pEGFP-C1-ApoE真核表达载体的构建及在HEK-293T细胞中的表达

载脂蛋白E是决定血浆胆固醇水平的重要遗传因素之一,其作为多种脂蛋白的结构蛋白,在脂类的运输和代谢中起着非常重要的作用。本文以脂肪型小型猪从江香猪为研究对象,通过克隆从江香猪载脂蛋白E(ApoE)基因CDS区,构建携带有绿色荧光蛋白的p EGFP-C1-ApoE重组质粒,转染HEK-293T细胞,旨在研究ApoE基因表达产物在真核细胞中的表达情况。序列比对结果表明,从江香猪ApoE基因与Gen Bank上公布的野猪序列相比,有8处发生了碱基突变,其中7处发生在C和G之间,另一处103位T→C的碱基突变,导致丝氨酸(S)突变为稀有密码子脯氨酸(P),使ApoE基因稀有密码子由23个增加到24个;生物信息学分析发现,突变后从江香猪ApoE基因二级、三级结构,蛋白理化性质均发生了改变。信号肽预测软件发现,ApoE蛋白在1-18位氨基酸残基位具有信号肽。荧光共定位实验结果表明,ApoE蛋白在细胞中表达部位与软件预测结果一致,均在细胞质中表达。相关研究为进一步构建ApoE基因转基因动物模型奠定基础。     

PK-15细胞的TPL2基因敲除有利于口蹄疫病毒和塞内卡病毒复制

旨在构建TPL2（MAP3K8/COT）基因敲除PK-15细胞系PK-15-TPL2^-/-,评估该基因敲除前后对口蹄疫病毒（FMDV）和塞内卡病毒（SVA）复制的影响及产生影响的原因,为研究TPL2在病毒感染过程中的作用机制提供良好的生物材料,也为疫苗生产过程中进一步提升FMDV和SVA产量指明方向。筛选2条针对TPL2基因的单向导RNA（sg RNA）,合成sg RNA并将其插入到含有GFP标签的慢病毒表达载体,构建sg RNA/Cas9慢病毒表达质粒,包装慢病毒并感染PK-15细胞,通过流式细胞仪分选出已被转入sg RNA的单细胞。通过测序确认细胞系中TPL2的DNA序列,通过蛋白质印迹（Western blot）方法检测细胞系中TPL2表达情况。使用FMDV和SVA感染构建好的细胞系,利用IFA、RT-qPCR、Western blot和TCID₅₀评估FMDV和SVA在PK-15-TPL2^-/-细胞中的复制水平,在此基础上通过测定干扰素（IFN）和IFN刺激基因（ISG）的mRNA表达水平,研究了FMDV或SVA感染的PK-15-TPL2^-/-细胞中干扰素途径的激活状态。TPL2基因敲除PK-15细胞系中TPL2基因发生了碱基插入突变和碱基缺失突变,构建的细胞系中均未检测到TPL2蛋白质表达。测定并比较了FMDV和SVA感染的PK-15和PK-15-TPL2^-/-细胞中病毒含量,表明TPL2基因敲除显著促进了FMDV和SVA的复制。同时,RT-qPCR进一步表明与FMDV和SVA感染期间的PK-15细胞相比,PK-15-TPL2^-/-细胞中IFN-α、IFN-β、IFN-γ、ISG15、ISG54和ISG56的mRNA表达明显降低。综上所述,本研究成功构建了TPL2基因敲除的PK-15细胞系,与对照细胞相比,TPL2基因的敲除更利于FMDV和SVA的复制,这可能与IFN-α、IFN-β、IFN-γ、ISG15、ISG54和ISG56表达的抑制有关。本研究提示CRISPR/Cas9基因编辑技术可以作为在动物和疫苗开发过程中编辑细胞系以提高病毒产量的有效工具,本结果为进一步提升FMDV和SVA产量指明了方向,也为研究TPL2在病毒感染过程中的作用机制提供了良好的生物材料。     

稳定表达小鹅瘟病毒VP3基因的293T细胞系构建

为构建稳定表达鹅细小病毒(goose parvovirus, GPV)VP3基因的293T细胞系,利用PCR技术扩增GPV的VP3基因,构建真核表达质粒pcDNA3.1-GPV-VP3,再将其转染至293T细胞,并利用博来霉素(zeocine)进行药物压力筛选。结果表明,获得的293T细胞系能够高效表达VP3蛋白,这为小鹅瘟病毒VP3蛋白的生物学功能的深入研究以及鹅细小病毒抗体检测方法的建立提供良好的生物材料。     

