瓜类褪绿黄化病毒山东分离物全基因组序列扩增及分析

为明确分离自山东省寿光市甜瓜上的瓜类褪绿黄化病毒(cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV)分离物的全基因组序列信息和遗传变异情况,利用毛形病毒属Crinivirus简并引物进行RTPCR检测,利用RACE技术结合RT-PCR方法克隆CCYV山东分离物2条RNA链的全基因组序列,通过与GenBank中其它地区CCYV分离物的全长序列进行比对分析其同源性,并基于CP基因序列构建系统进化树分析其遗传变异情况。结果表明,山东分离物经RT-PCR检测和测序后确定为CCYV。CCYV山东分离物与其它CCYV分离物的RNA1链和RNA2链的全基因组序列一致性的平均值分别为99.82%和99.88%,且2条链的5′末端均比较保守,没有碱基突变的情况发生;RNA1链3′末端存在2个碱基变异,RNA2链3′末端存在1个碱基变异。CCYV不同地区分离物主要分为3个簇群,其中山东分离物和中国其它地区分离物、日本分离物、苏丹分离物、黎巴嫩分离物和塞浦路斯分离物聚类在一起。研究表明CCYV基因组序列比较保守,该病毒的分化可能与地理来源存在一定的相关性。     

甘薯病毒G CH株系和CH2株系中国分离物基因组全序列克隆及结构特征分析

为明确甘薯病毒G(sweet potato virus G,SPVG)CH株系中国分离物SPVG-CH-Ch1和CH2株系中国分离物SPVG-CH2-Ch1的基因组结构特征及遗传变异情况,利用RT-PCR和RACE方法克隆获得分离物SPVG-CH-Ch1和SPVG-CH2-Ch1的基因组全序列,应用DNAMAN软件对基因组全序列及不同编码区序列进行分子变异分析,并基于多聚蛋白基因序列利用MEGA 7软件进行系统进化分析。结果表明,分离物SPVG-CH-Ch1和SPVG-CH2-Ch1的基因组分别包含10 813个和10 834个核苷酸,均包含1个开放阅读框,由10 467个核苷酸组成,编码含有3 488个氨基酸残基的多聚蛋白。分离物SPVG-CH-Ch1与SPVG-CH2-Ch1之间的基因组全序列核苷酸一致性为78.6%,二者与GenBank中登录的其它SPVG分离物基因组全序列核苷酸一致性分别为78.6%～99.1%和77.9%～98.6%,其中SPVG-CH-Ch1与IS103分离物(KM014815)的核苷酸一致性最高,为99.1%,与WT325分离物(KF790759)的核苷酸一致性最低,为78.6%;SPVG-CH2-Ch1与WT325分离物的核苷酸一致性最高,为98.6%,与66Al分离(KX279878)的核苷酸一致性最低,为77.9%。系统进化树显示,SPVG-CH-Ch1与CH株系的7个分离物形成1个分支,SPVG-CH2-Ch1与CH2株系的WT325分离物形成1个分支。表明SPVG的CH株系和CH2株系之间的变异较大,株系内较保守。     

辣椒轻斑驳病毒湖南分离物的全基因序列测定及结构分析

采自湖南地区的辣椒轻斑驳病毒Pepper mild mottle virus(PMMoV)样品经单斑分离后,根据已经报道的PMMoV序列基因保守区设计6对简并引物,采用片段重叠法和RACE方法扩增、克隆获得一个全长为6 356bp的湖南分离物(PMMoV-HN1,登录号:KP345899)全基因组序列,编码4个蛋白,分别为126kD蛋白(70~3 423nt)、183kD蛋白(70~4 908nt)、28kD蛋白(4 909~5 682nt)和17.5kD蛋白(5 685~6 158nt),5′-非编码区(5′-UTR)和3′-非编码区(3′-UTR)分别含有69和198个碱基,其中5′-UTR存在一个序列为m7G5′pppG的甲基化核苷酸帽子结构。一致性分析发现PMMoV-HN1与PMMoV其他分离物的核酸一致性为94%~99%,编码的氨基酸一致性为94%~99%。全基因组序列系统进化分析表明PMMoV-HN1分离物与中国首次报道的PMMoV-CN分离物亲缘关系最近。本研究是国内报道的第二例PMMoV全基因组序列。     

