H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因的克隆及原核表达

据GenBank收录的H9N2亚型禽流感病毒血凝素（HA）基因序列设计并合成引物,以H9N2亚型禽流感病毒RNA为模板,用R1PCR方法扩增了预计约1700bp的HA基因,将此扩增产物克隆进pMD18-T载体,采用限制性酶切及序列测定鉴定阳性重组克隆子结果表明HA基因长为1683bp。基于HA信号肽在表达中的负作用,研究通过基因工程手段缺失HA蛋白位于起始的信号肽的编码户列,获得了缺失HA蛋白信号肽的HA基因,将其亚克隆到pGEX-KG中,与GST融合表达。SDS-PAGE显示：融合表达的蛋白分子量乡为90kDa。     

H9N2亚型禽流感病毒NS1基因的原核与真核表达

【目的】构建H9N2亚型禽流感病毒(AIV)NS1基因的原核和真核表达载体,将其分别在大肠杆菌和293细胞中进行表达,为进一步研究NS1蛋白的功能及其与宿主的相互作用,以及鉴定禽流感疫苗免疫禽和野毒感染禽ELISA诊断试剂盒的制备提供理论依据。【方法】用RT-PCR方法扩增H9N2亚型AIV的NS1基因,将其定向克隆到原核表达载体pET-32a(+)中构建NS1基因的原核重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达;同时,将NS1基因克隆到真核表达载体pEGFP-C1中,构建NS1基因真核重组质粒,将其瞬时转染293细胞,48h后收集感染细胞,对大肠杆菌表达产物和293细胞表达产物进行Western-blotting分析。【结果】成功构建了NS1基因的原核表达载体pET-32a-NS1和真核表达载体pEGFP-C1-NS1。Western-blotting结果表明,大肠杆菌和293细胞的表达产物均能检测到特异性条带(大肠杆菌的表达产物在约44ku处出现阳性条带,293细胞表达产物在约55ku处出现特异条带)。【结论】NS1基因在大肠杆菌和293细胞中得到成功表达,获得的NS1蛋白具有良好的抗原活性。     

H9亚型禽流感病毒血凝素蛋白在原核系统中的表达

应用带有His6尾的pET原核表达系统对禽流感病毒血凝素蛋白进行表达,将禽流感A/Turkey/Wisconsin/66(HgN2)的HA基因克隆至原核表达载体pET-30a中,经酶切、PCR扩增和测序分析确证其插入,并且阅读框正确,获得重组质粒pET30a-H9.将此重组质粒转化到宿主菌BL21中,用诱导剂异丙基硫代...     