猪TRIM56敲除细胞系的构建及在增殖PRRSV疫苗毒株中的应用

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建1株猪TRIM56基因敲除的PAM-KNU细胞系,并探究其在增殖猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)疫苗毒株中的应用。根据猪TRIM56基因组外显子区域设计合成2对特定的向导RNA引物,将引物磷酸化、退火并连接至Px459M和EZ-Guide-XH载体构建敲除质粒Px459M-sTRIM56-KO;将敲除质粒转染PAM-KNU细胞,经嘌呤霉素筛选、有限稀释法筛选获得单克隆细胞并扩大培养;通过RT-PCR、测序及Western blot筛选鉴定,最终获得了敲除细胞系sTRIM56-KO-PAM-KNU;将PRRSV R98疫苗株感染野生型细胞及敲除细胞系,利用real-time RT-PCR、半数组织培养感染量(TCID₅₀)以及Western blot检测PRRSV增殖情况。结果显示,TRIM56敲除细胞系构建成功,该敲除细胞系中sTRIM56基因编码区第929～2 120位1 192个碱基缺失,未检测到sTRIM56...     

PK-15细胞敲除TANK结合激酶1基因促进猪伪狂犬病病毒复制的研究

TANK结合激酶1(TBK1)是病毒感染时IRF3、IRF7磷酸化及Ⅰ型干扰素表达的关键酶,在抗病毒天然免疫应答和获得性免疫应答中发挥重要作用。为研究TBK1基因敲除对猪伪狂犬病病毒(PRV)复制的影响,首先利用CRISPR/Cas9技术构建猪TBK1基因稳定敲除PK-15细胞系,并利用CCK-8检测敲除TBK1对PK-15细胞活力的影响。然后利用流式细胞术检测PRV-GFP荧光强度,用RT-qPCR检测PRV-gB、PRV-gE、PRV-TK、IL-1β、IFN-β和ISG15的转录水平,用Westernblot检测PRV-gB和PRV-gE蛋白表达水平,以及通过滴度测定检测子代病毒的感染力,综合评价TBK1基因稳定敲除PK-15细胞对PRV病毒复制的影响。结果显示:T7E1检测结果显示TBK1基因外显子2区的3个sgRNA靶位点均切出了目的条带,选取编辑效率最高的TBK1-sgRNA1细胞系进行单克隆化培养,获取6株稳定敲除TBK1基因的单克隆细胞,随机选取4号细胞株进行CCK-8检测,结果显示敲除TBK1对PK-15细胞活力无影响。流式检测结果显示PRV-GFP感染阳性细胞占总PK-15细胞的56.89%,PRV-GFP感染阳性细胞占总PK-15-TBK1-/-细胞的77.95%,表明PK-15-TBK1-/-细胞可以促进PRV-GFP复制。RT-qPCR及WB检测显示该细胞系可以促进PRVmRNA转录和蛋白表达。滴度测定结果显示,PRV-QXX在PK-15细胞复制后TCID50为10^6.8TCID50·0.1mL^-1,而在PK-15-TBK1-/-细胞中复制后TCID50为10^8.5TCID50·0.1mL^-1。另外,RT-qPCR结果显示该细胞系可以抑制PRV感染引起的IL-1β、IFN-β和ISG15转录上调。以上结果表明TBK1基因敲除PK-15细胞系促进PRV复制,可能与IL-1β、IFN-β和ISG15转录水平抑制有关。     