我国部分苹果产区苹果锈果类病毒的检测和全序列分析

近年来,由苹果锈果类病毒Apple scar skin viroid(ASSVd)引起的苹果花脸病、锈果病在我国一些苹果产区日趋严重,对我国苹果生产和苹果产业发展造成严重危害。为了解ASSVd在我国一些苹果产区的发生和变异情况,采用RT-PCR对陕西、山东、山西、河北、北京和黑龙江6个苹果产区的35份苹果样品进行检测,并克隆获得30个分离物的基因组全序列,大小为330~333个核苷酸。分析表明,这些分离物的基因组全序列与GenBank中ASSVd基因组核苷酸序列相似度为96%~100%,在苹果锈果类病毒属的末端保守区及中央保守区保守,在致病区和左端区域有突变,一些分离物的突变位点相同。系统发育分析表明分离物因相同的突变位点而聚类,而与地理来源无关。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒安徽分离物全基因组序列测定及分析

通过胶体金免疫层析试纸条和RT-PCR等手段对采自安徽和县的西瓜病株进行检测,确定其病原为黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)。为明确CGMMV安徽分离物CGMMV-Anhui的分类地位,进一步克隆了该病毒的全基因组序列,分析了其基因组结构特征。结果表明,CGMMV-Anhui基因组全长为6 423bp(GenBank登录号KT236095),与已报道的CGMMV的编码区的基因结构一致,仅5′和3′端非编码区核苷酸数目略有差异。将CGMMV-Anhui与已报道的分离物的全基因组序列和外壳蛋白基因序列进行系统发育分析,显示CGMMV不同分离物可分为亚洲和欧洲两个组,安徽分离物CGMMV-Anhui与亚洲分离物亲缘关系较近,可能具有共同的侵染源。     

北京地区番茄黄化曲叶病病毒分离物测定及株系的初步鉴定

 番茄黄化曲叶病毒病是番茄生产中的一种毁灭性病毒病害,2009年传入北京。利用烟粉虱传双生病毒简并引物PA/PB对2010年~2011年采集自北京市5个区县的53个番茄样品进行检测,30个表现典型黄化曲叶病症状的样品均扩增得到约500 bp的特异条带,测定了其中7个样品的部分序列,经序列比对分析表明其为番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV）。利用TYLCV特异引物TJ-F/TJ-R、TY-F/TY-R对样品BJDXXY、BJFS02、BJFS03、BJMY2231进行TYLCV基因组克隆和序列测定,经分析4个样品携带的TYLCV基因组长度均为2 781碱基,编码6个蛋白。基因组序列比较发现,这4个分离物与TYLCV-Israel株系同源性达到98%以上;通过建立系统发育树,发现BJDXXY、BJFS02、BJFS03与河北分离物（HBLF4）、山东分离物（SDSG）亲缘关系较近,BJMY2231与上海分离物（TYLCV-Israel）、江苏分离物（JSNJ1）亲缘关系较近。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒基因组全序列分析及病害的田间调查

为明确近年来在浙江省葫芦科作物上发生的黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)基因组特征及其发生分布情况,从浙江省及上海地区的甜瓜、西瓜和瓠瓜上采集疑似样品进行RT-PCR鉴定,通过分段扩增测序的方法拼接获得基因组全序列并进行系统进化分析,利用特异性引物扩增获得CGMMV外壳蛋白(coat protein,CP)基因序列,制备CGMMV CP抗血清进行Western-blot和Dot-ELISA检测。结果显示,来自甜瓜、西瓜和瓠瓜的3个CGMMV分离物基因组全序列均具有烟草花叶病毒属典型基因组结构特征,全部由6 423 nt构成;3个全序列间的核苷酸同源性高达99.11%~99.67%,编码的CP氨基酸同源性为100%。系统进化分析发现,CGMMV不同分离物形成2个进化相关群体,3个浙江的CGMMV分离物均位于第I组内,与已报道的中国CGMMV分离物和韩国CGMMV分离物亲缘性较高。Western-blot检测表明CGMMV CP抗血清可以与感病植株中的病毒发生特异性反应,可用于CGMMV鉴定;Dot-ELISA检测发现CGMMV在浙江省和上海市的葫芦科作物上普遍存在。     

