基于转录组测序的高羊茅分蘖与株高相关差异表达基因分析

分蘖与株高是禾本科草类植物重要的农艺性状,明确参与调控分蘖与株高的基因类型对牧草和草坪草分子辅助育种具有重要意义。以表型差异明显的两个高羊茅品种“Kentucky-31”（K31）和“Regenerate”为材料,旨在构建高羊茅分蘖节转录组图谱,挖掘在分蘖节部位调控生长发育相关的差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）。基于高通量测序技术平台Illumina HiSeq 2500×Miseq 300进行转录组测序,并将得到的数据进行de novo组装,结果共获得77872条单基因簇（unigene）。将获得的unigenes与非冗余蛋白数据库（non-redundant protein database,NR）、蛋白质数据库（universal protein,Uniprot）、基因本体数据库（gene ontology,GO）、东京基因与基因组数据库（kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）以及直系同源蛋白簇（clusters of orthologous groups,COG）数据库进行比对,结果显示：分别有59927、40213、44447、15146和13767条unigenes成功获得注释。“Regenerate”与“K31”对比有1573个上调DEGs和1441个下调DEGs。GO富集分析发现,DEGs主要富集在细胞、细胞组分、大分子复合物组装等生物过程。DEGs中共注释到42个差异表达转录因子,主要包括TCP、WRKY和ARF等19种类型。还注释到与8类植物激素相关的DEGs,包括生长素、细胞分裂素、脱落酸、赤霉素、乙烯、油菜素甾醇、水杨酸和茉莉酸。利用实时荧光定量PCR对DEGs进行表达模式验证,发现其与RNA-Seq测序结果一致,证实了测序结果的准确性。研究结果丰富了高羊茅的转录组序列资源,初步获得控制株高及分蘖发育的候选因子,为进一步开展基因功能及分子育种研究提供了理论支持。     

基于瘤胃转录组探究双峰驼沙漠适应性分子机制

旨在比较胚胎期和成年期双峰驼瘤胃在组织形态、编码基因表达上的变化,挖掘影响双峰驼瘤胃发育的关键基因和通路,从消化系统探究双峰驼的沙漠适应性机制。本研究选取3峰10~12岁健康状况良好的成年期阿拉善双峰驼,以及3峰9~10月龄健康状况良好的胚胎期阿拉善双峰驼,采集瘤胃组织样品,制作石蜡组织切片,观察成年期与胚胎期双峰驼瘤胃,比较其组织结构之间的差异。分别提取成年期和胚胎期双峰驼的瘤胃组织总RNA,利用Illumination Hiseq 2000测序平台分别进行转录组测序,对转录组数据进行质控、比对、差异基因筛选、GO、KEGG富集分析。随机选择6个差异表达基因进行荧光定量试验,关联转录组数据与荧光定量试验的表达趋势。结果表明,胚胎期瘤胃组织中上皮细胞和肌纤维细胞清晰可见,分布密集,在成年期的瘤胃组织中,可见明显的肌纤维,肌纤维直径较宽,肌纤维间的空隙较大。转录组测序结果显示,每个样本获得至少10G的数据量,各样本的质控率都在90%以上,Q30数据都在88%以上。对测序数据进行分析,以胚胎期为对照组,成年期为试验组,筛选到1 207个差异表达基因,其中上调基因456个,下调基因751个;对差异表达基因进行层次聚类分析,结果显示,成年期的3个个体（M1、M2、M3）表达模式接近,胚胎期的3个个体（T1、T2、T3）表达模式接近。对差异表达基因进行GO和KEGG富集分析,结果显示,上调差异表达基因显著富集到62条显著的GO条目,下调差异表达基因显著富集到366条显著的GO条目,73条显著的KEGG通路。差异表达基因主要富集在代谢过程的负调控、RNA生物合成过程的负调控、基因表达的负调控等GO条目中,KEGG主要富集到MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号、胰岛素信号通路、醛固酮的合成与分泌等通路中。同时筛选到MAPK12、MAPK13、FABP5、PPARγ、CaMK1等与双峰驼沙漠适应性相关的基因。荧光定量结果显示,差异基因在成年期和胚胎期瘤胃组织中的表达模式与RNA-Seq的结果一致。上述结果表明,双峰驼的瘤胃组织可能与脂肪细胞分化有关。在沙漠环境中,双峰驼可能降低瘤胃组织代谢效率、通过胰岛素抵抗作用提高血糖耐受性以及促进醛固酮的合成与分泌以调节血压平衡,以更好地在沙漠干燥缺水的环境中生存。     

