猪TRIM56敲除细胞系的构建及在增殖PRRSV疫苗毒株中的应用

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建1株猪TRIM56基因敲除的PAM-KNU细胞系，并探究其在增殖猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)疫苗毒株中的应用。根据猪TRIM56基因组外显子区域设计合成2对特定的向导RNA引物，将引物磷酸化、退火并连接至Px459M和EZ-Guide-XH载体构建敲除质粒Px459M-sTRIM56-KO;将敲除质粒转染PAM-KNU细胞，经嘌呤霉素筛选、有限稀释法筛选获得单克隆细胞并扩大培养；通过RT-PCR、测序及Western blot筛选鉴定，最终获得了敲除细胞系sTRIM56-KO-PAM-KNU;将PRRSV R98疫苗株感染野生型细胞及敲除细胞系，利用real-time RT-PCR、半数组织培养感染量(TCID₅₀)以及Western blot检测PRRSV增殖情况。结果显示，TRIM56敲除细胞系构建成功，该敲除细胞系中sTRIM56基因编码区第929～2 120位1 192个碱基缺失，未检测到sTRIM56...     

Sec62/Sec63复合物对乙型脑炎病毒在HEK-293细胞中复制影响的研究

Sec62/Sec63是位于内质网膜上的跨膜蛋白复合物,辅助新合成的前体蛋白或新生多肽链转运至内质网,进行后期的折叠加工。为研究Sec62/Sec63复合物对乙型脑炎病毒(JEV)复制的影响,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术分别构建SEC62、SEC63基因敲除的HEK-293细胞系,经测序鉴定以及western blot检测,获得两个基因敲除细胞系,分别命名为SEC62 KO HEK-293细胞和SEC63 KO HEK-293细胞。分别以MOI为1、0.05的JEV感染HEK-293、SEC62 KO HEK-293、SEC63 KO HEK-293细胞后,利用间接免疫荧光试验检测Sec62/Sec63复合物对JEV复制的影响。结果显示,不同剂量JEV感染SEC62 KO HEK-293细胞与SEC63 KO HEK-293细胞中荧光信号阳性细胞均少于HEK-293细胞对照组;以MOI为1的JEV感染HEK-293、SEC62 KO HEK-293、SEC63 KO HEK-293细胞后,经western blot检测,结果显示于感染后12 h、24 h和48 h,SEC62 KO HEK-293、SEC63 KO HEK-293细胞中均未检测出JEV E蛋白条带,而对照HEK-293细胞中JEV E蛋白的表达量逐渐增加。以MOI为1的JEV感染上述3种细胞后检测细胞培养液中病毒滴度,结果显示JEV感染12 h后SEC62 KO HEK-293、SEC63 KO HEK-293细胞与HEK-293细胞病毒滴度无差异(p0.05),而感染后24 h与48 h时,SEC62 KO HEK-293、SEC63 KO HEK-293细胞培养液中病毒滴度均显著低于HEK-293细胞对照组(p0.01)。以MOI为1、0.5、0.05的JEV感染上述3种细胞后检测48 h后细胞培养液中病毒滴度,结果显示SEC62 KO HEK-293、SEC63 KO HEK-293细胞培养液中病毒滴度均显著低于HEK-293细胞对照组(p0.001)。以上结果表明,SEC62、SEC63基因敲除后均抑制了JEV的复制,也表明Sec62、Sec63是影响JEV在细胞内复制的重要宿主因子。本研究为进一步探究Sec62、Sec63等宿主因子对JEV复制的影响机制提供了参考依据。     