利用CRISPR/Cpf1技术构建HEK293细胞DDX21基因稳定敲除株及功能鉴定

利用CRISPR/Cpf1基因编辑技术构建DDX21基因稳定敲除的细胞株,并检测其生物学功能。设计、构建靶向DDX21基因向导RNA表达载体,与Cpf1表达载体共转染HEK293细胞,通过流式筛选、基因测序、Western blot和细胞增殖能力检测鉴定细胞株;荧光定量PCR检测病毒感染后模式识别受体(TLR-3、TLR-7、MDA-5)、Ⅰ型干扰素、IL-6以及抗病毒蛋白OAS mRNA水平表达情况。结果显示:成功筛选到2株DDX21基因敲除的细胞株,蛋白免疫印迹显示DDX21蛋白不表达;与野生型(wild type,WT)相比敲除株形成细胞单层的时间明显延长(P<0.01);H9N2亚型禽流感病毒感染试验表明,模式识别受体TLR-3、MDA-5的mRNA表达水平上调,TLR-7表达水平无明显差异,IFN-α、IFN-β、IL-6及抗病毒蛋白OAS的mRNA表达水平下调,表明DDX21基因敲除阻断了DDX21-TRIF-MyD88信号通路;TCID_(50)测定结果显示,差异最高可达到WT的3.01倍,表明DDX21基因敲除后流感病毒复制增加。本研究利用CRISPR/Cpf1系统获得2株DDX21基因稳定敲除的HEK293细胞株,为深入研究DDX21基因功能、病毒感染的天然免疫应答和调控研究奠定理论基础。     

PK-15细胞的ISG15基因敲除促进PRV的复制

本试验旨在研究干扰素刺激基因15（interferon-stimulated gene 15,ISG15）敲除对猪伪狂犬病病毒（PRV）复制的影响。通过CRISPR/Cas9技术构建猪ISG15基因敲除猪肾上皮（PK-15）细胞系,利用CCK-8试剂盒检测PK-15敲除ISG15基因对细胞活力的影响,采用间接免疫荧光技术检测PK-15以及PK15-ISG15^-/-细胞感染PRV的增殖差异,通过RT-qPCR检测PRV-EP0、PRV-gE、PRV-VP16和IFN-β的转录水平,Western blot检测PRV-gE和ISG15的蛋白表达水平,以及通过病毒噬斑检测对子代病毒感染力的影响。结果表明,sgRNA1和sgRNA2均成功敲除ISG15基因;CCK-8试剂盒检测细胞活力结果表明,敲除ISG15基因对PK-15细胞活力无影响;间接免疫荧光检测结果表明,PRV感染后,PK15-ISG15^-/-细胞中的荧光强度明显高于PK-15细胞;RT-qPCR和Western blot结果表明,敲除ISG15可以促进PRV的转录和蛋白表达;病毒噬斑试验进一步显示,敲除ISG15可以促进PRV的复制。另外,RT-qPCR结果显示,敲除ISG15可以抑制PRV感染引起的IFN-β转录上调。本研究成功构建了PK15-ISG15^-/-细胞系,并通过PRV感染试验证实ISG15基因可以抑制PRV在PK-15细胞中的增殖,并推测这种抑制作用可能与IFN通路有关。     

MLKL基因敲除对猪伪狂犬病病毒复制的影响

【目的】构建混合谱系激酶结构域样(mixed lineage kinase domain-like, MLKL)基因敲除的PK-15细胞株(PK-15 MLKL-KO),研究敲除MLKL基因对猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)复制的影响。【方法】根据MLKL序列设计特异性编辑位点,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建MLKL-sgRNA编辑载体,转染至PK-15细胞,经嘌呤霉素药物筛选获得多克隆细胞系,通过有限稀释法获得PK-15 MLKL-KO单克隆细胞株。通过靶基因组PCR、测序和Western blotting验证MLKL基因在PK-15细胞上的敲除水平;采用Reed-Muench法检测病毒增殖水平;采用PI染色和荧光显微镜观察细胞坏死情况。【结果】试验成功构建MLKL-sgRNA载体,筛选出1株MLKL基因缺失647 bp的PK-15细胞株,Western blotting未检测到MLKL蛋白的表达。与PK-15细胞相比,PK-15 MLKL-KO细胞极显著或显著提高了PRV GD-WH(感染后36 h除外)和PRV Bartha-K61的病...     

