双峰驼FCGRT基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为制备抗双峰驼FcRn的抗体,首先从NCBI收录的双峰驼FCGRT基因序列中选取编码区,经跨膜结构和信号肽预测分析,截取不含信号肽的膜外序列并构建重组质粒pET-28a-FcRn,然后在大肠埃希氏菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达及表达条件优化,用纯化后的FcRn重组蛋白免疫家兔,制备抗双峰驼FcRn的多克隆抗体...     

双峰驼Cyp-A的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】制备双峰驼亲环素A(cyclophylin A,Cyp-A)的多克隆抗体,为揭示双峰驼体内的黏膜免疫反应机理提供依据。【方法】从GenBank数据库中双峰驼Cyp-A基因序列(登录号：XM＿010969543.1)上选取编码区,截取不含信号肽的膜外序列进行碱基优化后,与pET-28a(+)载体连接构建重组质粒pET-28a-Cyp-A。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导表达并对表达条件进行优化,优化诱导条件后通过SDS-PAGE鉴定重组蛋白的表达情况。纯化重组蛋白并免疫家兔,制备兔抗双峰驼Cyp-A多克隆抗体,分别使用ELISA和Western blotting检测抗体效价及特异性,并采用HE和SABC免疫组化染色法对Cyp-A多克隆抗体进行定位观察。【结果】重组质粒pET-28a-Cyp-A主要以包涵体形式表达,Cyp-A蛋白约为17 ku,最佳诱导条件为0.7 mmol/L IPTG诱导8 h,杂蛋白最佳洗脱液为5 mmol/L咪唑。经ELISA和Western blotting检测,兔抗双峰驼Cyp-A多克隆抗体的效价为1∶64 000,能...     

双峰驼TLR3蛋白的表达与抗体制备及在肾脏的分布

为制备双峰驼Toll样受体3(TLR3)的抗体,分析其在肾脏中的表达特征。用生物信息学分析及原核表达方式,分析、表达和纯化了双峰驼TLR3重组蛋白,并制备多克隆抗体,用间接酶联免疫吸附试验和免疫印迹法测定抗体效价及其特异性,利用制备的多克隆抗体采用免疫组织化学染色观察TLR3在双峰驼肾脏组织中的表达。结果显示,得到的目的蛋白大小与预测结果相符,为74 ku, IPTG最佳诱导浓度为0.2 mmol/L,最佳诱导时间为6 h,重组蛋白主要以包涵体形式表达,抗体效价达1∶64 000;免疫印迹结果显示,原核表达的TLR3蛋白和双峰驼肾脏组织中表达的TLR3蛋白均能被该抗体特异性识别,TLR3在双峰驼肾小管上皮细胞和肾小球系膜细胞均有表达。研究结果为进一步探究双峰驼TLR3在肾脏中发挥作用的机制积累了资料。     

双峰驼TLR2多克隆抗体的制备及其在免疫组化检测中的应用

为了制备兔抗双峰驼Toll样受体2(TLR2)的多克隆抗体并鉴定其活性,试验选择双峰驼TLR2基因序列,选取编码区,经软件分析预测该区域编码蛋白的主要氨基酸抗原位,选择对应的核苷酸序列进行基因合成,构建双峰驼TLR2重组质粒(pET28a-TLR2);通过原核表达系统诱导pET28a-TLR2表达,并优化异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)表达条件;表达的蛋白溶解变性后,与Ni-NTA镍柱填料结合,经亲和层析法纯化,用纯化后的蛋白免疫新西兰白兔并制备多克隆抗体;利用SDS-PAGE鉴定蛋白表达和纯化情况,间接ELISA试验、Western blot检测及免疫组化验证并评价多克隆抗体的效价与反应性。结果表明：成功表达双峰驼TLR2重组蛋白,大小约为64 kDa,最佳诱导表达条件：IPTG浓度为0.4 mol/L、诱导时间为5 h,蛋白质以包涵体的形式表达;抗体效价为1∶256 000,能特异性识别目的蛋白;在双峰驼十二指肠肠系膜淋巴结和脾脏中,抗体能特异性识别双峰驼TLR2阳性细胞,细胞类型以单核/巨噬细胞为主,具有良好的特异反应性。说明成功制备的兔抗双峰驼TLR2多克隆抗体具有良好...     