牛病毒性腹泻病毒E0基因重组慢病毒载体构建和鉴定

为构建携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)E0基因的重组慢病毒质粒,并检测其在HEK-293T细胞中的表达,本研究通过合成BVDV E0基因序列(AJ133739.1),构建包含Ig K信号肽的p ZJ-CMV-e GFP-Ig K-E0重组质粒和不含信号肽的p ZJ-CMV-e GFP-E0重组质粒,将其采用PEI方法分别转染HEK-293T细胞包装慢病毒,并浓缩后测定滴度,收集转染后上清液进行western blot检测蛋白表达。通过酶切、PCR及测序鉴定表明E0基因正确整合至慢病毒载体中,western blot结果表明其能够在HEK-293T细胞中表达。本研究构建获得携带BVDV E0基因的重组慢病毒,为BVDV E0蛋白哺乳动物细胞中的表达及其免疫原性研究奠定基础。     

干扰素基因刺激因子基因敲除对猪伪狂犬病病毒复制的影响

研究干扰素基因刺激因子(STING)基因敲除对猪伪狂犬病病毒(PRV)复制的影响。用CRISPR/Cas9技术敲除猪肺巨噬细胞系(3D4/21)的STING基因,用T7核酸酶检测靶基因敲除效率,用细胞计数试剂盒检测基因敲除细胞的活力,用表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组病毒PRV-GFP感染基因敲除细胞,用流式细胞术检测感染细胞的荧光强度,用定量RT-PCR检测PRV的gB、TK基因表达及其感染细胞的IL-1β、IFN-β、ISG15基因转录,用Western blot检测PRV gE蛋白表达水平,用病毒滴定法测定子代病毒滴度。结果显示:设计的3个STING基因外显子2特异sgRNA均能切割3D4/21细胞的靶序列,其中sgRNA3的基因编辑效率最高;对sgRNA1介导STING基因敲除系进行克隆化,获得基因敲除细胞系3株,基因敲除对细胞活力无影响;亲本细胞培养的PRV-GFP感染阳性细胞占80.77%,STING基因敲除细胞培养的PRV-GFP感染阳性细胞占95.55%;STING基因敲除对PRV基因表达具有促进作用,亲本3D4/21细胞的病毒滴度为10~(6.2) TCID_(50)·0.1 mL~(-1),STING基因敲除细胞的病毒滴度为10~(8.3)TCID_(50)·0.1 mL~(-1),病毒感染细胞的IL-1β、IFN-β和ISG15转录下调明显。STING基因敲除能促进PRV在3D4/21细胞中复制,可能与感染细胞的IL-β、IFN-β和ISG15表达抑制有关。     

蓝舌病毒NS4基因真核表达对IFN-β信号通路基因mRNA表达的影响

通过构建蓝舌病毒(BTV)NS4基因真核表达载体pcDNA3.1-NS4-eGFP,转染HEK-293T细胞,利用Western blot及荧光显微镜分析NS4蛋白的表达与亚细胞定位特征;pcDNA3.1-NS4-eGFP转染的HEK-293T细胞添加20 HAU/mL仙台病毒(SeV)刺激后,qRT-PCR法分析NS4基因表达对SeV诱导的上游识别基因RIG-Ⅰ、MDA5、VISA、TBK1、IKKε、IRF3、TRAF3、TRAF6、IRF9、干扰素基因(IFN-α、IFN-β)以及干扰素刺激基因ISG15和USP18的mRNA表达水平的影响。在HEK-293T细胞内转染pcDNA3.1-NS4-eGFP质粒24 h后,分别添加20 HAU/mL SeV刺激24,48 h,qRT-PCR结果表明,细胞内表达NS4-EGFP后,RIG-Ⅰ、MDA5、TRAF6、IRF9、ISG15及IFN-β基因mRNA表达极显著下降,随着SeV诱导时间的延长,VISA、TBK1、IKKε、USP18基因mRNA表达差异呈不显著趋势。本研究成功构建BTV NS4基因真核表达载体pcDNA3.1-NS4-eGFP,NS4-EGFP融合蛋白在HEK-293T细胞中主要分布于细胞核周围及细胞核内。BTV NS4基因在HEK-293T细胞内的表达显著下调SeV诱导的IFN信号通路相关基因RIG-Ⅰ、MDA5、TRAF6、IRF9、ISG15和IFN-β的表达,为进一步探究NS4基因在BTV拮抗宿主细胞免疫应答中的机制奠定基础。     

冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)慢病毒过表达载体的构建及病毒包装与滴度测定

构建冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)过表达慢病毒载体,并对其进行病毒包装、鉴定与滴度测定,为进一步研究CIRP功能提供基础工具。本研究从4℃冷处理8 h的SD大鼠睾丸组织中获得CIRP的cDNA序列测序后,将其克隆入LV5质粒中,经双酶切及测序鉴定;利用脂质体将鉴定的阳性重组LV5-cirp表达载体与pGag/Pol、pRev、pVSV-G 3个质粒共转染到HEK-293T细胞,72 h收获上清,包装产生慢病毒。将所得病毒悬液梯度稀释后感染293T细胞,检测病毒滴度,以及采用Western blot方法验证基因表达情况。结果表明:经琼脂糖凝胶电泳鉴定、PCR鉴定、酶切及测序结果证明成功构建了LV5-cirp重组质粒,序列比对与设计序列符合率100%,并成功包装成慢病毒,病毒滴度为6.30×108TU/m L;将制备成功的CIRP慢病毒过表达载体感染293T细胞后,Western blot检测结果显示细胞中CIRP蛋白表达水平显著高于正常细胞以及慢病毒阴性对照组(P0.01)。本实验成功构建CIRP慢病毒过表达载体并完成了慢病毒包装及滴度的测定,为今后的研究提供了基础工具。     

新城疫病毒mRNA疫苗的构建及鉴定

信使RNA(messenger RNA,mRNA)的核酸疫苗是近年来兴起的一种新型疫苗技术。新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)的血凝素-神经氨酸酶(HN)是NDV的主要保护性抗原，可诱导机体产生中和抗体，是新城疫(Newcastle disease, ND)新型疫苗研发的重要靶点。本研究将NDV HN基因连接到含有T7启动子的载体中，并在其5′UTR和3′UTR分别引入人-β球蛋白的非编码区域以增强转录的mRNA稳定性，经质粒线性化、体外转录、cap加帽处理、mRNA纯化制备NDV HN-mRNA,将其转染至HEK-293T细胞中验证NDV HN-mRNA的表达效果，Western blot和免疫荧光试验结果表明构建mRNA候选疫苗可在HEK-293T细胞中高效表达抗原蛋白，为ND新型疫苗的研发提供新的思路。     

基于CRISPR/Cas9技术构建稳定敲除TRIF基因的RAW264.7细胞株及对IFN-β的影响

利用CRISPR/Cas9技术构建稳定敲除TRIF基因的RAW264.7细胞株。首先,制备Cas9表达慢病毒,感染RAW264.7细胞,通过Puromycin抗性进行初步筛选,PCR法进行鉴定。其次,设计3条特异性识别TRIF基因的sgRNA(sgTi1、sgTi2、sgTi3),将其转入稳定表达Cas9蛋白的RAW264.7细胞株,荧光显微镜观察转入效果,PCR和Western blot法验证基因敲除情况。最后,挑选基因敲除效果最佳细胞株,经TRIF激活剂诱导后,提取细胞总RNA,荧光定量PCR检测IFN-β表达水平。结果显示:感染后的RAW264.7-Cas9细胞Cas9基因扩增产物升高,说明成功获得稳定表达Cas9基因的RAW264.7细胞。含目的基因的慢病毒感染RAW264.7-Cas9细胞后,荧光显微镜下可明显观察到目的基因已成功导入;PCR结果显示,与对照组比较,分别导入sgTi1、sgTi2、sgTi3的3组RAW264.7细胞TRIF表达均受到抑制,Western blot进一步验证3组RAW264.7细胞TRIF蛋白表达均下降且sgTi1组下降最显著,说明TRIF基因敲除成功。经TRIF激活剂诱导,与RAW264.7-Cas9-NC细胞比较,敲除TRIF基因后RAW264.7细胞IFN-βmRNA水平受到明显抑制。结果表明:利用CRISPR/Cas9技术成功构建了稳定敲除TRIF基因的RAW264.7细胞株。     

