单增李斯特菌inlK基因缺失株的构建及其生物被膜与消毒剂抗力分析

【目的】 研究inlK基因对Lm90SB2菌株生物被膜形成能力的影响及其生物被膜与消毒剂抗力的关系,以期为有效防控单增李斯特菌污染提供参考。【方法】 以单增李斯特菌Lm90SB2为试验菌,根据GenBank中公布的单增李斯特菌F2365 inlK基因序列(登录号:AE017262),应用Primer Premier 5.0软件设计用于扩增inlK基因上、下游同源臂片段及验证缺失株的特异性引物,以同源重组技术构建inlK基因缺失株,并通过旁外侧引物运用PCR方法进行缺失株检测。将标准菌株Lm90SB2和构建的缺失株分别培养8、12、24、48 h后进行结晶紫染色,在倒置显微镜下观察形态变化,并用酶标仪测定生物被膜形成能力;用含3 g/L卵磷脂+3 g/L吐温80的PBS溶液和含10 g/L卵磷脂+20 g/L吐温80的PBS溶液作为新洁尔灭消毒剂的中和剂,含5 g/L硫代硫酸钠+5 g/L卵磷脂+20 g/L吐温80的PBS溶液和含10 g/L硫代硫酸钠+30 g/L卵磷脂+20 g/L吐温80的PBS溶液84消毒剂的中和剂,设消毒剂+菌悬液、消毒剂+菌悬液+中和剂、中和剂+菌悬液、消毒剂+中和剂+菌悬液、稀释液+菌悬液(阳性对照)、稀释液+中和剂+培养基(阴性对照)6个试验组,进行中和剂的筛选,并检测不同浓度新洁尔灭(1∶15、1∶30)和84消毒剂(1∶50、1∶100)分别作用1、5、10、20 min时对2株菌的灭菌率。【结果】 PCR结果表明,成功构建了缺失株Lm90SB2ΔinlK,且inlK基因的缺失导致Lm90SB2菌株生物被膜形成能力显著或极显著下降(P<0.05;P<0.01);含3 g/L卵磷脂+3 g/L吐温80的PBS溶液构成的中和剂可有效中和新洁尔灭消毒剂,5 g/L硫代硫酸钠+5 g/L卵磷脂+20 g/L吐温80的PBS溶液可有效中和84消毒剂。不同比例的新洁尔灭(1∶15、1∶30)和84消毒剂(1∶50、1∶100)消毒剂在1、5、10 min对Lm90SB2ΔinlK株的灭菌率均显著或极显著高于Lm90SB2株(P<0.05;P<0.01),且在20 min时灭菌率均为100%。【结论】 inlK基因的缺失导致Lm90SB2菌株生物被膜形成能力下降,且对消毒剂抗力减弱。     

flaA基因的缺失对绵羊脑炎单核细胞增生李斯特菌的细胞黏附、侵袭能力及生物被膜形成能力影响的研究

为了探究flaA基因对单核细胞增生李斯特菌LM90SB_2黏附和侵袭MBMEC、RAW264.7能力、生物被膜(BF)形成能力的影响,本研究分别进行了flaA基因缺失株LM90SB_2-ΔflaA与野毒株LM90SB2对细胞黏附和侵袭试验,定性定量分析了他们生物被膜形成能力以及小鼠不同脏器中载菌量差异。结果显示:LM90SB_2-ΔflaA对MBMEC的黏附菌数较野毒株LM90SB_2低,且两者差异性显著(P<0.05),两者对MBMEC的侵袭数差异性不显著(P>0.05),而LM90SB_2-ΔflaA对RAW264.7的黏附和侵袭数均显著低于野毒株LM90SB_2(P<0.05);LM90SB_2-ΔflaA与LM90SB_2的BF形成规律基本相同,但缺失株形成的BF总量显著低于野毒株的(P<0.05),且与野毒株相比,缺失株的BF结构中核酸与多糖的分布均松散、稀疏、散点状分布。本研究结果表明,flaA基因对LM90SB_2的细胞黏附和侵袭能力均有影响,在其BF形成过程中发挥着重要的作用。     