基于转录组测序的饲料添加淫羊藿对番鸭睾丸组织差异表达基因分析

为研究饲料添加淫羊藿的番鸭睾丸组织相关基因和调控通路变化，本研究将60只公番鸭随机分为2组，每组3个重复，一组饲喂基础日粮（对照组），另一组饲喂基础日粮的基础上添加量为1%的淫羊藿（实验组）。饲喂75 d结束后，测定血清生殖激素和抗氧化指标，并进行睾丸组织形态学观察和高通量转录组测序。结果显示，实验组生精上皮层数多，生精细胞数量多，管腔饱满，成熟精子多。实验组血清生殖激素中睾酮含量、雌二醇含量、促卵泡素含量和促黄体素含量均显著高于对照组，实验组血清抗氧化指标中超氧化物歧化酶含量、谷胱甘肽过氧化物酶含量、总抗氧化水平均显著高于对照组，丙二醛含量显著低于对照组。通过转录组测序分析，本研究最终得到2 414个差异表达基因，这些差异表达基因主要被注释到白细胞激活、受体等过程，主要富集于细胞因子受体相互作用、铁死亡等代谢途径和信号通路。本文研究表明饲料添加淫羊藿激活了番鸭睾丸相关基因或通路表达，对番鸭繁殖力的提高具有重要意义。     

基于转录组测序挖掘广西麻鸡生长发育相关基因

【目的】通过对1和60日龄广西麻鸡腿肌进行转录组测序(RNA-Seq),筛选出广西麻鸡生长发育关键基因。【方法】选择1和60日龄健康母鸡各3只,分别采集腿肌组织,利用Illumina Novaseq^TM 6000平台进行mRNA转录组测序,利用DESeq2软件进行差异表达基因的分析,并对差异表达基因进行GO功能和KEGG通路富集分析,进一步筛选出生长发育相关基因,并用实时荧光定量PCR验证转录组测序结果。【结果】转录组测序结果显示,6个样本分别获得34 296 198～41 647 642条clean reads。与1日龄腿肌相比,60日龄腿肌共获得2 304个差异表达基因,其中998个基因上调,1 306个基因下调。GO功能富集分析发现,共获得富集条目572条,其中生物过程381条,细胞组分70条,分子功能121条。KEGG通路富集分析发现,共获得34个显著富集的信号通路,其中心肌收缩、MAPK信号通路、紧密连接、肌动蛋白细胞骨架信号通路、心肌细胞中的肾上腺素能信号传导等与生长发育相关。通过GO功能和KEGG通路富集分析获得5个生长发育相关基因,分别为肌球蛋白重...     

基于RNA-seq技术筛选低钙培养奶牛乳腺上皮细胞差异表达基因

本研究拟利用转录组测序(RNA-seq)技术筛选低钙培养奶牛乳腺上皮细胞(CMEC)差异表达基因,为临床寻找更为准确、灵敏的奶牛低钙血症生物标志物提供方法与思路。利用RNA-seq技术对低钙组CMEC转录组测序,筛选8个差异表达基因进行定量反转录聚合酶连锁反应(qRT-PCR)验证测序结果准确性,对测序数据进行基因功能注释及通路富集分析。结果显示,2组分别得到63 910 842条和66 979 098条滤过读段,共计筛选116个差异表达显著性基因,其中上调基因52个,下调基因64个,并找到调节甲状腺素信号通路的KAT2A基因和参与甲状腺素合成的DUOXA2基因。利用qRT-PCR对测序结果中筛选的8个差异表达基因进行验证,其结果与RNA-seq结果大体一致。结果表明低钙环境影响CMEC基因表达,KAT2A和DUOXA2基因可能参与细胞钙调节。     