4个H9N2亚型禽流感病毒毒株HA基因序列比较与分析

[目的]测定H9N2AIV4个毒株血凝素基因序列,并进行比较分析,从分子生物学角度了解各毒株间的差异和变异规律,进而了解该亚型禽流感的分布及流行规律。[方法]参照H9N2亚型禽流感HA基因序列设计1对引物,对禽流感A／Chicken／Hebei／WD／98（H9N2）、A／Chiken／Hebei／ZD／04（H9N2）、A／Chicken／Beijing／MY／06（H9N2）和A／Chicken／Beijing／PG／08（H9N2）4个毒株HA基因进行扩增、克隆和测序,并将这4个毒株的HA基因序列分别与GenBank登录的10个H9N2亚型禽流感毒株（序列号分别为AF156376,AF156377,AF156378,AF461517,AF461519．AF461521,AF461530,AY364228,AY862606,D90305）进行比较分析,并绘制进化树。[结果]4个毒株HA基因（ORF）全长1683bp,编码561个氨基酸;4个毒株之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为92．5％～95．6％和95．2％～96．8％．其中MY株和ZD株HA基因同源性和氧基酸同源忡均为最高：WD株、MY株、PG株和ZD株与其他10个毒株的核苷酪和氧基酪序列同源性分别为82．6％-95．1％、83．0％-99．0％、82．7％～95．5％和81．30％～95．7％、86．6％～96．3％、86．6％～97．9％、87．0％～97．1％、86．9％-97．3％,遗传进化树分析表明,H9N2的HA基因的进化树有2个大的分支,分为2个种系：欧亚种系和北美种系。欧亚种系又分为3个群系,分别以A／Quailf HongKong／G1／97（AF156378）,A／Duck／HongKong／Y439／97（AF156377）和A／Duck／HongKong／Y280／97（AF156376）为代表株,将这4个分离株与国内一些参考株、韩国代表株（AY862606）以及上述欧亚种系代表株的HA基因序列进行比较。结果表明,MY株、WD株、PG株和zD株均属于欧亚种系,并且都属于A／Duck／HongKong／Y280／97群系,与国内参考株的亲缘关系都较近,而MY株与A／ChickenfShandong／2／99（AF461521）亲缘关系最近。PG株与A／Chicken／Liaoning／2／00（AF461519）的亲缘关系最近,氨基酸同源性达到97％。ZD株与A／Chicken／Beijing／1／97（AF461530）的亲缘关系最近,核苷酸和氨基酸的同源性都是最高的,分别达95．7％、97．3％。韩国株（AY862606）则属于A／Duck／HongKong／Y439／97（AF156377）群系。总体来看,这4个分离株与国内参考株亲缘关系较近,而与韩国株（AF156377）较远。4个分离株除WD株的HA基因裂解位点为PSRSSR／GLF,MY、PG和ZD株的HA基因裂解位点均为PARSSR／GLF,WD株裂解位点附近的A变为S,也就是由丙氨酸变为丝氨酸,S也是非碱性氨基酸,因此,致病力没有变化,这4个分离株均为低致病性禽流感病毒。HA基因的几个受体位点分别为109aa,161aa,163aa,191aa,198aa,202aa,203aa,通过比较除了PG株的198aa为丙氨酸（Ala）,其他3个都为缬氨酸（Via）。编码198aa的3个碱基由GTG突变为GCG,其他参考株的198aa变异性也较大,A／Duck／HongKong／Y439／97（AF156377）和A／Quail／HongKong／G1／97（AF156378）的198aa都是谷氨酸（Glu）,还有的国内株为T。这4个分离株的其他几个受体结合位点的氨基酸都是一样的,然而,通过对10个参考株的比较发现,191aa也容易发生变异,有的变为组氨酸（His）。202aa和203aa在所有的毒株中都比较保守。[结论]HA基因在不同毒株间具有很高的同源性。但有很多因素能够影响其HA基因的变异,从而影响其致病力,这与地域因素有很大的相关性,因此,应加强地域间的防控。     

4个H9N2亚型禽流感病毒毒株HA基因序列比较与分析

[目的]测定H9N2AIV4个毒株血凝素基因序列,并进行比较分析,从分子生物学角度了解各毒株间的差异和变异规律,进而了解该亚型禽流感的分布及流行规律：[方法]参照H9N2亚型禽流感HA基因序列设计1对引物,对禽流感A／Chicken／Hebei／WD／98（H9N2）、A／Chiken／Hebei／ZD／04（}19N2）、A／Chicken／Beijing／MY／06（H9N2）和A／Chicken／Beijing／PG／08（H9N2）4个毒株删基因进行扩增、克隆和测序,并将这4个毒株的HA基因序列分剐与GenBank登录的10个H9N2亚型禽流感毒株进行比较分析,[结果]获得了4个毒株圳基因（ORF）全长1683bp,编码561个氨基酸;4个毒株之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为92．5％～95．6％和95．2％～96．8％;WD株、MY株、PG株和ZD株与其他10O个毒株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为82．6％～95．1％、83．O％～99．0％、82．7％～95．5％、81．30％～95．7％、86．6％～96．3％、86．6％～97．9％、87．O％～97．1％、86．9％～97．3．[结论]HA基因在不同毒株间具有很高的同源性.     

四株H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因的克隆与分子特征分析

对分离自北方地区发病鸡群中的四株H9N2亚型禽流感病毒(AIV)进行了血凝素(HA)基因的全长扩增和序列测定.将其核苷酸序列及推定的氨基酸序列与GenBank中已有的参考序列进行比较并绘制了系统进化树.结果表明基于HA基因多个不同的核苷酸区段所做的系统发育分析结果基本一致.尽管分离时间不同,但这四株AIV的HA基因同源性很高,均属于A/DK/HK/Y280/97-like病毒.四株病毒在HA裂解位点、受体结合位点以及推测的糖基化位点的氨基酸序列均与上述亚系相似,但是其中的两株病毒由于一个核苷酸的变异,缺失了HA上298～300位的一个潜在的糖基化位点.     

