神经浸出液对兔脂肪干细胞向雪旺细胞分化的影响

胶原酶消化法分离获得家兔脂肪源性干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs),传代培养并进行生物学鉴定。取家兔坐骨神经,并经过无菌剪碎、浸出和过滤制备家兔周围神经浸出液。将家兔神经浸出液作为诱导剂,作用于第3代ADSCs,7d后通过倒置显微镜观察形态变化、RT-PCR和免疫荧光检测雪旺细胞(Schwann-like cells,SCs)特异性标记物S-100和GFAP mRNA和蛋白的表达情况。通过神经浸出液诱导前后的ADSCs与神经元前体细胞PC12共孵育12d后,利用形态观察和Western blot检测PC12细胞的轴突生长情况。形态观察显示,经坐骨神经浸出液处理过的家兔ADSCs形态由长梭形逐渐变为双极形,类似SCs的形态;RT-PCR和免疫荧光结果均显示诱导后ADSCs表达SCs标志物S-100和GFAP蛋白。神经浸出液诱导ADSCs后能够促进PC12细胞长出较长轴突,且阳性表达神经元标志物β3-tubulin和MAP-2蛋白。结果表明,神经浸出液能有效诱导家兔ADSCs向SCs分化,且分化后的ADSCs具有真正SCs的功能。     

EGF和FGF-2对猪皮下脂肪神经嵴干细胞增殖和分化的影响

【目的】探究表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）和成纤维细胞生长因子2（fibroblast growth factor 2，FGF-2）对猪皮下脂肪神经嵴干细胞（neural crest stem cells，NCSCs）增殖及分化的影响，以优化猪皮下脂肪神经嵴干细胞的培养条件。【方法】通过体外分离培养原代猪皮下脂肪NCSCs，免疫荧光染色鉴定NCSCs标志物p75 NTR，并用不同浓度的EGF和FGF-2（0和0、10和10、10和20、20和10、20和20、30和30 ng/mL）作用于传代猪皮下脂肪NCSCs，用CCK-8试剂盒测定细胞增殖率，确定细胞生长的最适EGF和FGF-2浓度，将试验分为空白组和最适浓度组，测定两组细胞的生长曲线，成脂化诱导后油红O染色，对比两组细胞的脂滴生成量。【结果】免疫荧光染色结果显示，原代猪皮下脂肪NCSCs经p75 NTR鉴定呈阳性。CCK-8细胞增殖试验结果显示，EGF和FGF-2的浓度均为20 ng/mL时对传代猪皮下脂肪NCSCs的促增殖作用最佳。生长曲线显示，两组细胞均在第5~9天处于对数生长期，第10~15天细胞增殖减缓，逐渐到达停滞期。油红O染色结果显示，最适浓度组胞质内的脂滴生成量远多于对照组。【结论】在培养液中添加20 ng/mL EGF和20 ng/mL FGF-2对猪皮下脂肪NCSCs的增殖和分化有促进作用。     

胎牛视网膜干细胞向神经细胞诱导研究

旨在研究胎牛视网膜干细胞(Retinal stem cells,RSCs)的分离、培养、鉴定及向不同类型细胞诱导分化等的生物学特性。采用机械吹打法从胎牛眼睫状体部细胞中分离RSCs,通过免疫荧光方法鉴定RSCs标志物Nestin、Pax-6和Chx-10,并诱导其向星形胶质细胞、神经元及少突胶质细胞诱导分化,检测其多向分化潜能。结果表明,机械吹打法获得的胎牛RSCs不仅表达干细胞特有的标志,而且成功诱导分化为星形胶质细胞、神经元及少突胶质细胞。综上表明,胎牛RSCs具有良好的体外增殖能力和多向分化潜能。为今后视网膜干细胞的研究提供相应的理论依据。     

牛胎儿神经干细胞的分离培养与鉴定

分别采用机械分离法和酶消化分离法从胎龄为3个月的牛胎儿脑组织中分离培养牛神经干细胞(Neural stem cells,NSCs),比较这2种方法对NSCs培养的影响。根据培养液中是否添加bFGF、EGF和FBS,选择不同的培养液培养NSCs,观察不同培养液对NSCs培养的影响,进而筛选出最适培养液。对NSCs及经诱导分化成的神经细胞进行生物学特性分析,包括细胞形态学观察和细胞免疫荧光检测。结果显示:组成成分为Neurobasal Medium+20μg/L bFGF+20μg/L EGF+20mL/L B27+100IU/mL青霉素+100IU/mL链霉素的神经干细胞培养液能够很好地支持牛胎儿NSCs的存活和增殖;机械分离法获得的牛胎儿NSCs的神经球数量和细胞活性要比酶消化分离法效果好;NSCs特异性标志物Nestin表达呈强阳性,Sox2、Nanog、Oct4和SSEA4等干细胞表面标志表达均呈阳性;经体外诱导的NSCs可分化为星形胶质细胞(表达GFAP)和神经元(表达βⅢ-tubulin)。结果表明,可从牛胎儿脑组织中分离培养出NSCs,NSCs可长期传代培养,具有分化功能。牛NSCs为克隆牛的供体细胞和转基因牛的受体细胞提供了细胞新来源。     

