sRNA伴侣蛋白Hfq敲除条件下沙门菌的转录组分析

为探明沙门菌(Salmonella)在sRNA伴侣蛋白Hfq敲除条件下转录组变化情况。本试验采用HiSeq测序平台对沙门菌LT2菌株及其Hfq敲除株进行高通量测序,通过DESeq2差异分析方法筛选敲除sRNA伴侣蛋白Hfq条件下的差异表达基因,对其进行生物信息学GO功能显著性富集分析和Pathway显著性富集分析。结果显示,对照组和试验组分别得到12 753 534条、8 254 308条Clean Reads。通过DESeq2差异分析获得差异基因1 055个,其中表达上调基因516个,表达下调基因539个。GO功能显著性富集分析表明显著差异表达基因主要富集在钴胺素代谢过程、钴胺素生物合成过程、碳水化合物代谢过程等生物过程中。Pathway显著性富集分析表明显著差异表达基因富集到细菌趋化性、丙酸代谢和碳代谢等11个信号通路中。结果表明,本试验应用RNA-seq技术丰富了sRNA伴侣蛋白Hfq调控基因数量,筛选出20个受伴侣蛋白Hfq调控的显著差异表达基因,其中4个基因功能及编码蛋白未知,注释了差异表达基因的生物学功能及信号通路,推断Hfq在细菌对数期主要通过影响营养提供和趋化性等途径,继而影响细菌的正常生理活动,为Hfq协同sRNA的调控机理研究及sRNA靶基因的筛选奠定了基础。     

沙门氏菌sRNA RybB及伴侣蛋白Hfq对孔蛋白OmpW表达的调控作用

为探究sRNA RybB和伴侣蛋白Hfq对沙门氏菌孔蛋白OmpW表达的调控作用,研究利用λred同源重组系统构建ompW基因lacZ融合菌株,再通过P22噬菌体转导技术构建颜色指示菌株中rybB和hfq相关基因的单缺失株、双缺失株,通过β-半乳糖苷酶活性试验和qPCR分析,确定sRNA RybB及伴侣蛋白Hfq对孔蛋白OmpW表达的调控作用。结果显示：成功构建了颜色指示菌株ΔompW∶∶LacZ和相对应的基因缺失菌株;与标准株LT2相比,ΔhfqY25A、ΔhfqK56A、Δhfq65、Δhfq87基因使ompW蛋白表达水平极显著下调（P<0.01）,具有正调控作用,而Δhfq72、Δhfq∶∶tet、ΔrybB、ΔrybBΔhfq∶∶tet基因使ompW蛋白表达水平极显著上调（P<0.01）,具有负调控作用;与标准株LT2相比,缺失hfq定点突变和rybB对ompW基因具有负调控作用。研究表明,沙门氏菌伴侣蛋白Hfq及RybB对孔蛋白ompW基因的蛋白表达水平和转录水平产生不同程度的影响,初步阐明了伴侣蛋白Hfq、sRNA RybB和靶基因三者的内在关系,为沙门氏菌减毒活...     

细胞溶素HlyE变体对禽致病性大肠杆菌致病力的影响

为了探究细胞溶素HlyE突变体(HlyE-V)对禽致病性大肠杆菌(APEC)致病力的影响,采用Red同源重组法构建了APEC菌株CBE59的HlyE-V基因缺失株CBE59ΔHlyE-V和回补株CBE59CΔHlyE-V,测定缺失株生长曲线、溶血活性、胞内存活曲线,并用细胞毒性试验和动物试验来评估HlyE-V对APEC致病力的影响。结果表明∶缺失HlyE-V基因对APEC的生长速率影响较小,野生株、缺失株和回补株均无溶血活性,证明HlyE-V不是孔道形成毒素,不能溶解哺乳动物的红细胞;HlyE-V缺失株致细胞毒性和对雏鸡的致病力显著降低,缺失株的半数致死量(LD₅₀)值为4.9×10⁶CFU/只,而野生株和回补株的LD₅₀分别为8.2×10⁵CFU/只、4.2×10⁵CFU/只;在HD11巨噬细胞内的存活能力显著下降,在野生株CBE59感染的HD11中有一半的细胞中含有6～8个细菌,且有56.7%的细胞中观察到超过6个细菌;而在观察缺失株CBE59ΔHlyE-V时,菌量超过6个...     