单增李斯特菌感染并调控宿主丙酰辅酶A羧化酶α(PCCA)的研究

为探究单增李斯特菌感染与宿主丙酰辅酶A羧化酶α (PCCA)表达的相互影响机制，本研究将单增李斯特菌野生株(LM-EGD-e)以MOI 200感染He La细胞5 h后，利用q RT-PCR检测感染LM-EGD-e后HeLa细胞中Pcca基因的转录水平变化，结果显示LM-EGD-e感染HeLa细胞中Pcca基因的转录水平无明显变化(log2FC=-0.305)；采用相应试剂盒分别提取感染后的He La细胞蛋白和线粒体蛋白，采用western blot检测PCCA蛋白表达变化，结果显示，LM-EGD-e感染后的HeLa细胞中，以及线粒体中PCCA蛋白表达水平均无显著变化(P>0.05)。PCR扩增Pcca基因后构建p CMV-N-HA-PCCA重组质粒，并经PCR和测序鉴定正确后转染HeLa细胞中过表达PCCA蛋白后，利用q RT-PCR检测HeLa细胞中Pcca基因的转录水平，收集细胞总蛋白采用western blot检测PCCA蛋白表达水平，结果显示，与转染空载体的细胞相比，转染重组质粒的HeLa细胞中Pcca基因的转录水平上调(log2FC=8.454)，且细胞内PCCA蛋白...     

干扰素诱导跨膜蛋白3基因敲除Caco2细胞株的构建及其对水泡性口炎病毒复制的影响

通过CRISPR/Cas9系统，旨在构建干扰素诱导跨膜蛋白3(IFITM3)基因敲除的人结直肠腺癌细胞Caco2,并探究IFITM3基因敲除对水泡性口炎病毒(VSV)复制的影响。针对人IFITM3基因靶向设计sgRNA,合成后连接至pLentiv2载体中获得重组质粒，经测序后将正确连接sgRNA的重组质粒及辅助质粒psPAX2、pMD2.G共转染293T细胞进行慢病毒包装并感染Caco2细胞，然后进行嘌呤霉素加压筛选，利用有限稀释法获取IFITM3基因敲除单克隆细胞。利用DNA测序和Western blot对所获得单细胞克隆进行鉴定，鉴定正确的细胞命名为Caco2-△IFITM3。用表达绿色荧光蛋白的VSV(VSV-EGFP)感染Caco2-△IFITM3细胞，通过荧光显微镜观察IFITM3敲除对VSV复制的影响。基因组DNA测序结果表明，在IFITM3基因开放阅读框产生了碱基缺失，细胞中IFITM3蛋白表达消失，但细胞活性未受明显影响。病毒感染试验可观察到Caco2-△IFITM3细胞感染比例显著高于Caco2细胞，表明敲除IFITM3使其抗病毒功能减弱。本研究通过CRISPR/Ca...     

共表达猪流行性腹泻病毒S1与GM-CSF蛋白重组腺病毒的构建

为构建表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)S1与GM-CSF融合基因的重组腺病毒,通过FMDV的2A基因序列做为Linker将密码子优化的S1基因和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因连接。构建重组穿梭质粒pShuttle-GM-CSF 2A-S1(m),并将其电转化至含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的大肠埃希菌BJ5183感受态细胞中,通过同源重组制备重组腺病毒质粒pAd-GMCSF2A-S1(m)。重组腺病毒质粒经PacI线性化后转染HEK-293A细胞,获得重组腺病毒rAd-GMCSF2A-S1。间接免疫荧光和Western blot结果显示,S1和GMCSF蛋白在重组腺病毒感染的HEK-293A细胞中获得表达。该重组腺病毒的制备为PEDV重组活载体疫苗的研究奠定了基础。     

