科技文摘

正胡萝卜抗冻蛋白AFP基因的克隆与序列分析以胡萝卜幼苗为材料,提取基因组DNA,根据GenBank中的已知序列设计引物,利用聚合酶链式反应技术(PCR)体外扩增获得胡萝卜抗冻蛋白基因(AFP),将其连接到pGEM-Teasyvector载体上,并对其进行生物学信息分析。结果表明:克隆的AFP基因片段全长1…206…bp,…其中编码区长1026…bp,共编码341个氨基酸,蛋白质分子量为38.048…ku,等电点为5.43,该蛋白为亲水性分泌型蛋白,有信号肽存在;其蛋白质二级结构以α-螺旋、β-折叠和无规卷曲为主。与GenBank中(A91926.1)     

白菜β-1,3 - 葡聚糖酶基因cDNA的克隆及序列分析

 以白菜抗霜霉病品种‘雪克青’cDNA 为模板, 采用RT2PCR 技术, 获得了1032 bp 的β- 1,3- 葡聚糖酶基因的cDNA 序列。序列分析表明, 克隆的β- 1,3 - 葡聚糖酶基因cDNA 序列编码343 个氨基酸, 与芜菁bg1 基因具有98 %的同源性, 与拟南芥bg2 基因具有84%的同源性。在GenBank 中登录号为AY395720 。     

银耳α–微管蛋白基因的克隆及序列分析

 根据GenBank上已发表的其他真菌α–微管蛋白基因序列中的保守区域设计简并引物,扩增出银耳α–微管蛋白基因的cDNA部分序列。分别利用SEFA-PCR方法和RACE技术,克隆了银耳α–微管蛋白基因的DNA和cDNA全长序列。银耳α–微管蛋白基因DNA全长1 962 bp,含有9个内含子,cDNA全长1 347 bp,编码448个氨基酸。生物信息学分析结果表明：银耳α–微管蛋白基因的cDNA序列与新型隐球酵母有80%相似性,编码的蛋白质属于Tubulin_FtsZ超家族中的α–微管蛋白亚家族,氨基酸序列中存在保守的GTP结合区域GGGTGSG,系统发育树显示银耳与新型隐球酵母距离最近。     

三七RNase-like 基因的克隆及表达分析

 采用同源序列克隆法,结合RACE 技术,从三七[Panax notoginseng（Burk.）F.H]根茎总RNA 中克隆次生代谢相关差异表达RNase-like 贮藏蛋白的编码序列,并进一步以DNA 为模板扩增全长基因, 获得一条开放阅读框为717 bp 的cDNA 序列,命名为PMP（GenBank,KC751542),相应基因全长1 074 bp。序列及其进化分析表明,该基因包含3 个外显子和2 个内含子,编码238 个氨基酸,相应蛋白质的 分子量为27.47 kD,含有核苷酸结合的保守区域,属于RNase-T2 超家族成员。三七PMP 蛋白与人参 RNase-like 贮藏蛋白高度同源,序列相似性达95%。实时荧光定量PCR 研究表明,三七PMP 基因在其根、 茎、叶、花等器官中均有表达,且3 年生根中表达量最高,暗示该基因可能参与三七皂苷次生代谢调控 及其品质形成。     

香菇乳清酸核苷-5'-单磷酸脱羧酶编码基因le-pyrG的克隆

通过巢式简并PCR和基因组步行技术从香菇(Lentinula edodes)单核体中克隆到乳清酸核苷-5′-单磷酸脱羧酶(orotidine-5'-monophosphate decarboxylase,OMPDC)的编码基因le-pyrG,长度为946 bp.经生物信息学分析,香菇le-pyrG基因含有2个长度分别为67 bp和51 bp的内含子,该基因可以编码1个含有275个氨基酸残基的蛋白质序列,该序列经比对分析显示与裂褶菌(Schizophyllum commne)和灰盖鬼伞(Coprinus cinereus) OMPDC序列的相同性分别为73%和70%,相似性分别为84% 和83%.这是首次报道从栽培食用真菌中克隆出乳清酸核苷-5′-单磷酸脱羧酶编码基因的全序列.     