禽致病性大肠杆菌研究进展

禽大肠杆菌病是由不同血清型禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia.coli,APEC)引起的严重危害世界养禽业健康发展的重要细菌性传染病之一。作者对禽致病性大肠杆菌的最新亚群分类、病型、生境、毒力因子和致病机理作了综述,同时为有效防控禽大肠杆菌病的未来趋势进行了展望。     

禽致病性大肠杆菌实验感染模型研究进展

禽致病性大肠杆菌（avian pathogenic Escherichia coli,APEC）是导致不同日龄禽类局部和全身感染的重要病原菌,也是人肠外致病性大肠杆菌（extraintestinal pathogenic Escherichia coli,ExPEC）毒力基因的重要储存宿主或来源。为深入理解APEC的感染过程、致病机理、宿主免疫应答及遗传抵抗机制、评估药物和疫苗防治效果,研究者通过不同途径建立了多种评估APEC毒力的实验感染模型。根据所涉及的系统不同可分为呼吸系统、脉管系统、肌肉系统、皮肤系统、生殖系统、消化系统及鸡胚系统等。此外,尚有小鼠与大鼠感染试验及组织培养细胞和外植块感染试验等。作者重点介绍了不同APEC实验感染模型的建立、致病机制、宿主应答及应用。     

应用DNA芯片技术筛选禽致病性大肠杆菌和尿道致病性大肠杆菌的差异表达基因

为研究禽致病性大肠杆菌强毒株E058的毒力相关基因在鸡体内、体外表达情况以及E058和尿道致病性大肠杆菌HEC4在LB和尿液中培养的表达情况,本研究分别提取E058株在SPF鸡体内及E058株和HEC4株在LB和尿液中静置培养的总RNA,与构建的DNA芯片杂交,检测和分析RNA的差异表达情况。芯片的检测结果表明:E058株在鸡体内和LB中培养差异表达基因共有9个,上调基因为5个,分别为neuC、iutA、cvaC、aes-15和iucCD;下调基因为4个,分别为aes-8、gyrB、aec-30和mdh。另外,芯片检测结果也显示E058株和HEC4株在LB和尿液中静置培养,具有相似的基因表达情况。     

禽致病性大肠杆菌(APEC)感染对雏鸡脾脏miRNA表达谱的影响

基于miRNA测序技术研究感染禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)雏鸡脾脏microRNA(miRNA)的差异表达,为深入了解APEC的致病机制奠定理论基础。将14日龄罗曼鸡随机分为2组,分别腿部肌肉注射APEC分离株AE17和生理盐水后采集脾脏组织,制作病理切片并进行miRNA测序,用miRanda算法预测差异表达miRNA的靶基因,并进行GO和KEGG分析。切片结果显示,与对照组相比,AE17株感染组脾脏组织有病变。通过miRNA测序总共筛选了21个差异表达miRNA的靶基因,其中8个下调和13个上调;对预测靶基因进行GO分析发现其显著富集在细胞、细胞器、膜等功能上;KEGG分析显示其参与Toll样受体信号通路和MAPK信号通路等免疫系统过程。本研究在AE17株感染组脾脏病理切片中发现病理变化,并利用miRNA测序技术成功获取了APEC感染鸡脾脏的miRNA表达谱,发现雏鸡脾脏组织miRNA表达丰富且表达量各异,为探讨APEC致病机制提供新思路。     

大肠杆菌致病因子研究进展

禽致病性大肠杆菌和尿道致病性大肠杆菌是引起禽类和人肠道外感染的主要病原菌,这两种病原菌的毒力因子,致病机理及其相关性的研究现已成为热点。本文对近年来这些方面的研究进展进行概述。     

禽致病性大肠杆菌中耶尔森菌强毒力岛的分子流行病学调查

为了解耶尔森菌强毒力岛（HPI）在禽致病性大肠杆菌（APEC）中的流行情况，根据HPI结构基因irp2和fyuA参考序列设计了引物，用PCR方法和斑点杂交法对从江苏等地分离的APEC基因组进行了扩增和检测，并对E．coli NTJC040406菌株相关基因进行了克隆和序列分析。结果表明，216株APEC中有44．9％的菌株携带有HPI，序列分析表明相关基因与GenBank中参考序列的同源性高达98％以上。提示HPI在APEC中广泛存在，经进一步分析，发现分离菌株是否携带HPI与O78等特定血清型有一定的相关性。     

禽大肠杆菌毒力因子的研究进展

禽致病性大肠杆菌是毒力基因的贮存宿主,多种毒力因子的协同作用使其产生致病性,而耐药性的产生加大了对其防治的难度。本文主要对禽大肠杆菌毒力因子的种类、毒力特性及分子流行病学等研究进展进行了概述,为深入研究禽大肠杆菌病的致病机理和制定防控措施提供理论依据。     

1株禽源致病性大肠杆菌分离鉴定与相关特性的初步研究

无菌采取病鸭肝脏,进行病原菌的分离、鉴定、生化试验、毒力基因检测和动物毒力试验。结果:致病菌为大肠杆菌,至少携带有5种毒力基因,并且该菌对小白鼠和鸡有较强的致死性,属于大肠杆菌强毒株,与基因检测的结果相吻合。     

