Ri质粒的快速提取及rolC基因的克隆

介绍Ri质粒的快速提取方法，提取的质粒可用于目的基因的扩增，应用rolC基因的特异性引物，扩增出了正确序列的rolC基因0．87kb片段，并利用pGEM—T栽体对此片段进行了克隆。     

发根农杆菌rolC基因的克隆及序列分析

以发根农杆菌30148为材料,设计了rolC基因的特异性引物,应用PCR技术,扩增出了正确序列的rolC基因585 bp片段,并利用pUCm-T载体对此片段进行了克隆,并进行了序列分析。所克隆rolC基因与已发表的序列相比较,核苷酸序列的同源性达到100%,但另一个克隆中部分碱基发生了改变,同源性达到99%。     

Ri质粒转化烟草影响因素的研究

Ri质粒转化烟草形成发状根的效率，受发根农杆菌种类、浓度、生理状态及烟草品种、叶片发育时期、叶片在菌液中浸泡时间、共培养时间、基本培养基及pH值、乙酰丁香酮不同加入方式等多种因素的影响．采用稀释5倍的处于对数生长期的ATCC15834菌株，感染Sumxun无菌苗幼嫩叶圆片5min，在pH值5，8的MS培养基上共培养2d，可达最大转化效率93.1％     

Ri质粒介导TMV和CMV外壳蛋白基因转化烟草的研究

 利用发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）Ri质粒介导的二元载体法，将pBTC-8质粒上的TMV-cp和CMV-cp基因导入烟草中。采用烟草叶片与农杆菌菌液共培养的方法，诱导出毛状根，经卡那霉素抗性筛选，进一步诱导出愈伤组织并分化再生出完整植株，转化根和植株表现卡那霉素抗性并检测到冠瘿碱的存在。PCR扩增和DNA斑点杂交的结果证明了TMV和CMV外壳蛋白基因已导入到烟草中，同时利用斑点免疫结合法的血清学实验，检测到转化株中有TMV-cp和CMV-cp基因的产物，从而进一步证明了TMV-cp和CMV-cp基因在转化的烟草中得到表达。     

Ri质粒介导西洋参高效转化体系的建立

由Ri质粒介导对西洋参叶片进行遗传转化,获得西洋参发根,并且对诱导发根的影响因素进行研究,建立了西洋参高效转化体系,为利用生物技术生产和提高西洋参中所含中药成分的研究奠定基础.     

rolC基因对转Ri质粒三倍体毛白杨的遗传转化

通过对Ri质粒转化三倍体毛白杨植株转入rolC基因,使外源基因rolC在植物体内形成多拷贝,从而对rolC基因表达产生干扰,而减少Ri质粒转化三倍体毛白杨造成的不良形态变异.本研究建立了转Ri质粒三倍体毛白杨的叶片再生体系,筛选出叶片再生的最佳培养基为:MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1;确定了卡那霉素(Km)和抑菌抗生素头孢噻肟钠(CTX)的临界浓度为30 mg·L-1和400 mg·L-1;采用农杆菌介导的叶盘法,将rolC基因转入经发根农杆菌Ri质粒30148转化的三倍体毛白杨植株中,获得了18个Km抗性系,对其中14个株系进行了PCR检测,表明rolC基因已整合进再生植株中.与转Ri质粒三倍体毛白杨和未转基因三倍体毛白杨相比,部分转Ri质粒三倍体毛白杨在转rolC基因后发生了形态特征变异,比如部分无性系的叶片由原来的皱缩变为平展,部分无性系的茎由原来的直立变为弯曲,侧枝增多,节间距明显缩短.     

发根农杆菌Ri质粒的特征及其应用

发根农杆菌（Agmbacterium rhizogenes）的Ri质粒能够诱导植物产生毛状根。就发根农杆菌Ri质粒的发现、类型、结构、遗传转化等基本特征以及诱导植物产生毛状根的方法、鉴定技术和形成机制进行阐述;同时对诱导植物毛状根产生次生代谢物质的研究现状进行综述。     