细胞传代对小型猪脂肪间充质干细胞及分泌因子的影响

为了探索细胞传代对小型猪脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells, ADSCs)的影响，试验采用形态学观察法、CCK8法、Transwell迁移法、ELISA法对P3～P9代ADSCs的形态变化、增殖能力、迁移能力进行研究，并检测了传达次数对脂肪间充质干细胞的条件培养基(adipose-derived mesenchymal stem cells conditioned medium, ADSCs-CM)中血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素-1(ANG-1)、血管生成素-2(ANG-2)、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)含量的影响。结果表明：随着传代次数的增加，ADSCs形态发生变化，细胞折射率变低，边界逐渐不清晰；不同传代次数的ADSCs生长曲线相似，近似S型，但P3、P5代细胞增殖能力显著高于P9代(P<0.05);且P5代细胞迁移能力与P3、P9代细胞存在极显著差异(P<0.01);P5代细胞分泌VEGF、ANG-1、ANG-2、b-FGF、IL...     

胚胎干细胞标记基因在大鼠成体干细胞中的表达

为了给组织工程筛选合适的种子细胞,分别对大鼠脂肪间充质干细胞(rat adipose-derived stem cells,rADSCs)、骨髓间充质干细胞(rat bone marrow stromal stem cells,rBMSCs)和骨骼肌卫星细胞(rat skeletal muscle-derived stem cells,rMDSCs)进行胚胎干细胞标记基因Oct-4、Sox-2、Nanog、IL-6和Tert分析,并确定这些基因在这3种细胞中的表达差异性。首先分别应用酶消化法和机械分离法体外分离培养rADSCs、rMDSCs和rBMSCs 3种细胞。其次应用免疫荧光染色检测Oct-4、Sox-2、Nanog、IL-6和Tert在这3种细胞中的表达,然后采用实时定量PCR和Western blot分别在RNA和蛋白质水平定量检测、分析这些基因在不同细胞中的表达量及其差异。免疫荧光染色结果显示这3种细胞中均表达Oct-4、Sox-2、Nanog、IL-6和Tert,但在RNA水平和蛋白质水平均未检测到Nanog的表达,而IL-6和Tert的相对表达量在这3种细胞中均高于Oct-4和Sox-2。研究结果表明,rADSCs、rBMSCs和rMDSCs虽然具有自我更新和多向分化潜能,但是不具有与胚胎干细胞完全相同的特性。     

妊娠中期猪胎儿神经干细胞分离培养及分化

从妊娠中期猪胎儿(胎龄60 d)脑组织分离培养神经干细胞并诱导其贴壁分化,采用RT-PCR技术检测干细胞及其分化细胞的表面标志.结果显示,神经干细胞中DCX、Hes1、Oct4、CD-90、Nanog、Sox2和Nestin表达阳性;体外诱导的神经干细胞可以分化为星形胶质细胞(表达GFAP)、少突胶质细胞(表达GalC)和神经元细胞(表达NF、NSE和MAP2).结果表明,从妊娠中期猪胎儿脑组织可以分离神经干细胞,神经干细胞具有自我更新和分化潜能.     

猪胎儿神经干细胞的分离培养和分化

本研究旨在从猪胎儿脑组织中分离培养神经干细胞,观察神经干细胞生长特性和体外增殖、分化特点.利用神经干细胞培养体系,从胎龄30 d的猪胎儿脑组织中分离培养神经干细胞并诱导神经干细胞贴壁分化,采用RT-PCR技术检测干细胞和分化细胞表面标志或相关基因.结果成功分离培养出神经干细胞,神经干细胞具有分化潜能.神经干细胞中Nestin表达强阳性,β-actin、DCX、Hesl、Oct4、Desmin、CD-90、Nanog和Sox2表达阳性;体外诱导的神经干细胞可以分化为星形胶质细胞(表达GFAP)、少突胶质细胞(表达GalC)和神经元细胞(表达NF、NSE和MAP2).结果提示,从猪胎儿脑组织分离神经干细胞具有可行性和有效性,神经干细胞具有自我更新、增殖和分化潜能.     