双组分系统CpxR影响禽致病性大肠杆菌的耐药性、抗血清杀菌能力及毒力

CpxR是细菌中Cpx双组分系统（two component system,TCS）的反应调控蛋白,通过调控靶基因的转录表达,在细菌细胞膜稳定及毒力方面发挥作用。本研究旨在探究TCS CpxR对禽致病性大肠杆菌（avian pathogenic Escherichia coli,APEC）基本生物学特性、抗血清杀菌能力及致病性的影响。利用Red同源重组系统及互补质粒构建cpxR基因缺失株、互补株,然后比较分析野生株、基因缺失株与互补株的生长曲线、运动性、生物被膜形成能力、药物敏感性、抗血清杀菌能力、动物致病性的差异。结果显示：cpxR基因缺失株与野生株、互补株的生长速度和运动性能无明显差异,且缺失cpxR基因不影响APEC的生物被膜形成能力。然而,缺失CpxR导致APEC对阿米卡星和卡那霉素耐药性降低。血清杀菌试验结果显示,CpxR有助于APEC的抗血清杀菌能力。动物感染试验结果显示,野生株、cpxR基因缺失株和互补株对雏鸭的半数致死量（LD₅₀）分别为7.50×10⁵、7.50×10⁶、1.33×10⁶ CFU,表明CpxR缺失显著降低APEC的毒力。综上表明,TCS CpxR在APEC耐药性、抗血清杀菌能力及毒力方面发挥作用,为阐明APEC的环境适应性、生存能力及致病机制提供参考。     

禽致病性大肠杆菌tonB基因缺失株的构建及其生物学特性研究

为了研究摄铁蛋白TonB对于禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)铁摄取能力及致病性的影响,试验采用同源重组技术构建了APEC tonB基因缺失及回复株,通过测定在正常和贫铁环境下的生长曲线、铁摄取能力等研究tonB对APEC生物学特性的影响,并通过鸡攻毒模型评价了其与APEC毒力之间的关联性。结果显示：APEC TZ18ΔtonB缺失株在正常环境中的生长速度与野生株相比没有差异,但其在贫铁环境中的生长速度显著下降(P<0.05);TZ18ΔtonB缺失株菌体内摄入的铁含量明显低于野生株;TZ18ΔtonB缺失株感染1日龄雏鸡的半数致死量(104.236)高于野生株(10^3.328),显示其毒力下降了8.1倍(P<0.05);此外,TZ18ΔtonB缺失株在21日龄SPF鸡体内心血、肝脏和肺脏中的载菌量显著低于野生株感染水平(P<0.01),而tonB基因回复株的感染水平接近野生株。结果表明：tonB参与APEC铁摄取进程并影响其毒力。     

基于转录组测序筛选鼠伤寒沙门菌hfq基因缺失菌的差异表达基因

旨在鼠伤寒沙门菌hfq基因缺失株转录组测序中分析适应环境变化及细菌分泌通路,筛选相关基因。通过使用实时荧光定量PCR对鼠伤寒沙门菌hfq基因缺失株转录组测序结果进行验证,从而对鼠伤寒沙门菌hfq基因缺失株的细菌趋化性通路、细菌双组分通路、细菌分泌通路进行深入分析,筛选相关的重要调控基因。结果显示：在细菌趋化性通路中筛选出yiaD、STM3138、STM3216和malE等4个共表达基因;在细菌分泌通路中筛选出spaP、invA、prgH、invE、spaS、invG和ssaV等7个共表达基因;在细菌双组分通路中筛选出ybfM、htrA、pagO、STM3138、STM3031、ttrB、hilD、pstS、STM1530、hilA、pgtC、hydH、pocR、STM3216、ttrR和fljB等16个共表达基因。在鼠伤寒沙门菌hfq基因缺失株的趋化性通路、细菌双组分通路、细菌分泌通路中筛选出差异表达基因,hfq能够对这些基因进行调控,从而影响如运动性、毒力等相关作用,为沙门菌中的sRNA与hfq后续研究及沙门菌的防治奠定一定基础。     