广东地区 H9N2 亚型禽流感病毒 HA 和 NA基因生物学特征分析

【目的】监测广东地区 H9N2 亚型禽流感病毒（Avian Influenza Virus, AIV）的遗传变异和分子进化趋势,为我国 H9N2 亚型 AIV 的防控提供参考。【方法】对 2022 年广东地区 3 株 H9N2 亚型 AIV 的 HA 和 NA 基因进行扩增、克隆、测序,使用 DNAStar、PhyloSuite 软件进行序列拼接和比对,再运用 MEGA、Megalign、 NetNGlyc 1.0 Server 等软件,对其核苷酸和氨基酸序列进行遗传进化、核苷酸同源性分析,以及受体结合、蛋白活性、耐药性和糖基化等关键位点分析。【结果】系统发育树和核苷酸同源性分析结果显示,3 株分离株的 HA 和 NA 基因分别属于 h9.4.2.5 分支和 1 分支,与早期毒株的核苷酸同源性分别为 81.6%~91.7% 和 88.2%~91.2%,分别命名为 h9.4.2.5c 分支和 1.2 分支;核苷酸和氨基酸序列分析发现,HA 裂解位点为 PSRSSR ↓ GLF,受体结合位点产生 I155T、H183N、A190T/V、T212I、Q226L、Q227M 突变,糖基化位点产生 218N 非糖基化和新增 313N 糖基化突变;NA 茎部缺失 187~195 位 9 个核苷酸（ACAGAGATA）,导致缺失 63~65 位 3 个氨基酸（TEI）;NA 红细胞结合位点产生 K/E/S368N、D369N 突变,与 NA 蛋白活性,耐药性的相关位点 E119、D151、R152、R224、E276、R292、R371 均未发生突变。【结论】 2022 年广东地区分离的 3 株 H9N2 亚型 AIV 已经进化成新的亚群,部分突变可能增强了对哺乳动物的适应性,且其抗原性发生改变,但尚未获得对奥司他韦和扎那米韦等抗流感病毒药物的耐药性。     

5株H9N2亚型禽流感病毒HA、NA基因的序列分析

为了从分子生物学角度了解H9N2亚型禽流感病毒（AIV）在广西的遗传变异情况,对5株不同年代的广西H9N2亚型AIV的HA和NA基因进行克隆测序及同源性、遗传进化分析。结果表明,5株分离株均为低致病性AIV（LPAIV）,HA、NA基因均属于欧亚谱系中的DK/HK/Y280/97（第I亚群）,与我国代表株CK/BJ/1/94HA基因核苷酸、氨基酸同源性为93.5%～95.9%,NA基因核苷酸、氨基酸同源性为93.8%～95.8%。分离株DK/GX/51/05、CK/GX/55/05HA基因第226位氨基酸由谷氨酰胺（Gln）突变为亮氨酸（Leu）,具备人类流感病毒的受体特征,而在糖基化位点方面,除了CK/GX/6/00HA基因的第218位发生变异以外,5株分离株HA基因上其余各糖基化位点均未发生变异;分离株DK/GX/51/05、CK/GX/55/05、QA/GX/B1/06NA基因均缺失第63、64、65位3个氨基酸,导致1个糖基化位点缺失,而CK/GX/6/00、WB/GX/A1/06NA基因则未发生缺失。     

H5N1 和 H9N2 亚型禽流感病毒HA基因的原核表达

采用自行设计的引物,通过PCR的方法,分别从pMD-HA5和pMD-HA9中成功扩增出AIV 0025(HSN1)株和KMⅢ(H9N2)株的血凝素(hemagglutinin,HA)基因,然后分别亚克隆到pET-32a( )、pET-28a( )表达载体中,构建并筛选出阳性重组子,分别标记为pET32-HA5、pET28-HA9.将阳性重组质粒转化进B121(DE3)宿主菌中,通过改变IPTG浓度和诱导时间,使重组蛋白获得表达,并确定了最佳诱导条件为IPTG终浓度1.0 mmol/L、诱导时间4～5 h.经SDS-PAGE和 Western-blotting 分析表明,重组蛋白相对分子质量约为85 000和63 000,主要存在于包涵体中,具有良好的免疫学活性.     