猪生长激素基因的原核表达及其抗体制备

通过构建pGH基因的原核表达质粒，转化大肠埃希氏菌TOP10，经IPTG诱导，成功表达了重组猪生长激素的融合蛋白。经SDSPAGE分析，在分子质量50．4ku处有1条新的特异蛋白质条带。对以包涵体形式表达的融合蛋白进行SDSPAGE分离，并经透析得到了重组融合蛋白，以此融合蛋白免疫家兔，制备并纯化了抗pGH多克隆抗体，经酶联免疫吸附测定、蛋白质印迹分析和免疫组织化学方法检测，此抗体具有较高效价和特异性。成功地表达了pGH基因并获得了多克隆抗体。     

猪干扰素α-1基因的原核表达与多克隆抗体制备

[目的]利用大肠杆菌原核表达系统对猪干扰素α-1(Po IFNα-1)基因进行表达,制备Po IFNα-1重组蛋白多克隆抗体。[方法]根据Gen Bank发表的Po IFNα-1核苷酸序列,合成密码子优化的Po IFNα-1基因,构建Po IFNα-1基因的p ET-28a原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌后,利用IPTG进行诱导表达。表达的Po IFNα-1重组蛋白纯化后,免疫昆明系小鼠,制备多克隆抗体。采用Western blot技术检测Po IFNα-1重组蛋白的多克隆抗体与天然Po IFNα-1的反应性。[结果]合成的Po IFNα-1基因在大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中成功表达,针对Po IFNα-1重组蛋白的多克隆抗体能够识别天然的猪干扰素α-1。[结论]合成的Po IFNα-1基因在大肠杆菌中获得了成功表达,为后续研究奠定了基础。     

烟碱酰胺合成酶基因的原核表达及多克隆抗体制备

以重组克隆质粒p0390-MF-NASHOR1为模板,通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增出烟碱酰胺合成酶基因(nas)片段并将其克隆到原核表达载体pGEM-KG中,获得重组表达质粒pKG-NAS。将此重组表达载体质粒转化到大肠杆菌DH5α中,经异丙基-β-D硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达。聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-poly acrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)结果显示,烟碱酰胺合成酶基因在大肠杆菌中成功表达,表达的烟碱酰胺合成酶融合蛋白分子量大约为61 kDa。将初步的纯化产物作为免疫原去免疫新西兰大白兔制备兔抗烟碱酰胺合成酶血清,用蛋白免疫印迹法(western blot-ting)对制备的兔抗血清中的多克隆抗体进行了鉴定,显示该抗体具有较好的特异性。烟碱酰胺合成酶基因多克隆抗体的成功制备为检测该基因在草坪草中的表达提供了可靠的手段和技术平台,为进一步阐明该基因的作用机理奠定了基础。     

蛋鸡TRPV6基因的原核表达、纯化及抗体制备

为制备蛋鸡TRPV6蛋白多克隆抗体,根据其基因序列,设计1对特异性引物,以卵巢组织中提取的总RNA为模板,扩增蛋鸡TRPV6基因1 801～2 176nt的375bp序列,构建原核表达质粒pET-32a（＋）-TRPV6;将重组质粒转化BL21（DE3）,经IPTG诱导表达TRPV6融合蛋白,通过镍离子螯合柱纯化后免疫新西兰大白兔,获得兔抗鸡TRPV6多克隆抗体,分别通过酶联免疫吸附试验（ELISA）法和Western blot检测抗体的效价和抗体特异性。结果表明,试验成功构建原核表达载体pET-32a（＋）-TRPV6,SDS-PAGE蛋白电泳检测发现目的蛋白大小约35 000;Western blot分析显示,表达的TRPV6融合蛋白具有良好的免疫原性,其抗体可与大肠杆菌表达的产物特异性结合;ELISA显示其抗体效价达1∶100 000。获得纯化的融合蛋白和多克隆抗体对研究TRPV6钙离子通道在蛋鸡髓质骨形成的作用机理具有重要作用。     

马立克氏病病毒L-meq基因的原核表达及多克隆抗体的制备

从潜伏期感染马立克氏病病毒的鸡淋巴组织中提取基因组DNA,采用梯度PCR的方法获得了马立克氏病病毒的L-meq基因,与NCBI数据库已发表的序列(AB091109)相比,同源性达99%。将L-meq基因片段定向克隆到原核高效表达载体pET-28a中,构建pET-28a-L-meq重组质粒。将重组质粒转化受体菌Rosetta中,以IPTG对其进行诱导表达,SDS-PAGE电泳分析,结果表明L-meq基因在E.coli Rosetta中得到了正确表达,薄层扫描分析表明,表达蛋白占细菌总蛋白的18.8%,将表达蛋白进行初步的纯化,制备了L-MEQ蛋白的多克隆抗体。用ELISA方法对多克隆抗血清进行鉴定,结果表明其纯化的重组的L-MEQ蛋白具有良好反应原性和特异性。     