Ri质粒转化银杏及影响其产生黄酮的研究

本研究用R i质粒转化银杏获转化根及转化愈伤组织。通过southern杂交证实为转化愈伤组织,并且研究不同培养条件对转化愈伤组织产生次级代谢物黄酮的作用。     

稀土元素铕对掌叶大黄Ri质粒转化根生长及蒽醌类成分的影响

试验研究了不同质量浓度的稀土元素铕(Eu3 )对掌叶大黄单克隆毛状根DH5c、DH7a和非转化根Nor生物量、蒽醌化合物合成的影响。结果表明:Eu3 浓度对不同类型大黄根的生物量积累作用效果不同。Eu3 对非转化根Nor和转化根DH7a的生物量积累有抑制作用,低浓度的Eu3 对转化根DH5c生物量积累有促进作用。Eu3 浓度对不同类型大黄根的蒽醌产量有不同影响。单克隆毛状根DH7a在Eu3 为0.1 mg/L和0.05 mg/L时蒽醌产量最高。经Eu3 处理的3种类型大黄根中芦荟大黄素和大黄酸高于大黄素、大黄酚和大黄素甲醚。     

大肠杆菌质粒DNA提取方法的优选

采用酚/氯仿少量提取法、异丙醇沉淀法、简便快速的煮沸法以及微波炉法提取细菌质粒,然后分别对各种方法所提取的质粒进行琼脂凝胶电泳分析,并用紫外分光光度计测定其OD值,对各种方法的优劣性进行全面分析,结果表明异丙醇提取法所提取的质粒DNA纯度和产量高(其DNA片段荧光较强,具有清晰的亮带,OD260/OD280约为1.77,DNA样品浓度约为195μg/mL),且重复性好,具有结果稳定的特点,达到了分子生物学试验要求,适合大多数试验室使用。     

质粒转化药用植物的研究进展

本文对Ri质粒的结构、转化机制、转化方法、发根的生长与鉴定及运用这一技术获得药用植物次生代谢产物的研究进展作了简要概述。     

猪传染性胃肠炎病毒N蛋白基因的克隆及其原核表达载体的构建

以本实验室从河北分离到的TGEV毒株,采用RT-PCR技术扩增了TGEV N基因,长为1149bp,并进行亚克隆重组到pMD18-T质粒载体上,连接,转化,鉴定后得到阳性重组质粒．命名为pTN．将重组质粒插入的片段进行序列分析和比较,结果表明TGEV河北分离株N基因与国外的Purdue-115、FS772/70、TO14、96-1933株均具有较高的同源性,达95％以上。推导的氨基酸序列同源性为95％以上。并将目的基因与原核表达载体pGEX-4T-3重组,成功构建了原核表达载体pGEX-N。pGEX-N表达载体的构建,为其蛋白质的表达提供重要依据。     

犬传染性肝炎病毒Hexon蛋白基因的克隆和原核表达质粒的构建

通过设计特异性引物,以犬传染性肝炎患犬的全血基因组DNA为模板,经PCR扩增,获得了犬传染性肝炎病毒Hexon蛋白基因,将其插入到pMD18-T载体进行测序、鉴定,构建原核表达质粒载体pGEX-6p-1-Hex-on。结果显示,犬传染性肝炎病毒Hexon基因已被成功地克隆,基因全长2 718 bp,包含从起始密码子ATG到终止密码子TAA的完整序列。与犬传染性肝炎病毒国际标准株Hexon蛋白基因的同源性为99.7%,通过实验鉴定表明pMD18-Hexon克隆载体和原核表达质粒载体pGEX-6p-1-Hexon已成功构建。     

猪伪狂犬病病毒GZ-Z1株gE基因原核表达质粒的构建

为给猪伪狂犬病病毒的诊断及防治提供科学依据,参考GenBank中猪伪狂犬病病毒(PRV)gE基因序列,设计1对特异性引物,以PRV GZ-Z1株DNA为模板,进行gE基因的PCR扩增,扩增产物与pMD18-T载体连接、鉴定正确后,再亚克隆至pET32a(+)原核表达载体中,经鉴定后测序。结果表明:目的片段为PRV gE基因完整开放阅读框,大小1 734bp,编码577个氨基酸,在pET32a(+)载体中位置正确,表明,pET32a-gE原核表达质粒构建成功。该基因与国内外其他18株PRV的gE基因推导氨基酸序列同源性为94.8%～98.6%;与国外分离株属同一个进化分支,遗传关系相对较近;而与国内Fa、Min、GDSH等毒株亲缘关系较远。     

