAM),分别培养12,24,36,48h后收集细胞及上清,分别设正常细胞对照组,聚肌胞(polyinosinic-polycytidylic acid,polyI:C)刺激对照组,脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激对照组。采用ELISA方法检测PRRSV感染的PAM培养上清中SHP1的蛋白表达情况。用实验室已经建立的实时荧光定量PCR方法对PRRSV感染组和各个对照组PAM细胞中IRF3、IRF7、TRAF6、NF-κB、SHP1和IFN-β的mRNA转录水平变化进行定量分析。结果显示:激活的SHP1对PRRSV感染后PAM中IRF7、NF-kB和IFN-β的转录有促进作用,对IRF3和TRAF6的转录有抑制作用。LPS及Poly(I:C)刺激PRRSV感染的PAM细胞均促进了IRF3、IRF7、TRAF6、NF-κB、SHP1和IFN-β的转录。结果表明,激活的SHP1会通过TLR介导的信号通路或未知通路来调节PRRSV诱导的抗病毒免疫反应水平。LPS和Poly(I:C)刺激PRRSV感染的PAM细胞能够增强抗病毒细胞因子的转录水平。     

猪α干扰素基因突变、表达及其高效抗病毒活性筛选研究

利用RT-PCR方法从猪肝细胞总RNA中扩增出编码猪α干扰素基因,根据大肠杆菌偏嗜性及活性位点改造基因并克隆至原核表达载体p ET21a,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白诱导表达和鉴定。重组蛋白以包涵体形式表达,经变-复性及纯化处理后,获得多种不同基因型的高纯度猪α干扰素。用细胞病变抑制法在MDBK/VSV系统上进行抗病毒活性测定,结果表明经过基因改造的猪α干扰素(Po IFN-M6)具有更高抗病毒活性,约为2.97×108U/mg。本研究为猪α干扰素基因工程产品的研发及其在临床兽医的应用奠定基础。     

鸡α干扰素的原核表达及纯化

根据大肠杆菌密码子的偏好性对Gen Bank中发表的鸡α干扰素基因序列进行了密码子优化,全基因合成了鸡α干扰素基因片段486 bp。构建原核表达质粒p ET-23b-Ch IFN-α。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,表达产物主要以包涵体形式存在,包涵体进行变性、复性和镍柱亲和纯化。表达产物经SDS-PAGE、WesternBlot分析表明,Ch IFN-α蛋白得到了高效表达,其蛋白分子质量约19 k D,经镍柱亲和纯化后获得了高纯度的重组鸡α干扰素蛋白,其含量为0.82 mg/m L。本研究为鸡α干扰素的生物学活性分析和临床产品研发奠定了基础。