马铃薯转基因受体系统的建立

以马铃薯（Solanumtuberosum L.）“Wen-40”和“紫花白”2个品种的茎段和叶片为外植体,通过离体培养分化成苗以及对卡那霉素（Km）和头孢霉素（Cef）的敏感性研究,建立了农杆茵介导的稳定、高效的基因转化受体系统。结果表明：“Wen-40”的茎段适合转基因高效再生体系的建立,而25 mg.L^-1的Km适合转基因植株的抗性筛选,低于200 mg.L^-1的Cef浓度对马铃薯的诱导分化影响较小。     

细胞分裂素生产菌提高马铃薯抗旱性的生理生化特性研究

以马铃薯合作–88为材料,通过向土壤中分别加入巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌溶液,结合水分亏缺灌溉(DI)进行土壤盆栽试验,比较水分亏缺状态下细胞分裂素生产菌处理对马铃薯幼苗农艺性状、生理生化特性的影响。结果表明：加入细胞分裂素生产菌后,马铃薯的水分利用率及其抗旱特性比对照均有显著提高,加入枯草芽孢杆菌后,马铃薯的根长、根干重、根系活力和干物质储存量均比加入巨大芽孢杆菌的要高。     

马铃薯成熟花粉原生质体分离

 初步研究了马铃薯成熟花粉原生质体的分离条件,首次采用"低温-萌发-酶解"三步法从马铃薯成熟花粉中分离出原生质体。其分离途径是：经6℃低温处理的成熟花粉在萌发液中萌发出短花粉管时转入酶液。在酶液作用下,花粉发生质壁分离,花粉管脱落,随后原生质体缓慢地从花粉管断裂处挤出。在萌发30 min和1.0 mol·L-1甘露醇渗透压下,原生质体分离效果最佳,分离率最高达19.40%。用0.1%荧光增白剂检测脱壁完全,FDA荧光检测表明花粉原生质体具有生活力。     

马铃薯小孢子原生质体游离的影响因素

以马铃薯减数分裂四分体时期的小孢子为材料,研究了小孢子原生质体游离的主要影响因素。结果表明：用1 % 蜗牛酶+1.2 % 纤维素酶+0.5 % 半纤维素酶的混合酶液能大量游离出经低温预处理的马铃薯四分体小孢子原生质体,原生质体的最高产率达78.05 %;2-N吗啉乙烷磺酸 (MES) 对小孢子原生质体有一定的保护作用。0.1 % 的荧光增白剂鉴定脱壁完全,0.01 % 的FDA荧光检测表明原生质体具有生活力。     

辣椒CaCBF1A基因的克隆及非生物胁迫下表达分析

为揭示Ca CBF1A基因在辣椒抗逆机制中发挥的功能,对辣椒Ca CBF1A基因进行克隆与分析。以豫椒101为材料,根据参考基因组序列设计引物,通过PCR技术从辣椒基因组c DNA中获得CBF基因Ca CBF1A。经生物信息学分析,该基因具有一个完整的ORF(471 bp),编码156个氨基酸。Ca CBF1A编码的蛋白质包含保守的AP2 DNA结合域。对其亚细胞定位、跨膜结构进行分析,预测其定位在叶绿体中,存在跨膜结构。荧光定量PCR检测结果表明,低温、高温和盐胁迫均可诱导Ca CBF1A基因的表达,其表达量在迅速达到峰值后又降低,说明Ca CBF1A是一个逆境胁迫快速响应基因,推测其在辣椒抗逆机制中起着重要的作用。     