脑心肌炎病毒BD2株VP1基因的原核表达及生物信息学分析

应用RT-PCR技术扩增脑心肌炎病毒(EMCV)BD2株VP1基因,将其克隆至原核表达载体pET-32a(+),利用在线分析软件对该基因所编码的蛋白序列进行生物信息学分析。将重组质粒pET-32a-VP1转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,在不同浓度的IPTG和不同温度条件下对目的蛋白进行诱导表达。结果显示,EMCV VP1基因全长831bp,编码277个氨基酸,VP1蛋白为酸性、亲水性蛋白质,蛋白空间结构以α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲为主。经SDS-PAGE分析可知,VP1蛋白在37℃,1.0mmol/L IPTG的诱导条件下以包涵体形式获得了高效表达,重组蛋白的相对分子质量约为49 300。Western blot结果表明其具有良好的反应原性。综上所述,EMCV VP1蛋白是一种抗原性较高的亲水性蛋白,在原核系统中能高效表达,该研究为进一步建立相应的抗体检测方法和DNA疫苗的研制提供理论基础。     

脑心肌炎病毒单克隆抗体的制备与鉴定

为了制备脑心肌炎病毒(EMCV)的单克隆抗体,并对其进行鉴定。应用杂交瘤细胞技术,将灭活EMCV免疫的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,HAT选择培养、间接ELISA法筛选和多次克隆化,筛选出稳定分泌抗猪EMCV的杂交瘤细胞株,并对其分泌的单克隆抗体进行了亚型、效价、特异性和细胞株染色体核型的分析。结果获得了1株能分泌抗EMCV单克隆抗体的细胞株,命名为EMCV Y1G9,其分泌的抗体亚型为Ig G2b类;腹水效价可达3.2×104;细胞株的染色体核型分析结果是染色体众数为92±2,单抗的特异性也较好。制备出了具有良好特异性和敏感性的抗EMCV的Mc Ab,为建立EMCV的特异性检测方法及该病的防制奠定了基础。     

脑心肌炎病毒VP3蛋白抑制I型干扰素信号通路促进病毒体外增殖的研究

天然免疫是抵抗病原微生物感染的第一道防线,为探究病毒蛋白在脑心肌炎病毒感染引起的天然免疫应答过程中的作用机制以及对病毒体外复制的影响,本研究应用分子生物学技术构建结构蛋白VP3的表达载体p CMV-Myc-VP3,转染HEK293细胞后,使其在细胞内过表达;感染病毒后,通过实时荧光定量PCR和TCID50分别检测病毒的基因组拷贝数和病毒滴度,以此验证VP3蛋白表达对EMCV体外增殖的影响;另通过荧光定量PCR检测VP3过表达对EMCV引起的IFN-β和信号通路相关因子m RNA转录水平的影响。结果表明,VP3蛋白可促进EMCV在HEK293细胞内的增殖,初步探索发现VP3蛋白可显著抑制IFN-β的表达。WesternBlot检测发现体外表达VP3后,MAVS蛋白的表达明显减少,但对MDA5表达无影响。试验数据初步表明,VP3蛋白可以通过抑制MAVS的表达拮抗I型IFN信号通路的活化,进而促进病毒增殖。     

脑心肌炎病毒灭活疫苗佐剂的筛选及其效力评价

采用ISA201、ISA15A、GEL、CP940和1313佐剂分别与脑心肌炎病毒(EMCV)灭活抗原混合,配制成5种疫苗,采用BALB/c小鼠进行免疫保护试验。结果显示,5种佐剂疫苗对小鼠无明显不良反应,均能够诱导机体产生抗EMCV特异性ELISA抗体、中和抗体和淋巴细胞增殖反应,其中ISA15A、ISA201和GEL佐剂组抗体水平和淋巴细胞增殖转化刺激指数都显著高于抗原对照组(P0.01),而且,ISA15A佐剂组免疫应答反应高于ISA201和GEL佐剂组(P0.05)。采用EMCV强毒攻击,ISA15A、ISA201和GEL佐剂组免疫保护率均达90%,表明用ISA15A、ISA201和GEL这3种佐剂配制的EMCV灭活疫苗具有较高的免疫疫保护效力,为该病灭活疫苗研制奠定基础。     

β-丙内酯对脑心肌炎病毒灭活效果的试验

通过研究β-丙内酯(BPL)对脑心肌炎病毒(EMCV)灭活效果以及优化灭活条件,为制备脑心肌炎诊断试剂和疫苗提供参考依据.用终浓度分别为1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000等的β-丙内酯灭活103 TCID50滴度猪脑心肌炎病毒,采用4℃灭活4 h、8h、12h后37℃C 2h,并将灭活后的病毒接种敏感细胞VREO上观察细胞病变(CPE)情况,选择未出现CPE的细胞孔盲传3代后,采用ELISA和PCR的方法观察灭活效果.结果显示:BPL浓度和反应时间与灭活效果存在明显的线性关系,但BPL浓度越高抗原性下降幅度越大,RT-PCR未有扩增,说明BPL可以用于EMCV的灭活,且根据试验结果优选灭活条件为BPL浓度为1∶2 000,4℃灭活8h为最佳.结论表明:BPL完全可以用来灭活EMCV,为今后开发灭活疫苗或诊断试剂的生物安全性提供了保证.     