基于高通量转录组测序的红花籽油对肥育猪肝脏差异表达基因的影响

18头肥育猪按饲粮均分为2组,添加红花籽油组和不添加油脂组(对照组)。试验期60d结束,全部屠宰,分别采集肝脏组织样品,进行高通量转录组测序,找出2处理组间的差异表达基因和差异代谢通路。利用Illumina HiSeqTM2500高通量RNA-seq测序技术对2组肥育猪肝脏RNA测序,使用TopHat2软件将测序得到的reads序列与猪(Sscrofa10.2)参考基因组序列比对,找出差异表达基因,在Nr、GO和KEGG数据库中进行功能注释、富集分析和聚类分析。结果显示,红花籽油组和对照组肝脏中差异表达基因共有1 114个,与对照组相比,红花籽油组表达上调的基因有579个,下调的基因有535个。GO功能分类注释到细胞组成、生物学过程和分子功能数据库中的差异表达基因分别有902,903,857个。注释到KEGG通路中差异表达基因414个,显著富集通路4个(P0.05)。     

基于转录组测序的奶牛泌乳初期与干奶期肝脏差异表达基因分析

旨在通过对奶牛干奶期和泌乳初期肝脏组织进行转录组测序和生物信息学分析,探明其不同生理阶段的差异表达基因和差异代谢通路。选取305 d产奶量接近、干奶天数一致、怀孕天数接近的中国荷斯坦奶牛3头,分别在干奶期(产前50 d)和泌乳初期(产后15 d)活体采集肝脏组织,利用Illumina Hiseq~(TM)2500高通量RNA-seq测序技术对干奶期和泌乳初期肝脏RNA测序,使用TopHat2软件将测序得到的reads序列与牛(UMD3.1.66)参考基因组序列比对,在GO和KEGG数据库中进行聚类分析和富集分析。结果显示,泌乳初期和干奶期肝脏中差异表达基因共有409个,与干奶期相比,泌乳初期表达上调的基因有235个,下调的基因有174个。GO功能分类注释到生物学过程、细胞组成和分子功能数据库中的GO条目分别有63,41,15条。注释到KEGG的显著富集通路有21条(P0.05)。该研究结果为挖掘奶牛产奶性状的候选基因提供了技术依据。     

基于转录组测序挖掘奶牛乳脂代谢关键候选基因

旨在对高、低乳脂率奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)转录组测序的mRNA表达谱数据进行深入分析,挖掘影响奶牛乳脂代谢的关键候选基因。本研究采用Illumina PE150方法对乳脂率具有极端差异的荷斯坦奶牛(高、低乳脂组各4头)的BMECs进行转录组测序,以P<0.05和|log₂FoldChange|≥1.5为阈值筛选差异表达基因,并利用KOBAS在线网址进行功能富集分析,最后通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析测序结果的准确性及乳脂代谢相关差异表达基因的组织表达谱。结果表明,在高、低乳脂组之间共发现578个差异表达基因,包括332个上调差异表达基因,246个下调差异表达基因。功能富集分析共确定了包含生物学过程(BP)、细胞组分(CC)和分子功能(MF)的366个显著富集的GO条目(P<0.05),其中与脂代谢密切相关的GO条目有长链脂肪酸的运输、脂肪细胞分化的正向调节、乳腺肺泡发育、花生四烯酸的结合等。差异表达基因显著富集到47条KEGG通路(P<0.05),参与脂代谢的通路有15条,分别为脂肪细胞内脂解的调节、磷脂酶D信号通路、河马...     