PK-15细胞的ISG15基因敲除促进PRV的复制

本试验旨在研究干扰素刺激基因15（interferon-stimulated gene 15,ISG15）敲除对猪伪狂犬病病毒（PRV）复制的影响。通过CRISPR/Cas9技术构建猪ISG15基因敲除猪肾上皮（PK-15）细胞系,利用CCK-8试剂盒检测PK-15敲除ISG15基因对细胞活力的影响,采用间接免疫荧光技术检测PK-15以及PK15-ISG15^-/-细胞感染PRV的增殖差异,通过RT-qPCR检测PRV-EP0、PRV-gE、PRV-VP16和IFN-β的转录水平,Western blot检测PRV-gE和ISG15的蛋白表达水平,以及通过病毒噬斑检测对子代病毒感染力的影响。结果表明,sgRNA1和sgRNA2均成功敲除ISG15基因;CCK-8试剂盒检测细胞活力结果表明,敲除ISG15基因对PK-15细胞活力无影响;间接免疫荧光检测结果表明,PRV感染后,PK15-ISG15^-/-细胞中的荧光强度明显高于PK-15细胞;RT-qPCR和Western blot结果表明,敲除ISG15可以促进PRV的转录和蛋白表达;病毒噬斑试验进一步显示,敲除ISG15可以促进PRV的复制。另外,RT-qPCR结果显示,敲除ISG15可以抑制PRV感染引起的IFN-β转录上调。本研究成功构建了PK15-ISG15^-/-细胞系,并通过PRV感染试验证实ISG15基因可以抑制PRV在PK-15细胞中的增殖,并推测这种抑制作用可能与IFN通路有关。     

家蚕核型多角体病毒orf61基因缺失对病毒复制和各时期基因转录的影响

orf61是杆状病毒晚期表达的核心基因之一。为了研究家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)orf61基因的功能,利用Red重组技术与Bac-to-Bac系统分别敲除和异位补回orf61基因,构建了orf61缺失型病毒orf61-ko-Bacmid以及补回型病毒orf61-reBacmid,然后分别转染家蚕培养细胞Bm N,调查orf61基因缺失对Bm NPV复制和不同时期基因转录的影响。检测orf61基因缺失型病毒转染Bm N细胞液上清中的病毒滴度为0,说明orf61基因缺失导致病毒不能形成有感染活性的芽生型病毒粒子(BV);荧光定量PCR分析orf61基因缺失会显著地降低病毒基因组的复制水平,进而导致病毒各个时期基因转录水平极显著下降(P0.01)。此外,通过体外EMSA试验和构建双荧光素酶报告基因系统,检测ORF61蛋白对多角体蛋白基因polh启动子的调控作用,结果显示该蛋白质是polh基因转录的负调节因子。研究结果有助于深入阐释Bm NPV orf61基因在病毒基因组复制中的作用以及对极晚期表达的多角体蛋白基因polh的转录调控作用。     

敲除RIG-I基因的PK-15细胞系的建立及RIG-I对猪圆环病毒2型感染的作用

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建敲除RIG-I基因的PK-15细胞,初步探究视黄酸诱导基因I(retinoic acid-inducible gene-I,RIG-I)对猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)感染的作用。本研究根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计了针对猪RIG-I基因的2条sg RNA,构建重组载体p UC19-RIG-I-sg RNA1和p UC19-RIG-I-sg RNA2,转染PK-15细胞,通过流式细胞仪分选单细胞、测序、Western blot检测RIG-I敲除情况。PCV2感染细胞后,通过荧光定量PCR分析RIG-I及其下游分子m RNA水平,IPMA方法及Taq Man定量PCR检测病毒增殖水平。结果显示,筛选出的1株RIG-I基因缺失37 bp的PK-15细胞,Western blot检测RIG-I蛋白不表达。PCV2感染正常PK-15细胞48 h和72 h后,RIG-I mRNA水平上调,表明PCV2可激活RIG-I。敲除RIG-I基因,可下调MAVS、STING、IRF3、IFN-β的m RNA水平,抑制PCV2在PK-15细胞中复制,初步表明RIG-I信号通路促进PCV2在PK-15细胞中复制。本研究为PCV2感染的天然免疫机制研究提供了良好的细胞模型。     