板栗颗粒型淀粉结合酶基因cDNA的克隆与生物信息学分析

以板栗为试材,采用RT-PCR技术,克隆了颗粒性淀粉结合酶(GBSS)的基因,并进行了生物信息学分析。结果表明:从板栗果实中分离了GBSS基因cDNA全长,命名为Cgbss,登录GenBank号为KU162945。该基因全长2 085bp,编码区全长为1 836bp,编码611个氨基酸。生物信息学分析表明该基因编码的蛋白质等电点和分子量为8.36和67.580 9kDa,含有典型的GT1家族的糖基转移酶蛋白功能域。序列分析表明,该基因与所报道的植物GBSS I的基因有85%的同源性。     

龙眼胚胎F3H基因的cDNA克隆及序列分析

采用IEF-SDS-PAGE双向电泳技术,对‘立冬本'龙眼合子胚发育不同时期的蛋白质进行分离,通过MALDI-TOF-TOF鉴定到其中一个上调差异表达的蛋白为黄烷酮-3-羟化酶 (flavanone 3-hydroxylase,F3H)。以‘立冬本’龙眼胚胎cDNA为模板,采用RT-PCR和RACE技术,获得F3H基因cDNA 1 404 bp全长序列。序列分析表明,F3H基因共编码365个氨基酸,其cDNA序列与柑橘、苹果、棉花等F3H基因的同源性均高达80%以上,该基因在GenBank中登录号为EF468104。     

青花菜快速碱化因子RAL F 的克隆与序列分析

 以一个与甘蓝显性核不育相关的差异表达片段序列为信息探针, 在NCBI与TAIR网站数据库中进行同源EST序列搜索, 经人工拼接、RT - PCR克隆与序列分析验证, 获得了青花菜快速碱化因子RALF(Rapid Alkalinization Factors) 基因的cDNA全长序列, 命名为BoRALFL1 (GenBank序列登录号DQ059310)。该cDNA全长240 bp, 编码79个氨基酸, 与电子克隆获得的序列完全相同。序列分析表明, 编码蛋白存在前导信号肽与多个磷酸化位点, 与同源基因RALFL8核酸序列在88 bp上有82%的一致性, 推导的氨基酸序列在74个氨基酸上存在56%的一致性, 不同植物间氨基酸序列N - 端差异大, C - 端具有较高的保守性。     

柑橘酸性转化酶基因片段的克隆

分析植物液泡和细胞壁转化酶基因的保守区序列，分别设计一对PCR引物，以柑橘基因组DNA为模板，采用PCR方法分别扩增出长约740 bp和530 bp的DNA片段，分别克隆入pBS－T 和pMD18－T载体，进行测序，结果表明，获得柑橘酸性转化酶基因家族的两个成员，成员A和B基因片段分别长742 bp和524 bp。其序列已在GenBank中登记（登记号分别为AF014925和AF314197）。在GenBank中进行同源性检索，结果表明，成员A编码的氨基酸与植物液泡酸性转化酶的氨基酸同源性较高，与拟南芥的最高，达76％，而成员B编码的氨基酸与植物细胞壁酸性转化酶的氨基酸同源性较高，与豌豆的最高，达71％。两成员核苷酸和氨基酸序列同源性分别为55％ 和50％，推测酸性转化酶基因成员A 和B编码的蛋白分别定位于液泡和细胞壁。     

中国芦荟AIDREB2基因的克隆及其胁迫表达

为了研究中国芦荟的抗逆机理,以cDNA为模板,利用3'RACE和PCR扩增方法,克隆得到了一个编码DREB蛋白的基因,命名为AlDREB2,GenBank登录号为FJ560460.其cDNA序列全长为886bp,包含一个636 bp的开放阅读框,推导编码的氨基酸序列(212个氨基酸)与库拉索芦荟AlDREBI的序列相似性很高.进化树分析结果将AlDREB2归入DREB亚家族中A-6亚组.利用RT-PCR技术分析了AlDREB2基因的表达与胁迫的关系,表明AlDREB2基因在非生物胁迫与生物胁迫中能够被不同程度诱导表达.     

香石竹切花水孔蛋白基因DcPIP2的克隆及特征分析

 采用RT-PCR和RACE技术从香石竹（Dianthus caryophyllus L.）叶片中获得质膜内在蛋白（plasma membrane intrinsic protein,PIP）类水孔蛋白（aquaporins,AQP）基因的cDNA全长序列,命名为DcPIP2,GenBank登录号为GU989036。该cDNA全序列长983 bp,包含有858 bp的完整阅读框（ORF）,编码285个氨基酸,分子量约为30.6 kD。克隆相应的DcPIP2基因组全长序列得知,该基因长2 635 bp（GenBank登录号为JF706350?）,包含由3个外显子和2个内含子组成的编码区序列。同源性分析显示,DcPIP2氨基酸序列与陆地棉（Gossypium hirsutum）PIP2;3（ACB42440）、麻疯树（Jatropha curcas）AQP（ABM54183）和巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）PIP2（ACV66986）氨基酸的同源性分别为89%、88%和87%。利用实时荧光定量PCR技术研究表明,DcPIP2基因在香石竹切花的叶片、茎颈部、花瓣、雌蕊、雄蕊和萼片中均有表达,表达量为雌蕊 > 花瓣 > 雄蕊 > 萼片 > 茎颈部 > 叶片。     