马铃薯茎尖组织培养及快速繁殖技术研究

以豫马铃薯 1号 (郑薯 5号 )和津引 8号马铃薯为外植体 ,应用不同的培养基对马铃薯茎尖进行组织培养 ,以所获得的无毒苗为材料进行快速繁殖研究 .结果表明 ,豫马铃薯 1号外植体在MS BA 2mg·L-1 NAA 0 .1mg·L-1 GA30 .1mg·L-1 蛋白胨 10 0mg·L-1培养基上成苗率较高 ;津引 8号马铃薯在MS BA 1.5mg·L-1 NAA 0 .1mg·L-1 GA30 .1mg·-1 蛋白胨 10 0mg·L-1培养基上成苗率较高 ;而 1/ 2MS IBA 0 .3mg·L-1,1/ 2MS IAA 0 .5mg·L-1培养基适宜于豫马铃薯 1号无毒苗的快速繁殖 ;1/ 2MS IBA 0 .3mg·L-1,1/ 2MS IAA 0 .3mg·L-1培养基适宜于津引 8号无毒苗的快速繁殖 .     

马铃薯StKN1基因的cDNA克隆与分析

植物同源异型枢基因(Homeobox gene,HBG)广泛存在,是一类重要的转录因子编码基因,在生物进化中具有很强的保守性。利用GenBank登录的拟南芥、苜蓿、豌豆、烟草、番茄等同源异型枢基因保守区序列设计简并引物,通过RT-PCR技术,从马铃薯萌动的幼芽中获得了一个homeobox的cDNA基因,命名为StKN1,GenBank登录号为DQ494855.1。该基因片段长971 bp,经序列分析比对,与其他植物的HBG具有很高的序列相似性。系统进化分析将StKN1基因归入homeobox KNOX基因家族。     

茄子生长素响应因子SmARF8的克隆与分析

 【目的】克隆茄子生长素响应因子新基因,为研究茄子果实形成发育的分子机制提供依据。【方法】采用RT-PCR 和RACE 技术克隆茄子ARF家族相应基因的cDNA全长序列。经序列联配进行与其它物种同源基因的保守域和进化关系分析。实时定量PCR 检测目的基因在茄子不同组织中的表达情况。【结果】将该基因命名为SmARF8,它的cDNA序列全长为3 671 bp,编码阅读框全长2 676 bp。氨基酸序列分析表明,SmARF8蛋白拥有核定位序列,蛋白质结构具有ARF家族的N-端DNA结合域,中间脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基富集的非保守调控域,C-末端蛋白互作域。氨基酸与拟南芥的调控单性结实基因ARF8相似性较高,进化树分析表明它们聚集在一个分支上,进化关系非常密切。SmARF8基因在幼果中表达最强,在根、茎、叶、花蕾、花朵及成熟果实中表达较强烈。【结论】从茄子中克隆得到一个生长素响应因子家族基因SmARF8。     

不同马铃薯种质资源的遗传多样性分析

[目的]分析我国南方冬种马铃薯种质资源的遗传多样性,为选育南方冬种马铃薯新品种及生产利用提供参考.[方法]对24份马铃薯种质资源的13个质量性状和12个数量性状进行调查及测定,并进行遗传多样性分析和聚类分析.[结果]24份马铃薯种质资源质量性状的遗传多样性指数均较高,为0.7415~2.3303,其中以薯形最高,以株型、叶缘形状和顶小叶形状较低.24份马铃薯种质资源的数量性状变异系数为0.70%~188.16%,其中以单株块茎重最高,其次为单株蔓重,说明其变异程度较大,易出现性状分离;以比重最低,表明马铃薯出苗率的性状在种质间较稳定.相关性分析结果表明,24份马铃薯种质资源的生育期与单株蔓重、平均产量呈极显著正相关(P<0.01,下同),与小叶对数呈极显著负相关;株高与单株块茎重、单株蔓重呈极显著正相关,与单株主茎数呈显著负相关(P<0.05,下同);单株蔓重与单株块茎重、平均产量呈显著正相关;单株块茎数与小叶对数呈显著正相关,与商品薯率呈极显著负相关;出苗率与平均产量呈显著正相关,与小叶对数呈极显著负相关;比重与块茎干物质量呈极显著正相关,与平均产量呈显著负相关.聚类分析结果表明,24份马铃薯种质资源可分为高产高株型、中产中株型、低产中株型和低产低株型四大类,以中产中株型为最多,以高产高株型最少.[结论]24份马铃薯种质资源具有丰富的遗传多样性,其中有2份属于高产高株型(闽08085008和闽09330143),可作为选育南方冬种高产马铃薯新品种的亲本材料.     