从江香猪ApoA1基因的克隆及亚细胞定位研究

试验旨在克隆从江香猪载脂蛋白A1（apolipoprotein A1,ApoA1）基因,研究ApoA1基因在真核细胞中的亚细胞定位情况。通过提取从江香猪总RNA,采用RT-PCR、目的基因的连接、转化等方法构建携带有绿色荧光蛋白的pEGFP-C1-ApoA1重组质粒,并经菌落PCR、双酶切及测序鉴定正确后,转染HEK-293T细胞,36 h后观察荧光,分析ApoA1蛋白在真核细胞中的亚细胞定位情况。结果表明,从江香猪ApoA1基因与GenBank上公布的野猪序列相比,有6处发生了碱基突变,其中5处为有义突变,分别导致180位氨基酸由丙氨酸变为谷氨酸、185位氨基酸由组氨酸变为谷氨酰胺、186位氨基酸由缬氨酸变为亮氨酰胺、209位氨基酸由天冬氨酸变为甘氨酸;PSORT Ⅱ Prediction和荧光共定位试验结果均表明,ApoA1蛋白的表达主要集中在细胞外基质,约占总表达量的77.8%。本试验成功克隆了从江香猪ApoA1基因CDS区,且ApoA1蛋白的表达主要集中在细胞外基质中,为进一步构建ApoA1基因转基因动物模型、开展ApoA1基因与人类因肥胖引起的相关疾病关系的研究奠定基础。     

猪脑心肌炎病毒GXLC株VP1基因的克隆与序列分析

应用RT-PCR方法扩增猪脑心肌炎病毒GXLC株的VP1基因,扩增产物克隆入pMD18-T载体后进行测序,对获得的VP1基因序列进行分析。序列分析表明,GXLC株VP1基因长度为831 bp,编码277 aa,含有2个潜在的N-糖基化基序和9个抗原表位。同源性分析表明,GXLC株与国内外其他26个EMCV分离株VP1基因核苷酸序列的同源性在78.6%～99.6%之间、氨基酸序列的同源性在95.1%～99.3%之间。遗传进化分析表明,基于VP1基因序列绘制的系统进化树可以将所有EMCV分离株分成两个群,即Ⅰ群和Ⅱ群,Ⅰ群可再细分为Ⅰa亚群和Ⅰb亚群,其中猪源、鼠源EMCV在Ⅰ群和Ⅱ群中均有分布,人源EMCV则分布在Ⅱ群;GXLC株与其他中国分离株均属于Ⅰa亚群。     

柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶3在293T细胞中的表达研究

为构建柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶3（Eimeda tenella calcium-dependent protein kinases3,EtCDPK3）基因的重组质粒pCAGGS-EtCDPK3,并转染293T细胞进行表达,以柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA为模板,经PCR扩增其含完整开放阅读框的序列,将其克隆至pGEM．Teasy载体,构建pGEM—Teasy-EtCDPK3重组质粒,双酶切回收目的片段后与相应酶切的真核表达载体pCAGGS连接,构建真核重组表达质粒pCAGGS-EtCDPK3。该重组质粒经酶切和测序鉴定正确后转染293T细胞进行表达,分别用免疫印迹和间接免疫荧光鉴定EtCDPK3基因的表达情况。结果显示所构建的真核重组表达质粒pCAGGS—EtCDPK3经过双酶切鉴定,可见1条大小约为1302by的目的条带,测序结果与实验室已获得的EtCDPK3序列完全一致;Western blot结果可见大小约为49kDa的目的蛋白条带,间接免疫荧光实验可以检测到红色荧光。这些研究结果表明已成功构建了EtCDPK3的真核重组表达质粒pCAGGS-EtCDPK3,并在真核细胞中获得表达,为深入研究EtCDPK3的功能和制备DNA疫苗奠定了基础。     