香蕉穿孔线虫β-1，4-内切葡聚糖酶基因的克隆与特征分析

 植物寄生线虫的分泌物在线虫的侵染过程中具有重要的作用,其中纤维素水解酶是研究的较多的主要分泌物之一。采用RT-PCR和RACE方法,从香蕉穿孔线虫（Radopholus similis）中获得编码β-1,4-内切葡聚糖酶基因的cDNA序列,命名为RS-eng-1 （GenBank登录号为EU414839）。该cDNA序列全长为1 630 bp,包含一个1 404 bp的开放阅读框（ORF）,编码含467个氨基酸的蛋白,理论分子量与等电点分别为48.22 kD和6.04。序列分析表明该酶含有糖基水解酶家族5（GHF5）的保守结构域,N端具有22个氨基酸残基组成的信号肽,C端含有细菌式样的纤维素结合域（CBDⅡ）。原位杂交结果显示此基因在相似穿孔线虫的食道腺部位表达,并且Southern结果显示其为多拷贝基因。cDNA与基因组DNA重叠分析表明,此基因包含6个内含子,切割点符合5'-GT...AG-3'的规律。进化分析显示该酶与细菌Bacillus subtilis和Erwina carotovora 分泌的纤维素酶属于同一支,推测其来源于细菌的水平基因转移。     

甜菜硝酸还原酶基因编码氨基酸偏好及功能预测分析

利用同源序列克隆方法从标准偏高糖型甜菜二倍体纯系Ty7中获得氮素诱导甜菜硝酸还原酶基因片段,通过RACE技术克隆基因全长序列;该基因ORF长度2718 bp,编码905个氨基酸,分子量大小为102kD（ExPaSy的分子量分析）,等电点为6.12,含有147bp的5＇UTR和382 bp的3＇UTR,Genbank上的注册号为EU163265,甜菜硝酸还原酶基因编码多肽含有3个氧化还原功能区：钼辅因子功能区（eukary NR Moco;93-478）,Fe-血红素结合区（Cyt-b5;535-608）,FAD结合区（FAD binding 6;653-760）。利用网上的公共数据库和相关软件对该基因氨基酸偏好和编码蛋白的理化性质进行了分析,并对其功能进行了预测。上述研究结果为下一步基因的表达与调控研究奠定了基础。     

银杏类黄酮糖基转移酶基因全长序列克隆及表达分析

 以银杏（Ginkgo biloba L.）雄株叶片为试材,采用同源基因克隆及RACE-PCR方法,克隆到了类黄酮糖基转移酶（UDP-glycose：flavonoid glycosyltransferase,UFGT）基因GbUFGT的全长cDNA序列,其在GenBank中的注册号为JN640564.2。该基因编码区长1 491 bp,编码496个氨基酸。GbUFGT蛋白具有保守的PSPG基序、UDP–葡萄糖基转移酶和UDP–葡萄糖醛酸基转移酶结构域,与其他植物中的UFGT蛋白同源性较高。GbUFGT基因组序列与其cDNA序列相同,无内含子。半定量RT-PCR结果表明,GbUFGT在整个银杏叶片发育期均可较高水平的表达,且不同发育期表达水平无明显变化,属非发育时期特异性基因。     

中国芦荟AlDREB2基因的克隆及其胁迫表达

 为了研究中国芦荟的抗逆机理, 以cDNA为模板, 利用3′RACE和PCR扩增方法, 克隆得到了一个编码DREB蛋白的基因, 命名为AlDREB2, GenBank登录号为FJ560460。其cDNA序列全长为886bp, 包含一个636 bp的开放阅读框, 推导编码的氨基酸序列(212个氨基酸) 与库拉索芦荟AlDREB1的序列相似性很高。进化树分析结果将AlDREB2 归入DREB 亚家族中A26亚组。利用RT-PCR 技术分析了AlDREB2 基因的表达与胁迫的关系, 表明AlDREB2 基因在非生物胁迫与生物胁迫中能够被不同程度诱导表达。     