马铃薯花粉离体萌发及花粉管生长影响因子分析

[目的]研究马铃薯花粉离体萌发及花粉管生长的影响因素。[方法]采用花粉离体萌发技术,研究不同浓度蔗糖和PEG4000组合,无机盐Ca^2＋、K^＋、Mg^2＋、Na^＋、Zn^2＋以及植物生长调节剂6-BA、NAA等对马铃薯花粉萌发和花粉馁生长的影响。[结果]结果表明,马铃薯花粉萌发及花粉管生长最适宜的液体培养基为蔗糖10％＋PEG4000 10％＋Ca（NO3）2 0．02％＋H3BO3 0．02％＋K^＋0．500mmol／L,其萌发率最高可达89．6％,在此基础上添加低浓度的Mg^2＋、Na^＋能促进花粉萌发和花粉管生长。1mg／L6-BA对花粉萌发和花粉管生长有一定的促进作用,特别是对花粉管生长有显著的促进作用;NAA对马铃薯花粉萌发和花粉管生长无积极影响,相反高浓度还产生严重的抑制作用。[结论]该研究结果为进一步地研究马铃薯生理特性提供基础资料。     

虾肝肠胞虫水通道蛋白基因 EHP00_492 的克隆与表达特征分析

【目的】克隆虾肝肠胞虫（Enterocytozoon hepatopenaei,EHP）水通道蛋白编码基因 EHP00_492,分析其在 EHP 成熟孢子中的表达特征,为研究 EHP 水通道蛋白的功能提供理论基础。【方法】以虾肝肠胞虫为材料,克隆获得完整的 EHP00_492 基因,对其进行序列特征分析,构建 pCold-TF-EHP00_492 重组表达载体,转化至大肠杆菌中异源表达重组蛋白,制备兔多克隆抗体。利用蛋白免疫印迹实验和间接免疫荧光实验分析 EHP00_492 在 EHP 成熟孢子中的表达定位特征。 【结果】 EHP00_492 的编码基因全长 729 bp,由 242 个氨基酸组成,富含亮氨酸,预测分子量为 25 kD,无信号肽,含有 6 个跨膜结构域,具有 MIP 蛋白家族结构域和 2 个水通道蛋白保守的 NPA/G 基序。此外,EHP00_492 与其他微孢子虫水通道蛋白序列同源性较高,系统进化树分析结果显示,EHP00_492 与毕氏肠胞虫 EBI_27080 蛋白亲缘关系最近。AlphaFold 分析发现,EHP00_492与已鉴定的家蚕微孢子虫水通道蛋白 NbAQP 和兔脑炎微孢子虫水通道蛋白 EcAQP 的蛋白质三维结构高度相似,推测 EHP00_492 是一个潜在的水通道蛋白。蛋白免疫印迹结果显示,EHP00_492 蛋白在 EHP 成熟孢子中有表达,分子量为 21 kD。亚细胞定位分析结果显示,EHP00_492 蛋白定位于 EHP 成熟孢子的孢壁上。【结论】初步明确了 EHP00_492 蛋白的序列特征、结构特征及其与其他微孢子虫水通道蛋白的亲缘关系,以及其在 EHP 成熟孢子中的表达定位特征,可为进一步研究 EHP 水通道蛋白的功能提供基础。     