猪skMLCK基因RNAi慢病毒载体的构建及干扰效率测定

为了构建猪骨骼肌肌球蛋白轻链激酶(sk MLCK)基因有效短发夹RNA(shRNA)的慢病毒载体,筛选出最佳干扰效率的序列,采用RNAi技术,设计并合成3条siRNA干扰序列,插入到慢病毒穿梭质粒(h U6-CMV-puror-Ploy A)上,与慢病毒包装系统共转染293T细胞,收集病毒上清并进行病毒滴度的测定,将其转染小鼠C2C12细胞,分别用实时定量PCR和Western blot方法检测细胞中sk MLCK基因mRNA和蛋白的表达。结果显示:PCR扩增和测序分析结果显示靶向sk MLCK RNAi慢病毒载体构建成功;转染小鼠C2C12细胞后,sk MLCK基因mRNA和蛋白均受到不同程度抑制,实时定量PCR显示,抑制率分别为(29.2±4.43)%、(76.4±7.33)%、(20.0±1.8)%;Western blot显示,抑制率分别为(29.6±5)%、(42.4±1.6)%、(34.3±1.2)%。结论:成功构建猪sk MLCK基因有效shRNA的慢病毒载体,确定干扰载体-2(sk MLCKRNAi-2)具有最佳干扰效果,证实sk MLCK基因RNAi慢病毒载体能有效抑制目的基因mRNA和蛋白的表达,为进一步研究该基因与肌肉肉质性状的关系奠定了基础。     

细胞信号肽酶复合体亚基1与牛病毒性腹泻病毒复制的相关性分析

旨在探明信号肽酶复合体亚基1(signal peptidase complex subunit 1,SPCS1)影响牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)复制的作用。使用Benchling和CHOPCHOP等平台设计靶向SPCS1基因的sgRNA,克隆至慢病毒载体lentiCRISPR v2,连同包装质粒pSPAX2和pMD2.G转染至人胚肾细胞HEK-293T中,包装慢病毒并感染MDBK细胞,用嘌呤霉素筛选5代后获得敲低SPCS1蛋白后稳定表达的细胞,用Western blot检测SPCS1蛋白表达的情况;使用荧光定量PCR和免疫荧光分析检测BVDV感染SPCS1蛋白敲低细胞不同时间后5'非翻译区(untranslated region,UTR)mRNA的水平和双链RNA(double-stranded,dsRNA)积累,利用倒置显微镜观察BVDV致细胞病变(cytopathic effect,CPE)情况,根据Reed-Muench方法测定病毒滴度变化情况。结果：Western blot检测SPCS1蛋白表达量明显下降,成功构建SPCS1敲低(knockdown,KD)细胞;BVDV感染SPCS1 KD细胞后与对照Scramble相比,BVDV 5' UTR mRNA水平和dsRNA量均显著性降低(P < 0.01),CPE现象推迟并减弱,子代病毒滴度显著性下降(P < 0.01),最高降低95.8%。SPCS1敲低后显著性影响BVDV复制,为BVDV防控新技术的建立提供理论依据。     

PRV感染三叉神经节细胞对PI3K/Akt信号通路的影响及其调控凋亡

以小鼠三叉神经节(TG)原代细胞为基础,应用实时荧光定量PCR(q-PCR)、Western blot等方法检测伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)(MOI=1)感染TG细胞后不同时间点PI3K、Akt基因的转录水平和蛋白表达情况.PRV感染TG细胞后,利用PI3K特异性抑制剂LY294002处...     