鸡脑神经干细胞体外诱导分化研究

为了研究鸡脑神经干细胞(neural stem cells,NSCs)体外的分离、培养及诱导分化等生物学特性,试验采用机械吹打法分离鸡脑神经干细胞,通过免疫荧光对体外培养鸡脑神经干细胞进行表面标记检测,并在适宜的诱导条件下向神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞三个方向进行诱导,检测其多向分化潜能。结果表明:体外分离培养的鸡NSCs为目的细胞,并可向神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞诱导分化。说明鸡脑NSCs具有良好的体外增殖能力和多向分化潜能。     

犬脂肪干细胞的分离培养与鉴定

为了研究脂肪干细胞(Adipose-derived stem cells,ASCs)体外培养方法及其生物学特性,将ASCs应用于小动物临床治疗,本试验用犬进行了脂肪干细胞的分离、培养和鉴定。犬脂肪干细胞(Canine adipose-derived stem cells,cASCs)体外培养生长良好,呈细长梭形。第3代(P3)细胞诱导2周后,成脂诱导组经油红O染色可见细胞内脂滴积累;成骨诱导组经碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase,AKP)及VonKossa染色,AKP、钙结节均呈阳性表达。第3代至第5代(P3^P5)细胞流式细胞检测结果显示,所分离细胞稳定高表达间充质干细胞(MesenchymalStem Cells,MSCs)标志CD29、CD44、CD90(>90%),不表达造血细胞标志CD45(<2%)。培养结果显示,从犬镰状韧带和皮下脂肪均可分离出cASCs。cASCs取材方便,易于体外培养,多次传代及冻存对cASCs的生物学性质无明显影响。eASCs有望成为国内动物医学临床研究和治疗的重要干细胞来源。     

羊水干细胞研究进展

以干细胞为基础的研究为众多疾病的治疗开辟了新的途径。近年来,从羊水中获得的细胞被诱导成了多功能性干细胞(induced pluripotent stem cells,ips),并且在体外具有很大的应用前景。羊水干细胞(amniotic fluid-derived stem cells,AFScs)具有向3个胚层分化的能力,且避免了胚胎干细胞(embryonicstem cells,EScs)涉及的伦理道德问题,其来源广泛及应用上的安全性等特点使其成为了生命科学领域研究的热点。但目前对AFScs的来源和特性还不是很清楚。现就AFScs的分离培养和生物学特性作了综述,并对其所面临的问题作了进一步分析。     

不同代次大鼠骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞成骨分化比较

本研究旨在观察不同代次骨髓间充质干细胞(BMSCs)和脂肪间充质干细胞(ADSCs)体外培养的生长特点和体外诱导成骨能力。通过密度梯度离心和贴壁培养法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞,用含地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠的培养液定向诱导传代细胞向成骨细胞分化,并利用茜素红染色、碱性磷酸酶染色及PCR方法检测成骨细胞。结果表明骨髓及脂肪间充质干细胞呈成纤维细胞样生长,增殖能力强,生长迅速。第5、10、15、20代BMSCs及ADSCs经诱导培养后茜素红染色呈阳性并且出现"矿化"、碱性磷酸酶活性强,随着细胞代次的递增,诱导后细胞碱性磷酸酶活性呈递减趋势;诱导后的两类细胞传代后细胞仍能继续分化,并形成正常的"矿化"结节,且碱性磷酸酶染色均弱于初次诱导。结果提示,BMSCs及ADSCs易于分离培养及体外扩增,诱导条件下成骨能力强且成骨细胞传代培养仍具有成骨能力,适合作为再生医学骨组织工程的种子细胞。     

脂肪干细胞条件培养缓解牛磺胆酸钠和胰蛋白酶诱导的胰腺氧化应激损伤的研究

【目的】探究脂肪干细胞条件培养基(adipose-derived-stem cells conditioned medium, ADSCs-CM)缓解牛磺胆酸钠和胰蛋白酶诱导的胰腺氧化应激损伤的保护作用机制。【方法】试验选择1只中华田园犬用来分离培养脂肪干细胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)以制备条件培养基(conditioned medium, CM),另选9只中华田园犬随机分为对照组(CON组)、急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)模型组(AP组)和CM治疗组(CM组),AP组和CM组经胰胆管逆行注射牛磺胆酸钠(5%0.1 mL/kg)、胰蛋白酶(3 500 U/kg)混合溶液,建立犬AP模型,CON组注射等量生理盐水。术后CM组静脉注射ADSCs-CM(0.1 mL/kg),CON组和AP组注射等量生理盐水,24 h后通过B型超声波检查胰腺回声情况和形态,采集胰腺组织样本进行病理组织学检测,采集血液样本进行犬胰腺特异性脂肪酶(cPL)、血气、血常规、生化指标检测,比色法检测血浆及胰腺总一氧化氮合酶(total nitri...     