紫色马铃薯查尔酮合成酶基因(CHS)的克隆及分析

【目的】从紫色马铃薯中克隆CHS的cDNA全长序列,并分析其组织表达水平以及诱导剂处理后基因的表达与花青素含量积累之间的关系。【方法】采用RT-PCR和RACE方法克隆紫色马铃薯CHS的cDNA全长序列,通过在线软件进行核苷酸序列和氨基酸序列分析,半定量RT-PCR检测StCHS在紫色马铃薯组织中的表达特异性以及蔗糖和赤霉素处理后StCHS的表达。采用分光光度计法测定紫色马铃薯花青素含量。【结果】克隆获得紫色马铃薯CHS的cDNA全长1 490 bp,包含1 170 bp的ORF,该基因编码389个氨基酸。推测StCHS蛋白含有Cys164、Phe215、His303和Asn336 4个活性位点,构成CHS蛋白的催化中心。StCHS的表达具有组织特异性,在茎、叶柄和叶中表达较强,在根、块茎和叶轴中几乎检测不到CHS的表达。赤霉素能促进CHS的表达从而促进花青素的积累;蔗糖能够显著促进紫色马铃薯花青素的积累,但对CHS的表达影响不明显。【结论】从紫色马铃薯中克隆获得CHS的cDNA全长序列,该基因表达具有组织特异性,StCHS是紫色马铃薯花青素合成途径中的一个限速酶基因。     

不同施钾量对马铃薯养分吸收及产量、品质的影响

在田间试验条件下设置K1（K2 O为0 kg/hm2）、K2（ K2 O为75.00 kg/hm2）、K3（K2 O为112.50 kg/hm2）3个处理,研究了钾肥对马铃薯养分吸收和品质的影响。结果表明,在收获期,马铃薯干物质积累量K3处理最高,分别比K1、K2处理提高42.16％、37.29％;氮吸收量K1、K2、K3处理分别达到220.39、235.31、306.46 kg/hm2;磷吸收量以 K3处理最高,比 K2处理提高20.38％;钾吸收量以K3处理最高,分别比K1、K2提高64.44％、26.14％。产量以K3处理最高,分别比K1、K2处理提高97.48％、44.47％。随着施钾量的增加还原糖含量呈现增加趋势,维生素C含量呈现降低趋势。综合分析认为,黑龙江马铃薯栽培地区钾肥用量以112.50 kg/hm2为宜。     

枇杷质膜水孔蛋白基因EjPIP1的克隆及AM真菌对其表达的影响

【目的】克隆‘早钟6号’枇杷（Eriobotrya japonica ‘Zaozhong 6’）的一个质膜水孔蛋白（plasma membrane intrinsic protein,PIP）基因,分析其序列特征,研究接种丛枝菌根（Arbuscular mycorrhizal,AM）真菌对枇杷水分利用效率（water use efficiency,WUE）及对质膜水孔蛋白基因表达模式的影响。【方法】以‘早钟6号’枇杷实生苗为材料,通过盆栽试验,设置2个处理（AM和NM）,5个重复,利用光合测定系统对叶片水平上水分利用效率进行测定;采用RT-PCR和RACE技术克隆该基因的cDNA全长,结合生物信息学软件对其序列特征进行分析,利用实时荧光定量PCR（Real time-PCR）分析接种AM真菌后该基因在枇杷叶片和根中的表达模式。【结果】在有效的光合同化时间（7：00-17：00）内,接种AM真菌显著的提高了枇杷的水分利用效率。克隆得到枇杷质膜水孔蛋白基因EjPIP1（GenBank登录号：JX041627）,cDNA全长为1 142 bp,编码区含861 bp,共编码286个氨基酸。氨基酸序列分析表明,EjPIP1具有水孔蛋白家族高度保守的2个NPA（Asn-Pro-Ala,天冬氨酸-脯氨酸-丙氨酸）基序。同源性分析显示,枇杷EjPIP1氨基酸序列与已报道的苹果（Malus domestica）、桃（Prunus persica）和智利草莓（Fragaria chiloensis）等高等植物的氨基酸序列同源性很高,分别为97%、92%和90%。Real time-PCR分析结果证实,EjPIP1在枇杷叶片和根中均有表达,并且叶片中的相对表达量略高于根中。正常供水条件下,接种AM真菌后,该基因在根中表达上调,在叶片中表达下调。【结论】接种AM真菌提高了‘早钟6号’枇杷叶片水平上水分利用效率。从枇杷叶片中克隆得到了一个质膜水孔蛋白类的基因EjPIP1,实时荧光定量PCR分析表明该基因在枇杷叶片和根中表达受AM真菌的影响,该基因的表达模式有利于提高AM植株的水分利用效率。     