转录组测序及其在牧草基因资源发掘中的应用前景

本研究概述了基于新一代高通量测序技术转录组测序的基本原理、实验流程、数据分析和目前的应用现状,并结合抗旱牧草转录组测序研究思路,展望了转录组测序可能对牧草种质资源基因发掘及其在牧草作物种质创新与品种设计育种中产生的影响。     

基于RNA-Seq筛选ALV-J感染汶上芦花鸡肝差异表达致病相关基因

为挖掘感染ALV-J汶上芦花鸡的肝差异表达致病相关基因。本研究以汶上芦花鸡为试验素材,分别在42和300日龄进行ALV血液病毒分离检测筛选ALV阴性和阳性个体,对ALV阳性个体有病理变化的肝组织和阴性个体肝组织进行PCR检测,分别选取3只ALV阳性（G1组）和阴性（G2组）个体的肝组织,并对G1组PCR产物测序、聚类分析确定ALV亚型,利用RNA-Seq测序技术筛选差异表达基因,并进行功能分析,利用荧光定量qRT-PCR对部分差异表达基因进行验证。结果表明,G1组样品经PCR检测、PCR扩增产物测序和聚类分析确定ALV为J亚型,转录组分析发现,共有42个差异基因在GO和KEGG中富集,其中,上调基因18个,下调基因24个。随机选取的5个差异表达基因qRT-PCR验证结果与RNA-Seq测序结果相一致。GO分析显示,差异表达基因主要涉及细胞过程、代谢过程、对刺激的反应、免疫系统等;KEGG分析显示,差异表达基因主要富集在细胞过程、信号传导、疾病、新陈代谢等信号通路。本研究通过转录组分析发现了影响ALV-J致病性的多个基因和关键信号通路,为深入了解ALV-J致病的分子机制提供了思路。     

基于转录组测序的油酸诱导延边牛骨骼肌卫星细胞成脂分化差异表达基因的分析

本研究旨在研究油酸(OA)引起延边牛骨骼肌卫星细胞成脂分化途径的分子调控机制。对从12日龄延边牛中分离得到的骨骼肌卫星细胞进行体外培养,加入不同浓度OA的诱导分化培养液,进行分化处理,试验设1个空白对照组[CON组,5%马血清(HS)],3个不同浓度OA诱导组:OAL组(5%HS+50μmol/L OA)、OAM组(5%HS+100μmol/L OA)、OAH组(5%HS+200μmol/L OA),诱导96 h后,对延边牛骨骼肌卫星细胞进行了转录组测序及分析。结果表明:共得到13 951条单基因,对4个组差异表达基因进行比较发现,与CON组相比,OAL组有3 412个差异表达基因,OAM组有1 045个差异表达基因,OAH组有1 428个差异表达基因,各组之间共有278个差异表达基因。GO富集分析显示,差异基因参与了多种生物过程,包括代谢过程、细胞过程、生物调节过程等;在分子功能类别上,大多数的基因功能与结合活性、转录调节活性、催化活性等相关;在细胞组分范畴内,大部分的基因被富集到细胞、细胞器、膜等。KEGG富集分析表明,差异表达基因主要富集通路为单磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMPK)信号通路、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)信号通路、脂肪酸代谢通路、脂肪酸降解通路等。不同浓度OA差异基因荧光定量PCR结果显示,所选的5个差异基因与转录组测序结果基本一致,表明了测序结果的可靠性。本试验完成了OA诱导延边牛骨骼肌卫星细胞成脂分化的转录组测序分析,获取差异基因的功能注释信息,初步揭示了OA诱导牛骨骼肌卫星细胞成脂分化的潜在基因和通路。     

基于转录组测序生物信息学分析的研究进展

随着DNA双螺旋结构的发现,基因组研究开始进行,中心法则也成为了研究生命科学的核心。这对近年来分子生物学及检测技术的迅猛发展提供了良好的开端,随之而来的是基因测序研究成为了生物学上一个新的热点话题。虽然通过转录组测序可以获得海量基因数据,但是数据的深入探索还需要进一步研究,而这些深入的挖掘,需要生物信息学分析手段,从而建立了多组学,通过对其进行不断完善,使得现代生物科学形成了一个完整的系统。这使得生物基因学的研究可以成为一个逐层的分析,将通过整合分析出的信息数据来描述生命活动。因此,功能基因组的研究已经成为了动植物基因组研究的重要方向,特别是对转录组的研究尤为重要。作者通过对转录组学的时代背景、转录组研究的复杂性、DNA测序技术的发展史以及转录组学研究方法进行归纳,简述了转录组学的发展历程,并对转录组研究内容做了一个简单系统的介绍,为更加深入地了解转录组测序奠定了基础。     