神经干细胞研究进展

神经干细胞(neural stem cells,NSCs)是一类存在于中枢神经系统中且能够保持长期自我更新、复制的能力,并能够向多方向进行分化的原始细胞。近年来神经干细胞已成为科学研究的热点问题。目前NSCs已经广泛地应用于中枢神经系统退行性疾病、肿瘤以及缺血损伤等疾病的治疗。本文对近年国内外学者在神经干细胞上的研究进行列举分析与总结,并对未来神经干细胞的发展前景提出展望。     

表皮调节素、上皮有丝分裂原和干细胞因子对山羊精原干细胞增殖的影响

为了揭示表皮调节素(Epiregulin/EREG)、上皮有丝分裂原(Epigen/EPG)和干细胞因子(SCF)对山羊精原干细胞(SSCs)增殖的影响,改进SSCs体外培养体系。在含有胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和白细胞抑制因子(LIF)的SSCs培养基基础上,分别添加20 ng/mL干细胞因子、20 ng/mL表皮调节素、20 ng/mL和100 ng/mL上皮有丝分裂原。对富集后山羊SSCs进行12 d的培养,测定培养过程中山羊SSCs生长曲线和细胞活性。结果表明:添加100 ng/mL上皮有丝分裂原和20 ng/mL的表皮调节素相比其他组能够显著促进山羊SSCs的体外增殖和细胞活力(P0.05);其中培养12 d后添加20 ng/mL表皮调节素的细胞活力显著高于其他组,但细胞数量与100 ng/mL上皮有丝分裂原组无显著差异。20 ng/mL SCF相比对照组能够显著提高体外增殖和细胞活力(P0.05),但低于100 ng/mL上皮有丝分裂原和20 ng/mL表皮调节素组(P0.05)。因此,添加100 ng/mL上皮有丝分裂原、20 ng/mL干细胞因子和20 ng/mL表皮调节素能够提高山羊SSCs的增殖,其中添加20 ng/mL表皮调节素效果最佳。     

野猪骨髓间充质干细胞的分离培养与生物学特性

采用全骨髓培养法对野猪股骨中骨髓间充质干细胞（Bone mesenchymal stem cells,BMSC）进行分离、培养并传代,建立野猪骨髓间充质干细胞体外培养方法及对其生物学特性进行观察研究。结果显示,细胞形态呈梭形,漩涡状生长,生长曲线为典型S型,在诱导液作用下,可分化为成脂肪样细胞。结果表明,通过本方法能够分离到较纯的BMSC,为野猪资源保存和体细胞核移植提供技术支持。     

南阳牛骨髓间充质干细胞的分离培养及多向分化

本研究旨在建立南阳牛骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)体外分离培养方法,在此基础上研究其生物学特性和多向分化的能力。采用骨髓穿刺法取3月龄小牛的肋骨骨髓,分离培养BMSCs,传代培养并测定其生长曲线,RT-PCR检测Oct4、Nanog、Sox2基因的表达,然后取P3 BMSCs分别向神经和脂肪细胞进行诱导分化,并利用组织学染色技术和RT-PCR技术进行鉴定。结果表明,分离得到的BMSCs大小均匀,多呈梭形的成纤维细胞样生长;RT-PCR可检测到干细胞因子Oct4、Nanog、Sox2的表达;不同代次细胞生长曲线呈S型,一般在第3天时进入指数生长期,第7天后进入平台期;成神经诱导后,甲苯胺蓝染色可见明显的尼氏体结构,RT-PCR检测ENO2和GFAP基因表达呈阳性;成脂肪诱导后,油红O染色后可见大量的脂滴存在,RT-PCR检测Leptin和PPAR基因表达呈阳性。试验证明,成功分离得到了南阳牛BMSCs,且其具有多向诱导分化潜能。     

鸡胚胎干细胞的分离和培养

实验从鸡第X期胚胎中分离胚盘,以鸡成纤维细胞为饲养层,用添加了10%的胎牛血清、2%的鸡血清、2mmol/LL-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸钠、5.5×10-5mol/Lβ-巯基乙醇、10μL/mL非必需氨基酸以及含1000IU/mL白血病抑制因子(LIF)、10ng/mL碱性成纤维生长因子(bFGF)和5ng/mL干细胞生长因子(SCF)的高糖DMEM对细胞进行培养和传代,可以获得传至5～6代的鸡胚胎干细胞(ES)。通过对传代培养后的鸡ES细胞进行AKP染色鉴定和SSEA-1的鉴定,证实细胞未发生分化,具有胚胎干细胞的特征。同时通过不同分离胚盘方法和不同消化时间的比较得出药勺法提取胚盘简单易行,原代消化5～8min的ES细胞适合于传代培养。