H9N2亚型禽流感病毒的致病特性研究

将SS，KMI，KMIII3个禽流感病毒的感染性胚液分别中2周龄及5周龄的SPF鸡，观察其症状及病理变化。结果显示：1，3个毒株均可引起攻毒鸡体温升高，部分出现水样淡黄色稀粪，但不能致死攻毒鸡，表明3个毒株均为非高致病力毒株，2，攻毒鸡除胰腺充血出血外，其他器官不见明显的肉眼病理变化，但组织病理病理学的变化较为明显和一致，主要为：脑及脊髓充血出血，神经元变性坏死，胶质细胞增生；心肌在出血，组织变性坏列, 腺充血出血，组织坏死，3个毒株对5周龄SPF鸡的病理变化无明显差异，但KMI毒株对2周龄SPF鸡的病理损害稍大于SS株。     

H9N2禽流感病毒全基因组密码子使用偏好性及影响因素分析

【目的】探究H9N2禽流感病毒(AIV)全基因组的密码子使用偏好性及影响因素。【方法】选取2010—2018年国内H9N2 AIV流行毒株的全基因组为研究对象,分析其碱基组成特性、最优密码子、密码子使用偏好性的影响因素以及病毒对宿主密码子使用模式的适应性。【结果】H9N2 AIV的全基因组中AU含量高于GC。大部分最优密码子以A或U结尾,有效密码子数(ENC)平均值为52.86,提示存在密码子使用偏好性但偏好性较低。密码子使用偏好性主要受到突变压力和自然选择的共同作用,其中自然选择(所占比例为61.79%～76.15%)作用大于突变压力(所占比例为23.85%～38.21%)。H9N2 AIV对人Homo sapiens的密码子适应指数平均值为0.739～0.741,提示H9N2AIV禽流感病毒可能已适应人类的密码子使用模式。【结论】本研究为H9N2 AIV的基因进化分析、已有疫苗的密码子优化和新型疫苗(密码子去优化疫苗)研制提供了理论依据。     

华东地区H9N2亚型禽流感病毒HA基因的遗传演化分析

为了解华东地区H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的遗传特点和流行规律,利用RT-PCR方法扩增华东地区2008~2013年分离的17株H9N2亚型AIV血凝素(HA)基因片段,进行序列测定和遗传进化分析,并对HA蛋白质的裂解位点、受体结合位点和潜在的糖基化位点进行分析。结果显示,17株H9N2亚型AIV HA基因核苷酸和推导的氨基酸同源性分别为84.6%~99.3%和86.0%~99.5%,均属于欧亚分支。其中15株鸡源病毒属于Y280-like亚系,2株鸭源病毒属于G1-like亚系。HA裂解位点都是非连续碱性氨基酸,属于低致病力毒株。HA受体结合位点149、150、191、198和234位氨基酸存在变异,尤其是234位氨基酸有14株毒株变为L,表现出人流感病毒受体结合特性。有2株毒株在145位氨基酸出现新的糖基化位点,5个毒株在218位氨基酸缺失1个糖基化位点,13个毒株在313位氨基酸增加了一个新的糖基化位点。研究结果表明华东地区近年来H9N2亚型AIV存在一定的变异,应加强对该类病毒的分子流行病学监测。     

湖南洞庭湖区12株H9N2亚型AIV全基因序列的进化分析

【目的】从分子生物学角度了解H9N2亚型禽流感病毒在湖南省洞庭湖区的变异特点和进化规律。【方法】对近年来洞庭湖区分离的12株H9N2亚型禽流感毒株的全基因进行分段克隆测序,应用Mega 5软件包对病毒基因进行多序列比对和进化树的绘制与分析。【结果】12株H9N2亚型禽流感毒株HA裂解位点均没有多个连续的碱性氨基酸插入,属于低致病性病毒。12株H9N2亚型禽流感病毒HA、NA基因进化比较同步,均处于DK/HK/Y280/97分支,而6个内部基因(M、PB2、PB1、PA、NA、NS)与高致病性禽流感H5亚型毒株呈现不同程度重组现象,且与H7N9亚型毒株基因的核苷酸同源性很高,很有可能为其提供内部基因。【结论】湖南省洞庭湖地区H9亚型禽流感病毒的遗传演化较为复杂,存在广泛的基因重组现象。     