甘肃省畜禽肉品中单核细胞增生李斯特菌污染情况的调查

采集甘肃省兰州市、定西市、张掖市、酒泉市和庆阳市等地区部分屠宰场和农贸市场共1 387份样品。通过常规细菌学和分子鉴定方法对样品进行单核细胞增生李斯特菌分离鉴定,并对分离菌株的耐药性、血清型以及生物被膜形成能力进行测定。1 387份样品中共分离出14株单核细胞增生李斯特菌,总分离率为1.0%。选择12种抗菌药物进行纸片扩散法(KB)药敏性检测,结果表明分离菌株对四环素和头孢噻吩耐受最严重,耐药率为100%。青霉素、乙酰螺旋霉素、复方新诺明、红霉素、磷霉素和多黏菌素,多重耐药严重。血清型鉴定结果表明1/2a血清型菌5株(35.7%),1/2b血清型菌2株(14.3%)1/2c血清菌6株(42.9%),4b血清型菌1株(7.1%)。同时,分离株均能形成生物被膜,其中1/2a、1/2b和1/2c血清型菌株形成生物被膜的能力较强。研究表明,甘肃省畜禽肉品中存在单核细胞增生李斯特菌污染,农贸市场中污染最严重,相关部门应加强监控,从而预防食源性疾病的发生。     

上海市鸡源单增李斯特菌株分子流行病学调查

为了解上海市大型超市售卖鸡肉中单增李斯特菌的污染情况,本研究于2018年7月从上海市的多个超市中随机采集冷藏鸡翅样品270份,并对分离菌株的耐药性、血清型及生物被膜形成能力进行测定.通过常规细菌学和分子鉴定方法共确定38株单增李斯特菌,总分离率为14.07％;对分离株采用PCR法进行血清学分型,结果显示分离株以血清型1...     

绵羊大肠埃希菌生物被膜形成及相关基因的检测

检测绵羊大肠埃希菌中的XJ10生物被膜(biofilm,BF)形成情况并确定与BF形成相关基因的携带情况。采用96孔聚苯乙烯微孔板培养XJ10观察BF的形态和测定OD值分析XJ10BF在不同的时间段形成的情况,采用PCR方法检测BF 12种形成相关基因的分布情况。结果表明,在37℃,BF的OD值从2 h开始逐渐升高,24 h左右接近最高峰,维持至36 h后,OD值开始缓慢下降,直至72 h仍维持较高水平,在整个检测时间段内XJ10BF OD值显著高于对照组,且差异显著(P0.05);6 h时BF形成初具形态,8 h～10 h呈现不完整的网格结构,12 h时BF形成较明显的网状结构,24 h～36 h形成有序的较为密集的网格结构,48 h后网状结构开始解离和脱落。同时在XJ10中检测到了其中8种与BF形成相关的基因,测序结果与GenBank公布的相应序列同源性为97.2%以上。试验表明XJ10具有形成BF的能力,但形成能力较弱,且携带8个与BF形成相关的基因。     

冷冻鸡肉中单核细胞增生李斯特菌2个分离株的毒力及毒力相关因素研究

以鸡胚为感染动物,检测2株冷冻鸡肉单核细胞增生李斯特菌(LM)的鸡胚半数致死量(LD50)、鸡胚肝脏指数、确定其毒力,同时检测毒力基因、溶血价、生物被膜形成能力,进行毒力相关因素分析.结果显示,与PBS组和无害李斯特菌(L.innocua)组相比,LM873与LM925均能致死鸡胚,鸡胚LD50分别为4.733和1.5...     

4b型单增李斯特菌更易引发疾病

我国学者从食品中分离出了单核细胞增生性李斯特菌（LM）,并研究了其分子学特征和潜在毒性。结果显示,从食品中分离的88株LM中,42株血清型为1/2a或3a,23株血清型为1／2b或3b,15株血清型为1／2c或3c,6株血清型为4b、4d或4e,2株血清型为4a或4c。     

单增李斯特氏菌溶血素基因的克隆及原核表达

参考GenBank收录的单增李斯特菌Hly基因序列,设计1对引物,采用PCR技术扩增出单增李斯特氏菌的溶血素基因Hly(不含有信号肽部分),得到一条1590bp的条带。将其连入pMD18-T载体,经酶切、PCR鉴定和序列测定法进行鉴定。测序正确后,将该基因插入到pET-28a中构建原核表达载体pET-28a-sHly,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,将诱导产物用SDS-PAGE和Western-blot鉴定。结果显示,Hly基因可以在大肠杆菌中获得表达,表达产物分子质量约为65kU,与预期蛋白质分子质量大小一致。经Western-blotting鉴定可知,诱导表达产物以可溶形式存在,可被兔抗LM阳性血清特异识别,具有较好的抗原活性,为进一步研制基于溶解素蛋白的诊断抗原和特异性单克隆抗体,开展LM的致病与免疫机理研究奠定基础。     