基于转录组测序对剑白香猪黑色素生成相关基因的筛选与分析

毛色作为猪的品种特征,有着重要的研究意义。本研究为筛选剑白香猪黑色素生成相关基因,通过转录组测序技术对贵州剑白香猪黑色被毛皮肤和白色被毛皮肤进行转录组测序,并运用qRT-PCR和免疫组化技术验证测序结果。结果识别差异表达基因1 230个,其中相较于白色被毛皮肤组织而言,黑色被毛皮肤组织中上调基因有738个,下调基因有492个,包括与黑色素合成相关基因,如酪氨酸酶基因(tyrosinase, TYR)、酪氨酸相关蛋白1基因(tyrosinase-related protein1,TYRP1)、多巴色素异构酶(dopachrometautomerase, DCT)、黑色素A基因(melan-A,MLANA)等,且这些基因在剑白香猪黑色被毛皮肤中的表达量显著高于白色被毛皮肤。基因本体(gene ontology, GO)分析发现共有1 070个差异表达基因显著富集于9个GO term,包括蛋白降解(proteolysis)、生物调节(regulation of biological quality)、细胞连接复合体(extracellular matrix organization)、细胞质...     

基于转录组测序的新城疫疫苗免疫鸡胸腺差异表达基因分析

为研究新城疫(ND)疫苗接种的青脚麻鸡胸腺组织相关基因与调控通路变化,对无特定病原体(SPF)的青脚麻鸡人工接种ND疫苗48 h后,取胸腺组织采用Illumina HiSeq 2500高通量测序技术进行转录组测序,使用TopHat2软件对测序得到的reads序列与鸡(Gallus_gallus-5.0)的参考基因组比对...     

基于单细胞转录组测序技术筛选牛体内囊胚性别特异性基因

【目的】探究牛体内雌性和雄性囊胚在mRNA水平上的特异性差异,挖掘雌性和雄性囊胚发育差异相关候选基因。【方法】参考GenBank中牛牙釉质基因（AMEL）序列（AMELX基因,登录号：NM_001014984.1;AMELY基因,登录号：NM_174240.2）设计引物,以胚胎内细胞DNA为模板,采用巢式PCR扩增技术鉴定单个牛体内囊胚的性别。选用确定性别的单个雌性和雄性囊胚为试验材料,采用Smart-Seq2扩增技术构建单个胚胎测序文库,应用Illumina HiSeq Xten高通量测序平台对单个胚胎进行单细胞转录组测序（scRNA-Seq）,并进行了基因差异表达、GO功能和KEGG通路分析。【结果】通过巢式PCR扩增胚胎内细胞中的AMEL基因,确定了胚胎性别;基因表达分析筛选出两组之间差异表达基因（DEGs）6 160个,其中雌性特异性基因675个,雄性特异性基因305个;GO功能注释发现雌性特异性基因显著注释在核苷酸结合、信号转导调控、多细胞生物发育、细胞骨架等条目,雄性特异性基因显著注释在氧化磷酸化、线粒体、线粒体内膜、核糖体等条目;KEGG通路富集分析发现7条与雌性和雄性囊胚发育差异相关的通路,分别为代谢途径、糖酵解、磷酸戊糖途径、细胞衰老、氧化磷酸化、调节干细胞多能性的信号通路和Wnt信号通路;并利用GO和KEGG结果筛选出5个在牛体内囊胚期胚胎发育过程中具有直接或间接作用的基因：FBP1、GADD45G、FHL2、FOSB和WNT2B。【结论】牛体内雌性和雄性囊胚之间存在广泛的转录差异,性别特异性基因FBP1、GADD45G、FHL2、FOSB和WNT2B可能是直接或间接影响胚胎发育的关键基因。     