环境低温对H9N2亚型禽流感病毒感染小鼠致病性的影响

旨在分析环境低温对H9N2亚型禽流感病毒感染小鼠致病性的影响。选用120只6~8周龄,雄性SPF BALB/c小鼠,随机分为4组:无感染常温组(PBS处理,(20±2)℃)、无感染低温组(PBS处理,(10±2)℃)、H9N2病毒感染常温组(H9N2处理,(20±2)℃)、H9N2病毒感染低温组(H9N2处理,(10±2)℃)。在感染后观察感染小鼠发病14 d内的临床症状、存活率,肺脏病变程度、肺部细胞因子含量的动态变化以及肺脏病毒载量。结果表明:1)与H9N2病毒感染常温组小鼠相比,环境低温处理的H9N2病毒感染小鼠临床症状明显加重,其中体重明显降低,但差异不显著(P>0.05),存活率由95%降为67%,肺水肿程度和肺组织病变程度更加严重;2)H9N2病毒感染低温组与H9N2病毒感染常温组相比,肺脏TNF-a和IL-1β含量无显著差异,但均显著高于2个无感染组(P<0.01);3)H9N2病毒感染低温组与H9N2病毒感染常温组相比,肺组织病毒载量显著增加(P<0.01)。综上,环境低温明显增加了H9N2亚型流感病毒对小鼠的致病性,为进一步揭示环境低温与流感病毒感染之间的关系,以及采取有效的预防措施提供数据基础。     

Endemicity of H9N2 and H5N1 avian influenza viruses in poultry in China poses a serious threat to poultry industry and public health

The H9N2 and H5N1 avian influenza viruses (AIVs) have been circulating in poultry in China and become endemic since 1998 and 2004, respectively. Currently, they are prevalent in poultry throughout China. This endemicity makes them actively involved in the emergence of the novel lineages of other subtypes of influenza viruses, such as the well-known viruses of the highly pathogenic avian influenza (HPAI) H5N2 and the 2013 novel H7N7, H7N9 and H10N8 subtypes, thereby threatening both the poultry industry and public health. Here, we will review briefly the prevalence and evolution, pathogenicity, transmission, and disease control of these two subtypes and also discuss the possibility of emergence of potentially virulent and highly transmissible AIVs to humans.     

斑鸠对H9N2亚型禽流感病毒的易感性及其流感病毒受体类型的研究

【目的】验证斑鸠对H9N2亚型禽流感病毒的易感性,测定斑鸠呼吸道上皮细胞表面流感病毒受体的类型和分布。【方法】以5×104EID50/只的剂量经滴鼻、点眼途径感染A/Chicken/Beijing/2/2009（H9N2）亚型禽流感病毒,共感染8只斑鸠和8只SPF鸡,对试验斑鸠和SPF鸡进行临床症状、大体病变、组织学病变的观察及病毒抗原的定位、病毒分离和感染抗体的测定。【结果】攻毒后5d,斑鸠和SPF鸡未见异常临床表现和大体病变,病理组织学检查发现斑鸠的喉头、气管上段、中段和下段上皮细胞均有不同程度的脱落;在斑鸠的喉头、气管上段、中段和下段上皮细胞的胞浆内检测到了大量阳性流感病毒蛋白颗粒;斑鸠咽拭子病毒分离阳性率为75%（6/8）,SPF鸡咽拭子病毒分离阳性率为100%（8/8）。攻毒后14d,斑鸠H9N2亚型禽流感病毒HI抗体阳性率为80%（4/5）,SPF鸡HI抗体阳性率为100%（5/5）。对H9N2亚型禽流感病毒受体检测结果表明,斑鸠的喉头、气管上段、中段、下段上皮细胞表面存在SAα2, 3Gal和SAα2, 6Gal两种连接键型的受体。【结论】斑鸠对H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Beijing/2/2009（H9N2）易感,且斑鸠的喉头和气管上、中、下段上皮细胞表面同时存在能够与禽流感病毒结合的SAα2, 3Gal受体和与人流感病毒结合的SAα2, 6Gal受体。