牛白细胞介素2基因原核表达及多克隆抗体制备

根据GenBank发表的牛白细胞介素2(BoIL-2)基因序列,设计1对特异性引物,应用RT-PCR技术扩增出重组牛白细胞介素2(rBoIL-2)基因。将克隆片段与pMD18-T载体连接,并经过酶切及PCR鉴定,测序结果显示,克隆的BoIL-2基因与GenBank发表的BoIL-2基因序列同源性为98.7%。将测序正确的克隆片段与pET30a(+)载体连接,构建重组表达质粒pET30a(+)-rBoIL-2,通过双酶切及PCR鉴定阳性的重组质粒进行序列测定后在大肠杆菌的表达,分子质量约为23.49 ku;表达产物主要分布在包涵体中。Western blotting证实所得到的重组蛋白为BoIL-2重组蛋白。用镍离子亲和树脂对所得的BoIL-2重组蛋白进行纯化,并免疫新西兰兔成功制备兔抗rBoIL-2多克隆抗体,为下阶段的研究提供了重要的试验材料。     

鸭凝血因子Ⅷ的原核表达及多克隆抗体制备

为制备鸭凝血因子Ⅷ的多克隆抗体,试验根据抗原决定簇预测软件对鸭Ⅷ因子全基因序列进行分析,发现Ⅷ因子主要抗原决定簇位于C端,对鸭ⅧC端(Ⅷ-C)进行密码子优化、原核表达;免疫小鼠制备多抗,并利用ELISA测定效价.结果显示,优化后的Ⅷ-C能在Escherichia coli表达;Ⅷ-C在Escherichia coli ...     

猪MAVS基因原核表达载体的构建及其多克隆抗体的制备

通过RT-PCR从PK-15细胞系中扩增克隆MAVS(mitochondrial antiviral signaling protein)基因,构建原核表达载体p ET-MAVS220,转化感受态细胞Rosetta(DE3),利用IPTG诱导表达,重组MAVS经纯化后免疫4周龄昆明系小鼠制备抗线粒体抗病病毒信号蛋白(MAVS)多克隆抗体。诱导表达的最佳条件为IPTG 0.05 mmol/L,37℃诱导6 h,重组MAVS以可溶性蛋白和包涵体两种形式表达。应用该重组蛋白免疫小鼠获得的抗MAVS多克隆抗体与纯化的重组MAVS蛋白反应效价可达1∶16 000;该抗体与Poly(I∶C)刺激PK-15细胞产生的MAVS及与转染了重组MAVS基因真核表达载体pcDNA3.0-MAVS的BHK-21细胞表达的MAVS蛋白发生特异性反应,效价可达1∶1 000,特异性良好。     

伪狂犬病毒SL株gL基因的克隆、原核表达、抗体制备及亚细胞定位

通过PCR从伪狂犬病毒(PRV)SL株基因组中扩增出gL基因,将产物亚克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,测序验证后将重组质粒转化至E.coli Rosseta,进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE检测显示诱导表达蛋白约33 000,同预期大小相符,通过Western blot检测可知重组蛋白具有较好的抗原性。使用Ni 2+-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒纯化重组蛋白,纯化后的重组蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,经琼脂扩散试验测定,效价达1∶8。通过免疫荧光技术进行PRV gL亚细胞定位检测,结果显示最早可在感染后4h的细胞质中检测到特异性荧光,并随着PRV的复制gL表达增加。试验结果为进一步研究gL基因的功能和PRV的致病机理提供了重要依据。     

猪丁型冠状病毒N基因原核表达及多克隆抗体制备

旨在研究猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)N蛋白的抗原性,为下一步诊断试剂盒的研发提供依据。试验通过RT-PCR的方法扩增PDCoV CH/GX/1468B/2017株完整的N基因并构建原核表达质粒pET32a-N,将pET32a-N转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中,经诱导表达获得重组N蛋白,纯化后经Western blot方法检测其反应原性,免疫昆明小鼠制备重组N蛋白多克隆抗体并进行效价测定(间接ELISA法)和特异性验证(间接免疫荧光法)。结果显示：重组N蛋白在IPTG终浓度为1.0 mmol/L,37℃诱导表达6 h的条件下可获得最高表达量,该重组蛋白主要以可溶性蛋白的形式表达;Western blot结果显示,纯化后的重组N蛋白可以和PDCoV阳性猪血清发生特异性结合,具有良好的反应原性。制备的多克隆抗体的效价可达1∶64 000,间接免疫荧光法结果表明其能特异性识别和结合PDCoV,说明重组N蛋白具有较好免疫原性。提示：PDCoV N蛋白抗原性好,可作为诊断试剂盒的候选抗原。     

牦牛EPF的原核表达及多克隆抗体制备

本试验旨在制备牦牛早孕因子(early pregnancy factor,EPF)多克隆抗体,为牦牛妊娠早期高效快速诊断技术研究奠定基础.采用RT-PCR方法,从牦牛胎盘和卵巢组织中提取RNA,反转录为模板后进行EPF基因扩增,并将其克隆到改造后的载体pET28-His10-Sumo上,构建pET28-His10-Su...     