西瓜花叶病毒2号南瓜分离物的鉴定及其外壳蛋白基因序列分析

 利用电镜和酶联免疫吸附测定法(ELISA)在黑龙江省采集的南瓜病样中检测到西瓜花叶病毒2号(WMV-2)。再利用免疫PCR (IC-PCR)和反转录PCR (RT-PCR)方法,扩增获得其外壳蛋白(CP)基因片段,并克隆到pGEM-T载体中。核苷酸序列测定表明,该分离物CP基因全长为852个核苷酸,编码由284个氨基酸组成的31.8 kDa蛋白。与国外已报道的WMV-2 CP基因相比,其核苷酸序列同源性为92.2%~94.0%,由此推导的氨基酸序列同源性为94.5%~98.1%。与国内2个分离物相比,和山西分离物核苷酸和氨基酸的同源性都达到98.5%,和郑州分离物核苷酸和氨基酸的同源性分别为91.5%和95.0%。     

侵染苘麻的菜豆金色黄花叶病毒的鉴定及基因组结构分析

为明确引起我国山西晋中地区苘麻叶片表现皱缩和花叶症状的病原物及其基因组分子特征, 本研究利用双生病毒简并引物扩增获得病毒基因组部分序列,经测序、比对后设计特异性引物扩增病毒基因组序列, 进而通过生物信息学方法构建系统发育树并进行序列分析。结果表明:引起苘麻叶片皱缩、花叶的病原物为番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl virus, TYLCV), 将该分离物命名为TYLCV-Abu, GenBank登录号为OP293347, 但未扩增到β卫星。该病毒DNA-A基因组全长为2 782 bp, 含有6个开放阅读框。TYLCV-Abu分离物与TYLCV茄子分离物KSQ1-3(GenBank登录号KC428753)的核苷酸序列一致性最高, 为98.99%, 其中C4和V2编码的蛋白变异较大。重组结果分析显示,分离物TYLCV-Abu是由TYLCV-F(GenBank登录号KY971326)和TYLCV-KSQ1-3重组得到, 重组区域为其基因组2 617－2 782 nt区域。这是首次从苘麻样品中扩增到TYLCV全基因组序列并进行分析。     

晋南冬麦区大麦黄矮病毒流行株系监测及防治策略探讨

连续5年(1996～2000年)采集晋南冬麦区小麦黄矮病标样,采用生物学和血清学(酶联免疫吸附法)相结合的诊断方法对该地区的大麦黄矮病毒流行株系进行了鉴别。结果表明,该小麦黄矮病流行区近五年以GAV株系为主流株系,兼有少量GPV、PAV和混合株系存在。同时对小麦抗黄矮病新品种“临抗1号”进行了GPV和GAV两种株系的抗性测定,明确了该品种兼抗GPV和GAV两种株系。根据小麦黄矮病发生现状,提出了一套以选育推广抗耐病品种为主,以药剂防治为辅的综合防治措施。以期为当地小麦生产服务。     