大肠埃希菌生物被膜研究进展

细菌生物被膜指多个细菌黏附于机体或物体表面,分泌胞外多聚物将其自身包裹其中而形成的结构。研究表明人类许多细菌感染与生物被膜有关,生物被膜具有极高的抗药性和免疫逃逸能力,这也是许多细菌感染难以根除的重要原因之一,近年来已成为医学界关注的热点。大肠埃希菌是最重要的条件致病菌之一,论文从大肠埃希菌生物被膜的形态结构、检测方法、耐药机制、应对策略4个方面综述了大肠埃希菌生物被膜研究的进展。     

单核细胞增生性李斯特菌检测研究进展

单核细胞增生性李斯特菌是近年来又重新抬头出现的病原微生物,已在世界许多港口被检测到,并造成了一定的经济损失被认为是影响畜禽和人类健康的重要病原微生物之一。文章就单核细胞增生性李斯特菌检测方法的研究进行了系统的综述,为控制该病原微生物的传播和蔓延提供参考。     

广西猪源沙门菌血清学分型及生物被膜形成能力的研究

为了研究近年广西地区流行猪源沙门菌的血清型和生物被膜形成能力,对从广西区内不同地区规模猪场分离鉴定的35株沙门菌,用玻片凝集法进行血清学分型;应用结晶紫染色微量板定量法检测菌株的生物被膜形成能力。结果显示:试验菌株分属14种血清型,所有菌株均具有生物被膜形成能力:20株弱成膜能力,4株中等成膜能力,11株强成膜能力。其中,鼠伤寒沙门菌的成膜能力较强。     

单核细胞增生李斯特菌ActA单克隆抗体的制备

原核表达单核细胞增生李斯特菌(Lm)ActA蛋白并进行亲合层析纯化,以Lm全菌为免疫原、以纯化的表达蛋白为检测抗原制备Lm单克隆抗体,共获得4株抗Lm ActA单克隆抗体。其中3G6、4E10和2B9为IgG1亚类,2B4为IgM亚类;检测腹水抗体效价,3G6和4E10为1∶64 000,2B9为1∶32 000;3G6、4E10和2B9的亲和常数分别为6.62×107L/mol、5.67×107L/mol和7.15×106L/mol;3G6、2B4和4E10为Lm ActA特异性单抗,2B9为致病性李斯特菌特异性单抗。所制备的单抗为Lm检测方法的建立奠定了基础。     

动物源性沙门菌的血清型、生物被膜形成能力和耐药性分析

本研究旨在探讨动物源性沙门菌的血清型分布、生物被膜形成能力及其耐药性.从不同动物病料中分离细菌,以PCR方法鉴定沙门菌,结合玻片凝集法和16S rRNA序列测定确定沙门菌的血清型和分布,结晶紫染色定量法检测分离株的生物被膜形成能力,药敏试验检测分离菌对常用药物的敏感性.结果共分离鉴定出58株沙门菌,包括鸡白痢沙门菌、鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌、丙型副伤寒沙门菌、乙型副伤寒沙门菌、都柏林沙门菌和阿哥那沙门菌等7种血清型,其中鸡群以鸡白痢沙门菌感染为主,肠炎沙门菌次之;水禽以鼠伤寒沙门菌感染为主.生物被膜测定结果显示51.72％的沙门菌分离株可形成生物被膜,其中83.33％的鼠伤寒沙门菌可形成生物被膜.20种抗生素(氨基糖苷类、磺胺类、喹诺酮类、林可酰胺类、氯霉素类、青霉素类、四环素类和头孢菌素类)敏感性试验表明所有菌株对林可霉素耐药,51.72％对4种及其以上抗生素耐药,并出现了1株对所有受试抗生素均耐药的鼠伤寒沙门菌.结果表明鸡白痢沙门菌、鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌是为目前在家禽中分离的优势血清型;同时具有生物被膜形成能力和多重耐药性的沙门菌将对家禽疾病控制和公共卫生带来更大的威胁.     

石河子地区动物性食品中单核细胞增生李斯特菌的检测

目的了解新疆石河子地区动物性食品中单核细胞增生李斯特氏菌(LM)污染状况。方法在石河子地区选取5个具有代表性动物性食品零售点,对最常食用的生鲜猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉、冻鸡肉、冻虾和冻带鱼8类动物性食品进行随机采样,采用病原分离培养和PCR法对样品中的单核细胞增生李斯特氏菌进行检测。结果检测8类249份食品样品,细菌分离鉴定阳性样品12份,平均阳性率4.82%;PCR法检测阳性样品36份,平均阳性率为14.46%。结论石河子动物性食品中LM的污染比较普遍,尤以冻鸡肉和冻虾LM污染较重,新鲜猪肉、牛肉和羊肉LM污染程度较轻。     