山羊IFN-γ基因的克隆表达与多克隆抗体制备

为获得山羊IFN-γ重组蛋白,提取山羊外周血淋巴细胞总 RNA,反转录得到 cDNA,以此为模板经PCR扩增获得IFN-γ的ORF区,构建重组克隆载体。经PCR扩增得到编码山羊IFN-γ成熟肽的基因序列,连入重组表达载体 pET-32a,转入 BL21（Codon Plus）感受态细胞中,测序并分析。重组表达载体经IPTG诱导后,对产物进行SDS-PAGE分析,并过镍柱纯化。用获得的纯化蛋白免疫家兔制备抗体。结果显示,编码山羊IFN-γ成熟肽部分的片段长432 bp;SDS-PAGE分析显示,融合蛋白大小约为34．9 ku,在30℃条件下,以0．3 mmol／L的IPTG诱导6 h,可得到大量可溶性表达的目的蛋白;间接 ELISA测定制得的多克隆抗体效价为1∶106。     

牛整合素α4亚基片段的原核表达及抗体制备

参照GenBank中牛整合素α4基因序列,合成了牛整合素α4亚基753bp（192～944nt）的cDNA片段,克隆至原核表达载体pET-28a（＋）中,转化入BL21,IPTG诱导表达。表达产物经Western blot鉴定,结果表明成功表达了相对分子质量约为30 000的α4蛋白。超声破碎细菌后,目的蛋白主要以包涵体形式存在。蛋白纯化后进一步复性,免疫大鼠获得多抗,间接ELISA检测多克隆抗体效价为1∶32 000。这为进一步研究牛整合素α4β7的功能奠定了基础。     

牛IFN-γ基因的原核表达及其产物卵黄抗体的制备

γ-干扰素(IFN-γ)主要是由活化的T细胞和NK细胞产生,具有广谱抗病毒、抑制细胞增殖和免疫调节等多种生物学活性的细胞因子,它对动物机体的免疫应答、疾病的发生发展具有十分重要的作用.     

猪Viperin主要抗原区的原核表达及多克隆抗体的制备

采用PCR方法扩增猪Viperin蛋白主要抗原区基因,克隆入原核表达载体p ET32a,转化大肠杆菌BL21构建重组表达菌,经IPTG诱导表达重组蛋白,SDS-PAGE鉴定蛋白得到表达,分子质量约为40 ku。进一步优化蛋白表达条件为:IPTG终浓度为0.6 mmol/L,诱导5 h。采用His标签单抗对重组蛋白进行Western blot鉴定表明蛋白具有良好的抗原性。将蛋白质纯化后免疫新西兰大白兔,间隔14 d免疫4次,并采集血清。用间接ELISA方法测定血清抗体效价,结果表明,经过4次免疫血清抗体效价达到1∶409600,间接免疫荧光检测出现特异荧光,表明其能与Viperin蛋白发生反应。本试验为研究Viperin的功能、建立特异的检测方法奠定了基础。     

猪CCL2的原核表达及其多克隆抗体的制备

CCL2作为一种典型的促炎因子,在病毒感染、各类肿瘤、自身免疫疾病等许多病症的发生、发展中都有着举足轻重的意义,然而猪的CCL2研究鲜有报道。本研究使用PCR方式扩增CCL2基因,将其克隆于大肠杆菌原核表达系统的pET-28a(+)表达载体中,成功构建重组表达质粒pET-28a(+)-CCL2,转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,再经0.1mmol/L的IPTG诱导表达,SDS-PAGE结果表明猪CCL2蛋白在大肠杆菌中获得可溶性表达。将CCL2蛋白纯化后免疫新西兰大白兔,4次免疫后收集血清,通过ELISA方法检测其效价达到1∶128 000。Western blot和IFA测定结果显示本研究获得的猪CCL2多克隆抗体具有较好的特异性。本研究获得的猪CCL2蛋白和针对CCL2的兔多克隆抗体为未来研究猪CCL2的在疾病中的相关作用及生物学功能提供了试验材料。