蛋白质激发子Hrip1对小麦黄矮病的诱抗作用

小麦黄矮病是由大麦黄矮病毒（barley yellow dwarf virus,BYDV）引起的一种小麦病毒病,其传播介体是小麦蚜虫,在小麦生产中造成巨大的经济损失。近年来,植物诱导抗性作为一种新兴的植物病虫害防治措施引起了广泛的关注。蛋白质激发子Hrip1可以激活多种植物的免疫防御反应诱导植物产生广谱抗性。本研究评价了Hrip1对小麦黄矮病的诱抗效果。用30 μg/mL的Hrip1溶液进行小麦浸种和幼苗喷雾,随后接种BYDV,接种后第14 d,Hrip1对小麦黄矮病控制效果在50%以上,接种后第21 d控制效果仍在30%以上。实时荧光定量PCR检测结果显示,在Hrip1处理的小麦幼苗体内,BYDV外壳蛋白mRNA的数量显著低于对照组;EPG结果显示,在Hrip1处理的小麦幼苗上,麦二叉蚜寻找叶片刺吸位点和韧皮部取食位点的时间增加。以上结果表明：Hrip1能够有效地抑制BYDV在小麦体内的增殖;影响传毒媒介麦二叉蚜的取食行为,抑制其传毒能力。此外,Hrip1处理小麦能有效缓解BYDV引起的叶片黄化和植株矮化的症状。因此,Hrip1可以作为生物诱导剂综合控制小麦黄矮病。     

应用农杆菌介导法获得转大麦黄矮病毒GPV株系复制酶基因ORF2小麦植株

以生产用5种基因型小麦为材料,利用农杆菌介导法将大麦黄矮病毒GPV株系复制酶基因ORF2转化愈龄40d的幼胚愈伤组织,经过G418筛选后,共再生出9株抗性植株,拓宽了小麦农杆菌转化的受体基因型。PCR及Southern杂交分析证实大麦黄矮病毒复制酶基因ORF2已经整合到小麦基因组中。初步抗病性检测结果显示转基因植株对GPV株系具有抗性。研究结果还表明,受体基因型、外植体的生理状态对农杆菌侵染起着至关重要的作用。     

A comparative study of the Barley yellow dwarf virus species PAV and PAS: distribution,accumulation and host resistance

This study investigated the distribution and characteristics of the Barley yellow dwarf virus (BYDV) species BYDV‐PAS, which was recently separated from BYDV‐PAV, the most commonly studied BYDV species. Throughout 3 years of experimental monitoring of BYDV incidence, PAS was the most frequently occurring species infecting cereals and grasses in the Czech Republic. Furthermore, Rhopalosiphum maidis and Metopolophium dirhodum were recorded as BYDV‐PAS vectors, even though M. dirhodum does not usually transmit BYDV‐PAV. In field experiments with barley and wheat, where virus accumulation, symptoms and effect on the yield were tested, BYDV‐PAV was more severe than PAS. Infection with the BYDV‐PAV isolate resulted in greater expression of symptoms and also in a greater reduction in plant height and grain weight per spike than BYDV‐PAS. In a sensitive cultivar of barley (Graciosa), the amount of viral RNA of BYDV‐PAV was also significantly higher than that of BYDV‐PAS. In a tolerant line (Wbon‐123), however, no such differences were found. In conclusion, although BYDV‐PAS seems to be dominant in the Czech Republic, BYDV‐PAV has the potential to cause more significant crop losses in barley and wheat.     

吉林番茄黄化曲叶病毒分离物的检测及其DNA-A全基因组序列分析

从吉林省松原市田间表现黄化曲叶症状的番茄上分离到病毒分离物JLSY,基因组全序列测定结果表明,基因组全长2781 bp,共编码6个ORF。序列比对表明,JLSY基因组与番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）安徽分离物（FN650807）相似性最高,为99.5%,而与其他双生病毒的序列相似性低于89%。经系统进化分析,该病毒分离物属于TYLCV以色列株系（TYLCV-IL）。这是首次在我国吉林省检测到番茄黄化曲叶病毒。     

番茄黄化曲叶病毒在湖北首次报道

2014年春季,在湖北省武汉市发现种植的番茄表现植株矮缩,叶片上卷,叶缘黄化等症状。PCR检测结果显示,所有采集的病样中均存在菜豆金色花叶病毒属病毒。进一步通过滚环扩增方法获得了该病毒的湖北分离物HB01的全基因组。基因克隆及序列分析结果表明,该病毒基因组全长为2 781nt,与已报道的番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)各分离物同源性在89.0%以上,而与来自中国不同地区的TYLCV分离物的同源率均在97.0%以上。因此,HB01属于TYLCV的一个分离物。     