金黄色葡萄球菌在生物被膜态与浮游态的转录组差异表达分析

金黄色葡萄球菌是引起奶牛细菌性乳腺炎的主要原因，生物被膜的形成是金黄色葡萄球菌在不利环境条件下持久性存在的关键因素。探索同一株菌在生物被膜态与浮游态生长状态下的耐药性与其生长状态的相关性，可为进一步探究金黄色葡萄球菌的耐药性机制奠定基础。本研究培养了金黄色葡萄球菌的生物被膜，使用光学显微镜和扫描电镜观察其形成过程。测定并比较了9种抗菌药物对32株金黄色葡萄球菌在生物被膜态和浮游态的最小抑菌浓度，并对两种状态下的金黄色葡萄球菌进行转录组学测序，筛选出具有显著性差异的细胞信号通路和表达基因，同时对主要差异表达的基因进行RT-qPCR验证。结果发现，在生物被膜形成前期，随着培养时间的延长，显微镜下观察到的生物被膜态菌聚集面积越来越大，结构也越来越紧密，培养至72 h后，生物被膜逐渐开始分散。MIC测定结果显示浮游态菌的抑菌浓度低于生物被膜态菌。转录组结果显示两种状态菌的差异表达基因共1 512个，其中，生物被膜态菌中上调基因760个，下调752个。GO与KEGG富集分析显示，相比于浮游态菌，生物被膜态菌中与代谢相关的通路显著富集，其次为氨基酸的生物合成和ABC转运蛋白通路。与生物被膜形成相关的基因，如编码ABC转运蛋白的基因表达上调，而与代谢途径相关的基因下调。RT-qPCR验证了10个主要差异基因，其表达差异趋势与转录组测序结果一致。这些差异可能对金黄色葡萄球菌生物被膜态的高耐药性和细菌毒力的研究有所帮助。     

绵羊超数排卵卵巢差异表达基因及生物信息学分析

【目的】筛选出影响经超数排卵处理的多浪羊卵巢卵泡发育的关键基因、生物过程及信号通路,为进一步了解多浪羊超数排卵状态下卵巢生长发育机制提供依据。【方法】对15只2～3岁身体状况良好的多浪羊进行超数排卵处理后,采集超数排卵中早期(第11天)、中期(第13天)、晚期(第15天)卵巢组织,利用高通量测序技术进行转录组测序,将测序得到的reads序列与参考基因组进行序列比对,筛选出差异表达基因;通过STRING数据库对差异表达基因进行蛋白互作网络分析,采用Cytoscape软件进行可视化编辑处理,利用eggNOG-mapper软件进行GO功能和KEGG通路富集分析。【结果】超数排卵卵巢第11和13天共筛选出223个差异表达基因,获得259条互作关系,差异表达基因显著注释在细胞生长、核糖核蛋白复合等条目中,其中显著差异表达的基因为ITGB3和SNAI1,未发现显著富集通路。超数排卵卵巢第13和15天共筛选出694个差异表达基因,获得785条互作关系,差异表达基因显著注释在DNA复制的启动、DNA复制、DNA新陈代谢过程等条目中,其中显著差异表达的基因主要有CASP3、NOTCH1、WNT2和RUN...     

转录组测序技术在猪繁殖与呼吸综合征病毒研究中的应用

猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)能导致母猪繁殖障碍及仔猪呼吸困难等症状,严重威胁全球养猪业的健康发展。目前,PRRSV的致病机制及其与宿主的互作机理并不完全清楚。近年来,随着高通量测序技术的快速发展,转录组测序技术已被广泛应用于PRRSV的研究中,为深入解析PRRSV的致病机理及其与宿主的互作机制提供了一种全新的研究工具。作者从感染应答、蛋白功能、毒株、疫苗、抗病品种5个方面对近年来转录组测序技术在PRRSV研究中的应用进行了综述分析,对其筛选的差异表达基因(DEGs)和通路进行总结,以期为未来PRRSV转录组学研究提供参考。