HEBP1基因敲除对牛病毒性腹泻病毒在MDBK细胞中增殖的影响

为研究血红素结合蛋白1(HEBP1)对牛病毒性腹泻病毒(BVDV)复制的影响,应用CRISPR/Cas9技术建立HEBP1基因敲除的MDBK细胞系;用BVDV TC株感染HEBP1基因敲除的MDBK细胞,用免疫荧光染色检测BVDV双链RNA(dsRNA)水平,观察BVDV致细胞病变效应(CPE)情况,实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)检测BVDV 5′UTR mRNA水平,Reed-Muench测定病毒滴度变化。结果表明,成功构建HEBP1基因敲除的MDBK稳定细胞系,敲除效率为72.41%;敲除HEBP1基因显著性抑制BVDV 5′UTR mRNA和dsRNA积累,减弱BVDV感染靶细胞的CPE,降低BVDV滴度。说明敲除HEBP1基因显著性抑制BVDV的复制,为抗BVDV研究提供新的思路和药物靶点。     

脑心肌炎病毒VP3蛋白抑制I型干扰素信号通路促进病毒体外增殖的研究

天然免疫是抵抗病原微生物感染的第一道防线，为探究病毒蛋白在脑心肌炎病毒感染引起的天然免疫应答过程中的作用机制以及对病毒体外复制的影响，本研究应用分子生物学技术构建结构蛋白VP3的表达载体p CMV-Myc-VP3，转染HEK293细胞后，使其在细胞内过表达；感染病毒后，通过实时荧光定量PCR和TCID50分别检测病毒的基因组拷贝数和病毒滴度，以此验证VP3蛋白表达对EMCV体外增殖的影响；另通过荧光定量PCR检测VP3过表达对EMCV引起的IFN-β和信号通路相关因子m RNA转录水平的影响。结果表明，VP3蛋白可促进EMCV在HEK293细胞内的增殖，初步探索发现VP3蛋白可显著抑制IFN-β的表达。WesternBlot检测发现体外表达VP3后，MAVS蛋白的表达明显减少，但对MDA5表达无影响。试验数据初步表明，VP3蛋白可以通过抑制MAVS的表达拮抗I型IFN信号通路的活化，进而促进病毒增殖。     

利用CRISPR/Cpf1技术构建HEK293细胞DDX21基因稳定敲除株及功能鉴定

利用CRISPR/Cpf1基因编辑技术构建DDX21基因稳定敲除的细胞株,并检测其生物学功能。设计、构建靶向DDX21基因向导RNA表达载体,与Cpf1表达载体共转染HEK293细胞,通过流式筛选、基因测序、Western blot和细胞增殖能力检测鉴定细胞株;荧光定量PCR检测病毒感染后模式识别受体(TLR-3、TLR-7、MDA-5)、Ⅰ型干扰素、IL-6以及抗病毒蛋白OAS mRNA水平表达情况。结果显示:成功筛选到2株DDX21基因敲除的细胞株,蛋白免疫印迹显示DDX21蛋白不表达;与野生型(wild type,WT)相比敲除株形成细胞单层的时间明显延长(P<0.01);H9N2亚型禽流感病毒感染试验表明,模式识别受体TLR-3、MDA-5的mRNA表达水平上调,TLR-7表达水平无明显差异,IFN-α、IFN-β、IL-6及抗病毒蛋白OAS的mRNA表达水平下调,表明DDX21基因敲除阻断了DDX21-TRIF-MyD88信号通路;TCID_(50)测定结果显示,差异最高可达到WT的3.01倍,表明DDX21基因敲除后流感病毒复制增加。本研究利用CRISPR/Cpf1系统获得2株DDX21基因稳定敲除的HEK293细胞株,为深入研究DDX21基因功能、病毒感染的天然免疫应答和调控研究奠定理论基础。