甘蓝型油菜生物节律钟输出基因BnGI的克隆和表达分析

利用同源克隆的方法,以拟南芥GIGANTEA基因为种子序列,在甘蓝型油菜中克隆得到GI基因,命名为BnGI。序列分析结果表明:该基因编码区全长为3 516bp,编码1 171个氨基酸,与白菜GI基因序列同源性达99%,与拟南芥GI基因同源性达87%。成熟蛋白的等电点为6.59,分子量为127.15kDa,亚细胞定位预测在细胞核定位。荧光半定量检测结果表明:BnGI基因在根、茎、顶端分生组织、叶、花等中均有表达,但表达水平具有组织特异性。     

青海省马铃薯黑胫病病原菌的鉴定

为明确引起青海省马铃薯黑胫病的病原菌,从青海省不同地区马铃薯黑胫病病样分离病原菌,研究病原菌的形态学特征、致病性、生理生化特性,并结合16S rRNA序列进行病原学鉴定。结果表明:引起马铃薯黑胫病的5个菌株均为黒腐果胶杆菌(Pectobacterium atrosepticum),来源不同的菌株接种马铃薯后致病力有差异;其中,3株强致病力菌株主要来自于乐都、湟中和大通,2株中等致病力菌株来自于民和和湟源。综上,黒腐果胶杆菌是引起青海省马铃薯黑胫病的病原菌。     

海岛棉GbHCT10基因的克隆与表达分析

[目的]研究海岛棉(Gossypium barbadense)GbHCT10基因在棉纤维发育中的作用.[方法]以海岛棉品种新海21号纤维发育第5 d的样本作为材料,根据海岛棉GbHCT10基因序列设计一对引物,利用RT-PCR技术从中克隆GbHCT10核苷酸序列.利用生物信息学方法分析GbHCT10基因序列.[结果]采...     

马铃薯衰老相关基因的电子克隆与生物信息学分析

利用电子克隆获得马铃薯衰老相关基因(StSAG)的cDNA序列,并对其进行生物信息学分析.结果表明,马铃薯衰老相关基因的cDNA序列全长1 062 bp,包含一个561 bp的开放阅读框,编码186个氨基酸;StSAG的等电点为7.20,为亲水叶绿体蛋白,无信号肽,有12个磷酸化位点,在N末端有一个较短的伸展肽段.StSAG与茄科植物烟草亲缘关系最近.     

油菜BnICE1的克隆及表达分析

【目的】从超强抗寒油菜品种陇油6号中克隆抗寒转录因子BnICE1,并对其进行序列特征分析,研究BnICE1在低温胁迫下表达水平的变化,探讨BnICE1对油菜耐低温胁迫能力的影响。【方法】利用RACE技术获得油菜BnICE1全长的cDNA序列。对该序列进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR研究BnICE1低温及不同组织表达量。【结果】cDNA片段全长1 737 bp,包含1 500 bp完整的开放阅读框,该基因编码499个氨基酸残基,分子量53.2 kD,等电点5.0。序列比对表明,该蛋白C端含有一个典型的bHLH结构域,与其它植物的ICE1蛋白具有较高的同源性,因此命名为BnICE1（GenBank登录号为JF268687）。进化树分析表明,BnlCE1同羊草和白菜亲缘关系较近。实时荧光定量PCR结果表明,该基因在油菜茎、叶和下胚轴均有表达,下胚轴中表达量最高,同时该基因的表达受低温胁迫诱导。【结论】从油菜中克隆了抗寒基因BnICE1,实时荧光定量PCR分析表明其在油菜适应低温胁迫的过程中发挥作用。