大白菜温度敏感雄性不育育性转化相关XET基因的电子克隆

以从大白菜温敏雄性育性转化相关基因差异表达的分析中获得的EST-58为标签,采用电子克隆的方法对其进行延伸,并对电子克隆的结果进行RT-PCR验证,结果表明:电子克隆到1个由1197bp核苷酸组成的序列,该序列具有完整的开放阅读框架(ORF),编码蛋白为292个氨基酸。经RT-PCR扩增,连续样品间EST-58表达的带型变化趋势与cDNA-AFLP的差异显示情况一致,且RT-PCR获得的序列与电子克隆的序列一致性达98%。用该序列在GenBank数据库中进行blastX同源性分析,确定该序列为大白菜的XET基因(GenBank登陆号为EU579461)。     

欧洲山芥皂苷合成关键酶基因Bv-beta-AS 克隆及表达分析

 以能够产生抗虫皂苷的高抗小菜蛾资源G 型欧洲山芥（Barbarea vulgaris R. Br.）B44 为材料,利用RACE 技术克隆出皂苷合成关键酶beta–香树脂合成酶的基因（Barbarea vulgaris beta-amyrin synthase,Bv-beta-AS）。该基因编码区序列长为2 289 bp（GenBank 登录号JQ172795）,推导其编码762个氨基酸;在基因组水平上长度为4 107 bp （GenBank 登录号JQ172796）,含有15 个内含子。Bv-beta-AS编码的氨基酸具有beta–香树脂合成酶基因家族的保守序列,即DCTAE 序列和QW 特征序列,氨基酸多序列比对和进化树分析表明,该基因与拟南芥beta–香树脂合成酶基因的相似性最高,为74%。利用荧光定量PCR 对欧洲山芥在小菜蛾诱导下该基因的表达进行研究,结果表明,该基因受虫害诱导时上调表达,但是上升到12 h 达顶峰后随时间推移呈回归的趋势。从序列特征和表达模式上推测,Bv-beta-AS 可能是抗虫皂苷合成途径的一个关键酶的基因。     

白菜GLDH 基因cDNA的克隆及序列分析

 以白菜品种‘苏州青’ cDNA 为模板, 采用RT-PCR、巢式PCR、3’RACE和5’RACE技术, 获得了L - 半乳糖酸- 1, 4 - 内酯脱氢酶(EC 1.3.2.3, GLDH) 基因cDNA 2 034 bp全长序列。序列分析表明, GLDH基因cDNA序列编码601个氨基酸。其氨基酸序列与花椰菜GLDH基因具有98%的同源性, 与拟南芥GLDH基因具有90%的同源性。该基因在GenBank中登录号为AY899298。     

君子兰转化酶基因片段(CMCW1)的克隆和序列分析

 分析植物酸性转化酶基因的保守区序列，设计一对PCR引物，以君子兰基因组DNA为模板，采用PCR方法扩增出长约500 bp的DNA片段，克隆入pGEM-TEasy载体，测序结果表明获得君子兰酸性转化酶基因家族的一个成员CMCW1，该基因片段长518 bp，不含内含子，编码172个氨基酸。其序列已在GenBank中登记(登记号为AY151269)。在GenBank中进行同源性检索的结果表明，该成员编码的氨基酸与其它植物细胞壁酸性转化酶编码的氨基酸同源性较高。     

黄瓜促分裂原活化蛋白激酶基因的生物信息学分析及原核表达

利用RT-PCR技术结合RACE技术,从NO₃^-胁迫下的黄瓜根中克隆出促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）基因的同源序列,命名为CsNMAPK,GenBank注册号为DQ812086。生物信息学分析表明,该基因全长1 636 bp,开放阅读框（ORF）1 113 bp,编码370个氨基酸。亚细胞定位预测其编码蛋白可能定位于细胞质;跨膜结构分析表明该基因有一个强的跨膜螺旋结构;PlantCare分析结果显示该基因序列具有脱落酸诱导、茉莉酸诱导、赤霉素诱导、水杨酸诱导、伤害诱导等顺式作用元件。成功构建原核表达载体,并转化E.coli BL21（DE3）,SDS-PAGE检测结果显示表达了一个约46 kD的蛋白。为进一步揭示黄瓜MAPK基因在NO3-胁迫中的作用奠定基础。