灰飞虱传播的一种小麦病毒病鉴定

 在实验室中利用灰飞虱接种小麦时出现一种新的病毒病症状,鉴定表明其病原为大麦黄条点花叶病毒(Barley yellow striate mosaic virus, BYSMV)。采用生物学测定、电镜观察、RT-PCR检测和序列分析的方法,明确了该病毒的粒体特性、危害症状及田间发生情况。接种试验表明该病毒通过灰飞虱传播,接种7~10 d后小麦新生叶片出现黄色斑点、斑驳,继而发展成黄色条纹,叶片对生且细而窄,重病株新叶扭曲,叶鞘不能伸长,病株矮化。对小麦病叶超薄切片电镜观察,发现细胞质中存在大量弹状病毒粒子,病毒粒体大小为（315~353）nm×（46~57） nm。利用特异性引物从病株总RNA中扩增出 565 bp基因片段,序列同源性分析显示与大麦黄条点花叶病毒(Barley yellow striate mosaic virus, BYSMV) Zanjan-1分离物聚合酶（L）基因对应序列的一致性为97 %,与北方禾谷花叶病毒(Northern cereal mosaic virus, NCMV) L基因对应序列的一致性为78 %~79 %。对采自河北邯郸、石家庄、保定、唐山的31株样品进行RT-PCR检测,25株检测到BYSMV,7株检测到水稻黑条矮缩病毒(Rice black streaked dwarf virus,RBSDV),其中5株为2种病毒复合侵染,结果表明BYSMV的田间分布较广。系统发育分析表明BYSMV-Lab/TS/ZX/QY 4个分离物与本研究的BYSMV亲缘关系密切。BYSMV是我国小麦上新发现的一种弹状病毒,并已形成危害,暂定名为小麦黄条纹矮缩病,应加强流行动态监测。     

231份麦类种质资源对大麦黄矮病毒的田间抗性鉴定

为明确不同麦类种质资源对大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf viruses,BYDV)的抗性差异,于2015—2016年连续两年采用堆测法在田间人工接种鉴定了231份麦类种质资源的抗病性。结果表明,不同麦类种质资源对BYDV引起的黄矮病的抗性存在较大差异,2015—2016年,克群、加麻白芒麦、墨沙、绿见口和灰木头的平均病情指数分别为20.40、22.28、23.08、22.34和13.08,对黄矮病表现出较好的抗性;团结红壳麦-K、红矮子、定兴寨、旱地小麦、小红狼、榔头麦、峥白毛、金包银、红四楞、赤壳须麦及和穗板麦的平均病情指数分别为74.68、71.62、70.36、68.44、65.17、64.74、63.29、60.97、55.78、56.42和53.21,均大于50.00,表现为高感;其余种质资源的平均病情指数在25.00~50.00之间,表现为感病。此外,长芒芒、冰糖色小麦、苏麦、红皮麦、小红穗和青兰麦初期表现感病,后期可恢复健康,有一定的耐病性。抗病性不同的麦类种质资源感染BYDV后,对产量的影响差异很大,其中抗病资源绿见口的产量损失率最低,为8.87%,耐病资源长芒芒、冰糖色小麦、苏麦、红皮麦、小红穗和青兰麦的产量损失率依次为16.90%、17.40%、15.04%、13.13%、18.94%和11.57%,而感病资源和穗板麦的产量损失率达43.57%。     

大麦黄矮病毒GPV株系ORF4基因在大肠杆菌中的表达及特异抗血清的制备

 根据已报道的大麦黄矮病毒GPV株系(BYDV-GPV)相关基因序列设计合成引物,利用RT-PCR方法获得ORF4基因,并将其克隆到原核表达载体pET-5a中。经IPTG诱导、SDS-PAGE分析,结果表明:ORF4基因在大肠杆菌BL21(DE3) pLysS中获得了高效表达,分子量为17 kDa。以回收的表达产物为抗原免疫家兔,制备了BYDV-GPV 17kDa蛋白的特异性抗血清。Western blot检测结果,制备的抗血清可用于检测BYDV-GPV侵染后在燕麦体内表达的17 kDa蛋白。