gltS基因缺失对禽致病性大肠杆菌生物学特性的影响

为研究谷氨酸转运蛋白GltS编码基因对禽致病性大肠杆菌(APEC)生物学特性的影响,本研究利用λ-Red同源重组方法构建APEC CE129(WT)株gltS基因缺失株CE129ΔgltS(KO)和基因回补株CE129ΔgltS/gltS (RS),并均经PCR及测序鉴定,结果显示,gltS基因缺失株及回补株均正确构建。通过连续10 h测定各菌株OD600nm值绘制WT、KO、RS菌株的生长曲线,利用梅里埃自动生化鉴定系统测定3株菌的生化特性;利用K-B纸片法检测3株菌对8类16种药物的敏感性;利用半固体培养基检测3株菌的运动能力。结果显示,3株菌的生长特性、生化特性、药敏特性和运动能力均无明显差异。利用细菌平板计数法计算检测WT与KO菌株的体外竞争指数(CI),分析KO菌株是否致弱。利用结晶紫染色法测定3株菌的生物被膜(BF)的形成能力,并利用刚果红琼脂板及含荧光增白剂的琼脂板分别检测菌株BF中curli菌毛及纤维素的形成情况。结果显示,WT与KO菌株的体外CI为0.32,表明KO菌株轻度致弱。BF形成能力检测结果显示,相对于WT、RS菌株,KO菌株BF的形成能力极显著降低(P<...     

禽致病性大肠杆菌Hcp2b对雏鸡气管黏膜细胞因子-细胞因子受体相互作用通路的影响

T6SS(type Ⅵ secretion system)是革兰阴性菌中常见的一种分泌系统,其效应蛋白Hcp2b作用机制迄今仍未明晰.本研究以禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)Hcp2b蛋白为研究主体,旨在探究Hcp2b蛋白在APEC感染鸡气管黏膜过程中发挥...     

华东部分地区禽致病性大肠杆菌系统进化分群及毒力相关基因的检测

采用PCR方法,对华东地区分离的66株禽致病性大肠杆菌(APEC)进行系统进化分群和9个毒力相关基因的检测。APEC分离株在各系统进化群中均有一定比例的分布,其中A群为33.4%(22/66),B1群为31.8%(21/66),B2群为13.6%(9/66),D群为21.2%(14/66)。毒力基因分布检测结果表明:编码自分泌黏附素的aatA和aatB、侵袭素ibeA、空泡形成毒素基因vat、温度敏感性血凝素tsh、摄铁系统的ybtX、耶尔森毒力岛内的ireA、VI型分泌系统的clpV1和vgrG等基因的分布率分别为59.1%、13.6%,7.58%、37.9%、36.4%、25.8%、6.06%、21.2%和42.4%,其中aatA、tsh、vat、ybtX、ireA、clpV1 6个基因在各进化群中分布较为广泛,而个别基因如ibeA仅在B2群中检出,在其他进化群没用检出。本研究有助于进一步了解禽大肠杆菌病的分子流行病学特点,并为该病的防控提供了基础。     

江苏部分地区禽致病性大肠杆菌分离株的生物学特征及耐药性研究

为了解江苏部分地区禽致病性大肠杆菌(APEC)的分子流行状况,从临床分离鉴定出120株APEC,并对分离株的血清型、种系发生型、毒力基因型和耐药性进行检测.血清型检测结果显示,在已定型的95株分离株中,最常见的血清型为O78,约占定型菌株比例为27.4％,其他主要血清型还有O18、O24和O88等.APEC分离株种系发...     

禽致病性大肠杆菌未知功能基因突变株的构建及致病特性分析

采用抑制差减杂交技术(SSH)对禽致病性大肠杆菌(APEC)高致病株E037(血清型O78)与非致病菌株K-12 MG1655进行基因组差异片段克隆与分析。从E037株中共检出17个特异性差异片段,选取其中的编号为88#的基因进行突变株的构建。通过PCR扩增出88#的目的基因片段,并插入到T-easy载体的多克隆位点中,随之克隆到p MEG-375自杀性载体中,构建自杀性载体p MEG375-88#,将突变载体转化到受体APEC E037中,根据同源重组原理,筛选出E03788#基因插入突变株E037-1。对21日龄白来航SPF鸡右胸气囊分别接种E037、E037-1株0.1 mL(108cfu/mL),在6,24和48 h分别扑杀SPF鸡,无菌采集血液、心脏、肝、脾、左肺、肾进行细菌学检查,同时进行病变观察。结果显示:接种鸡6 h后,E037-1在肝、脾和肺中的细菌数比E037明显降低,差异极显著(P0.01);接种鸡24 h后,E037-1在心脏、肝、脾和肺中的细菌数与E037比较有所降低,差异显著(P0.05);接种鸡48 h后,E037-1在心、肝中的细菌数比E037明显降低,差异极显著(P0.01),说明E037-1突变株的致病性明显下降。结果显示88#基因可能是APEC的致病相关基因,其功能值得进一步研究。     

禽大肠杆菌内毒素对蛋鸡致病作用的病理学研究

将鸡源致病性大肠杆菌悬液反复冻融，提取粗制细菌内毒素，以静脉注射和腥腔注射途径接种于产蛋鸡，结果证明，鸡大肠杆菌内毒素可引起产蛋鸡急性死亡，病理变化以出血性坏死和弥散性血管内凝血为特征。