猪瘟病毒E2-GM-CSF融合蛋白在HEK293T细胞中的表达和免疫原性分析

【目的】 设计构建分泌表达E2-GM-CSF融合蛋白的HEK293T重组细胞, 并评估表达的E2-GM-CSF融合蛋白的免疫原性, 为猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)的防控提供新的候选亚单位疫苗。【方法】 利用PCR方法扩增E2-GM-CSF基因并克隆入慢病毒表达载体pCDH, 将得到的重组慢病毒质粒pCDH-E2-GM-CSF包装成E2-GM-CSF慢病毒颗粒, 转导HEK293T细胞, 经嘌呤霉素加压筛选获得分泌表达E2-GM-CSF融合蛋白的HEK293T重组细胞, 纯化表达的E2-GM-CSF融合蛋白经小鼠免疫试验验证其免疫原性。【结果】 pCDH-E2-GM-CSF质粒经酶切鉴定, 得到大小分别为8 172 bp的载体片段和1 521 bp的E2-GM-CSF基因片段, 表明E2-GM-CSF基因成功克隆入pCDH载体; 细胞基因组DNA PCR扩增结果为一条大小为1 686 bp的条带, 表明E2-GM-CSF基因成功整合至HEK293T细胞基因组; Western blotting分析获得约70 ku的条带, 证明E2-GM-CSF融合蛋白在HEK293T细胞中成功分泌表达; SDS-PAGE验证显示, 纯化后的E2-GM-CSF融合蛋白为单一条带, 纯度较高, 大小约70 ku; 小鼠免疫血清ELISA检测结果表明, 表达的E2-GM-CSF融合蛋白具有良好的免疫原性, 免疫后第14天在小鼠血清中检测到效价为1∶300的E2特异性抗体, 免疫后第21天E2特异性抗体效价达1∶900, 免疫后第28天小鼠血清中的E2特异性抗体效价最高达到1∶8 100, 远高于E2蛋白的1∶1 800。【结论】 利用慢病毒载体构建的表达E2-GM-CSF融合蛋白的HEK293T重组细胞可正确分泌表达具有免疫原性的E2-GM-CSF融合蛋白, 为CSFV的防控提供了新的候选亚单位疫苗, 同时其构建、开发与评估过程也可为其他亚单位疫苗在哺乳动物细胞中的快速表达提供借鉴。     

布鲁氏菌16M BtpA和BtpB真核表达载体的构建及在293T细胞中的表达

为了构建布鲁氏菌16M BtpA和BtpB真核表达载体,便于深入研究其在布鲁氏菌逃逸宿主免疫机制中发挥的作用.根据GenBank公布的布鲁氏菌16M BtpA和BtpB序列设计了特异性引物,并提取布鲁氏菌16M总RNA,将其逆转录成cDNA为模板,进行了PCR扩增,获得BtpA和BtpB目的片段,连接至pMD18-T进...     

猪脑心肌炎病毒GXLC株VP1基因的原核表达及鉴定

根据猪脑心肌炎病毒(EMCV)GXLC株的基因组序列设计一对特异性引物,应用RT-PCR方法扩增EMCV VPl基因目的片段,将其克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建了EMCV VPl基因重组表达质粒pET-32a-VP1.将pET-32a-VP1转化BL21(DE3)株感受态细胞,并用IPTG进行诱导表达.结...     

猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2融合基因在重组杆状病毒中的表达

将猪细小病毒分离株LJL12 VP2基因和猪瘟病毒多肽基因E290克隆至真核表达载体pMel Ba-cA,将该重组质粒与Bac-N-Blue DNA共转染昆虫细胞,并对表达产物进行分析,构建了表达猪瘟病毒T细胞表位和猪细小病毒VP2融合蛋白的重组杆状病毒。结果显示,获得了含VP2基因和E290基因的重组质粒pM-VP2-E290,昆虫细胞sf9的表达产物经SDS-PAGE、Western-blot检测后确定所表达的蛋白质分子质量大小约为67 ku,且具有天然蛋白的抗原特性。免疫电镜观察可见表达产物形成的病毒样颗粒。证实,成功构建了同时含有PPV VP2基因和CSFV特异性T细胞表位基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中得到了高效表达。