鸡PTH基因克隆、序列测定及其真核表达质粒的构建

采集200日龄产蛋期新扬州鸡甲状旁腺组织,提取RNA并进行反转录聚合酶链反应（RT—PCR）,扩增产物进行T—A克隆、测序。序列测定结果表明：胛HcDNA核苷酸长度为360bp。与GenBank上发表的鸡序列比较,核苷酸同源性为99．6％,在第159位处存在C→A的有意义突变。与从GenBank下载读取的牛、马、人、狗、猫、食蟹猴PTH基因序列进行比较分析,同源性分别为51．4％、50.8％、50．6％、50.3％、50．3％和46．9％。将该基因片段克隆到真核表达载体pCEP4,构建重组质粒pCEP4-PTH,所获重组质粒经过酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确,为利用pCEP4-PTH调控机体钙代谢、改善蛋鸡生产性能和蛋壳质量的研究应用奠定了基础。     

猪β2肾上腺素能受体基因克隆及穿梭表达质粒的构建

【目的】利用重组β₂肾上腺素能受体（β₂AR）检测β₂激动剂类药物,是弥补传统免疫学检测方法不足、实现该类违禁物多残留的快速检测手段。获得高纯度、高亲和力的重组受体是该技术的核心和难点。本文克隆猪β₂ AR并构建其重组穿梭表达质粒,为筛选最适宜的受体表达系统和表达条件提供基础材料。【方法】克隆猪β₂AR并进行序列分析,完成重组穿梭表达质粒构建。首先采集新鲜猪肝组织,提取总RNA,根据GenBank已登录的猪β₂AR核苷酸序列（AF000134）,设计1对引物并进行RT-PCR扩增。扩增产物切胶回收后与pMD-18T载体于4℃、T4连接酶作用下连接过夜。连接产物转化DH5α感受态细胞,经蓝白斑筛选后提取克隆质粒并对其作PCR鉴定、双酶切鉴定及测序分析。然后对所获得的基因及编码的氨基酸序列进行在线BLAST分析、系统进化树构建和疏水性分析。为了提高受体蛋白的表达量及受体配体间的亲和力,对该克隆基因作N端截短186个核苷酸改造;为使表达蛋白C端携带6×His标签,对克隆基因C端进行去除终止子改造。将改造后的克隆基因分别插入pTriEx-1.1 Hygro穿梭表达载体,连接产物转入NovaBlue感受态细胞,经Amp抗性筛选,挑取单菌落提取质粒并进行鉴定。【结果】经分光光度计检测及琼脂糖凝胶电泳分析,所提猪肝细胞总RNA的纯度、浓度及完整性可满足后续试验要求。RT-PCR产物电泳结果显示,在1 200 bp 左右出现1条特异性条带,与预期结果一致。克隆质粒pMD-18T-β₂AR经鉴定,证实为阳性重组质粒。测序结果显示,所得猪β₂AR基因cDNA序列全长1 257 bp,编码418个氨基酸。该序列已提交至GenBank,登录号为KF023571.1。Compute pI/Mw在线软件预测该蛋白分子质量为46.73 kD。与已发表的猪β₂AR（AF000134）相比,基因序列一致性为99.68%,4处发生碱基突变,编码的氨基酸序列一致性为99.28%,3处发生突变,且配体与受体结合位点处的氨基酸均得到正确克隆。在线BLAST分析表明,猪与其它物种的β₂AR及氨基酸序列一致性均在80%以上,具有较高的同源性。由系统进化树分析可知,所克隆的猪β₂AR与领西猯Pecan tajacu（JN 633666.1）的亲缘性较近,与大仓鼠Tscherskia triton（AY683091.1）和草原田鼠Microtus ochrogaster（XM 005356183.1）的亲缘性较远。氨基酸疏水性分析表明,该受体蛋白N端以疏水性氨基酸为主,C端以亲水性氨基酸为主。经PCR和双酶切鉴定以及测序分析证明,成功构建重组穿梭表达质粒pTriEx-1.1Hygro-β₂AR1-418和pTriEx-1.1Hygro-β₂AR63-418。【结论】所获克隆基因与已发表猪β₂AR高度一致,且活性位点处的氨基酸均得到正确克隆。此外,pTriEx-1.1 Hygro穿梭表达载体适宜用作大肠杆菌、昆虫细胞和哺乳动物细胞表达系统的启动子,是研究目标基因在不同表达系统表达效果的良好材料。本文所构建的穿梭表达质粒pTriEx-1.1Hygro-β₂AR1-418和pTriEx-1.1Hygro-β₂AR63-418均可用于以上3种表达系统中β₂AR蛋白的表达纯化研究。