硒化乌拉尔甘草多糖和乌拉尔甘草多糖对单核细胞增生李斯特菌抗菌活性的研究

为了比较硒化乌拉尔甘草多糖(selenizing Glycyrrhiza uralensis polysaccharide, SeGUP)和乌拉尔甘草多糖(Glycymhiza uralensis polyacchiade, GUP)对单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogene,Lm)体内、体外抗菌活性,试验采用药敏纸片方法分别测定Lm对480 mg/mL、240 mg/mL、120 mg/mL GUP和SeGUP的敏感程度;采用微量肉汤稀释法测定SeGUP和GUP对Lm的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC);设置SeGUP和GUP高剂量(240 mg/mL)组、中剂量(120 mg/mL)组、低剂量(60 mg/mL)组,各组分别与Lm混合培养24 h,每2 h取样测定OD₆₀₀值,观察SeGUP、GUP对Lm生长速率的影响;检测各组4小时时的培养上清液中的碱性磷酸酶(AKP)、β-半乳糖苷酶活性及蛋白质总含量;用结晶紫染色法检测SeGUP和GUP各剂量组对Lm生物被膜形成能力的影响;分别按体重灌胃小鼠SeGUP、GUP 300 ...     

单核细胞增生性李斯特氏菌及其检验

单核细胞增生性李斯特氏菌是近年来又重新抬头出现的病原微生物,已在世界许多港口被检测到,并造成了一定的经济损失,被认为是影响畜禽和人类健康的重要病原微生物之一。本文就单核细胞增生性李斯特氏菌的生物学特性、流行病学、致病性及检验等方面进行了系统的综述,为控制此病原微生物的传播和蔓延提供了重要的理论和实践依据。     

σ~B因子在单核细胞增生李斯特菌环境应激反应中的调控作用

为了解σB因子在单核细胞增生李斯特菌(LM)环境应激反应中的调控作用,笔者用基因重叠延伸PCR(SOE-PCR)和同源重组的方法构建了SigmaB基因缺失株,分析该缺失株在不同温度、pH和高盐压力条件下的应激反应能力及应激相关基因的转录水平。结果表明:与野毒株相比,SigmaB基因缺失株在压力条件下的应激能力减弱,rsbV、rsbW、hpt、clpP、ctsR等环境应激相关基因转录水平均降低。本研究提示σB因子在LM温度、pH和高盐环境应激反应中具有重要的调控作用,这为揭示LM环境应激反应的分子机制及药物作用新靶点的筛选提供了重要的理论依据。     

1株环境源单增李斯特菌的分离鉴定及生物特性分析

【目的】探究牦牛屠宰场中存在的单增李斯特菌对牦牛肉造成污染的风险。【方法】通过细菌分离培养、形态观察、生化试验及分子学方法对牦牛屠宰场50份污水样品中的单增李斯特菌进行分离鉴定;通过PCR方法对分离株血清型和毒力基因进行鉴定和检测,并测定分离株在不同生长条件下D_{600 nm}值;通过细胞的黏附和侵袭试验及小鼠半数致死量(LD₅₀)确定分离株的毒力。【结果】从50份污水样品中分离出1株革兰氏阳性短杆状细菌。分离株在李斯特菌显色培养基上为蓝绿色菌落,镜检为革兰氏阳性两端钝圆的短杆状菌,疑似为单增李斯特菌。生化试验结果显示,分离株可水解七叶苷,发酵葡萄糖、麦芽糖和鼠李糖,MR、VP、动力、过氧化氢酶试验为阳性,甘露醇和木糖发酵试验为阴性。系统进化树显示,分离株与单增李斯特菌EDG-e具有高度同源性,序列相似性为99%,血清型鉴定其血清型为1/2a。毒力基因检测结果显示,分离株携带inlB、inlC、inlJ、actA、plcA、prfA、mpl、hly、inlA、SigmaB毒力基因。抗应激能力试验显示,分离株在低温、强酸、强碱、高盐、乙醇胁迫和氧化...     

单核细胞增生李斯特菌检测技术研究进展

单核细胞增生李斯特菌(简称单增李斯特菌)是一种世界范围内的食源性病原菌,食用被该菌污染的食物会引起李斯特菌病,致死率高达20％～30％.单增李斯特菌广泛存在于环境、食品、人和动物宿主中,可以在极端条件下生存并引起食物污染,已成为人们关注的重要公共卫生问题.论文主要综述了近年来国内外几种关于单增李斯特菌的快速检测方法,包...     

鸡单核细胞增生性李斯特菌病诊断与病原鉴定

通过临床观察、病理剖检、细菌学检测、生化试验、动物试验及低温培养试验,确诊一例鸡李斯特菌病,并鉴定一株鸡源单核细胞增生性李斯特菌,药敏试验结果表明该分离菌对氯霉素敏感性最高。