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《畜牧兽医学报》2016,(9)
拟建立一种简便、快速、准确的现场快速分子检测方法,为猪圆环病毒2型(PCV2)疾病的生物安全防控提供技术支撑。采用交叉引物恒温扩增技术原理,根据PCV2 Cap基因设计一组交叉扩增引物,用构建的Cap基因重组质粒作为标准DNA模板,对反应体系的引物浓度、Betaine、MgSO4、dNTP、Bst酶、反应温度和时间进行优化,并结合核酸试纸条技术,建立可视化检测PCV2的交叉引物恒温扩增检测方法(PCV2-CPA)。用建立的CPA检测方法、常规PCR和ELISA方法检测经IFA方法标定的127份临床样品,比较这些方法的敏感性、特异性和符合率。结果显示,最佳反应体系为引物F3、B3各0.5μmol·L-1,CPR 1μmol·L-1,DF5F0.7μmol·L-1、DF5B0.9μmol·L-1,Betaine 0.075mol·L-1,MgSO43mol·L-1,dNTPs 0.4mmol·L-1,Bst DNA聚合酶9.6U。建立的检测方法58℃扩增50min,检测限可达7.6拷贝·μL-1,灵敏度是常规PCR的10倍;与PCV1、PRV、CSFV、PRRSV、PEDV、TGEV和RV无交叉反应。三种检测方法的敏感性分别为78.08%~94.52%,特异性为87.03%~92.59%,符合率为84.25%~91.34%,ROC曲线图显示三种检测方法中,CPA检测方法效能最优。建立的猪圆环病毒2型交叉引物恒温扩增检测方法不需要PCR仪,仅一台水浴锅或金属浴即可完成病毒DNA的扩增,密闭的核酸检测试纸条使结果判定直观、客观,且可有效避免气溶胶污染,可应用于猪圆环病毒2型的现场快速检测。 相似文献
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为快速检测并鉴别猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)病毒。本文研究参考GenBank中PCV2和PCV3高度保守片段分别设计了探针引物,成功建立了一种双重TaqMan荧光定量检测方法。结果显示:该方法特异性好,可鉴别 PCV2、PCV3与其他猪病病毒;PCV2最低检测下限为1.00×101 copies/μL,PCV3最低检测下限为1.00×100 copies/μL;重复性高,批内、批间的变异系数分别为0.01%~0.02%和0.02%~0.05%;本研究采用建立的方法与商品试剂盒同步检测猪只样品440份,PCV2样品符合率为97.47%,PCV3样品符合率为96.85%;测序结果显示,PCV2均为2d亚型,PCV3均为3c亚型。结果表明,建立的双重TaqMan荧光定量检测方法具有良好的特异性、敏感性且快速、准确,节约成本,可为PCV2和PCV3的监测与防控提供技术支撑。 相似文献
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《现代畜牧兽医》2017,(11)
建立一种高效、快捷、灵敏的猪圆环病毒2型(PCV-2)的检测方法,本研究根据PCV-2 ORF2基因的保守核苷酸区域设计一对特异性引物,建立了一种用于检测PCV-2的纳米PCR方法,对其反应条件进行优化,并用重组质粒PET28a-ORF2,以及PCV-2(DNA)、猪流行性腹泻病毒(cDNA)、猪瘟病毒(cDNA)和猪细小病毒(cDNA)分别作为模板,检测了该方法的灵敏性及特异性,同时对采集的临床样品进行检测。结果表明,该纳米PCR方法可以扩增出大小为636 bp的特异性片段;最佳的退火温度为54℃,胶体金浓度为0.5 nmol/L,最低可以检出1.0×10~2拷贝/μL,其灵敏度比普通PCR检测方法高10倍以上;对采集的新疆某大型种猪场的78临床份病料进行检测,其阳性检出数量比常规PCR的检出数量高4份样品,表明PCV-2纳米PCR方法具有较高的特异性和灵敏性。本研究建立的纳米PCR方法可用于PCV-2病原学的早期检测和分子流行病学调查;同时对于低病毒的临床样品的检测也提供了一种有效的技术手段。 相似文献
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《黑龙江畜牧兽医》2016,(22)
猪圆环病毒2型(PCV-2)严重制约着养猪业的发展,目前尚无针对该病的有效疫苗和药物。为了加强PCV-2的监控及预防,根据Gen Bank中已发布的PCV-2的序列设计了一对特异性引物,对PCR的反应条件进行优化,构建了PCV-2的PCR检测方法,并进行了特异性检测和敏感性试验,并用该方法对泰州地区67份疑似病料进行了检测。结果表明:建立的PCR方法操作简单,技术要求较低,便于临床检测或流行病学调查,所检测的泰州地区67份疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的病料(淋巴结),其中42份表现为阳性,阳性率可达62.9%。说明该检测方法的建立有利于规模化猪场对PCV-2的检测及监控,可为该病的早期诊断提供技术平台。 相似文献
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根据GenBark中登录的猪圆环病毒2型基因序列,应用PrimerPremier5.0设计筛选一对扩增ORF2基因引物,建立从猪病料中直接检测PCV2感染的PCR方法。扩增PCV2阳性样品出现一条447bp的特异性DNA条带,扩增产物测序结果证实为PCV2ORF2基因序列。应用本方法扩增猪瘟病毒(HCV)、猪繁殖与障碍综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)等常见猪病原均未出现特异性条带,表明方法特异;敏感性试验结果表明,样品DNA模板检测浓度可达到9.8×10-4ng/μL;重复性和稳定性试验结果表明,用本试验建立的PCR方法进行PCV2检测,结果稳定可靠。经病猪临床检测应用,在66份病猪样本中,PCV2感染阳性率为27.27%,且多与PRRSV、PRV、HCV、PPV等一种或多种病毒混合感染,混合感染比例达72.22%。 相似文献
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猪圆环病毒2型环介导等温扩增检测方法的建立与应用 总被引:2,自引:0,他引:2
以猪圆环病毒2型为材料,设计了3对引物,构建了猪圆环病毒2型环介导等温扩增(LAMP)检测方法,并进行敏感性和特异性确定。建立的猪圆环病毒2型的LAMP检测方法,可以采用琼脂糖凝胶电泳、颜色变化、生成的沉淀等现象判定反应结果,为猪圆环病毒2型的现场快速检测提供了一种更加简便快速的方法,可以满足现场检疫的需要。 相似文献
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猪圆环病毒2型PCR检测方法的建立及应用 总被引:1,自引:0,他引:1
为了研究猪圆环病毒2型(PCV-2)的分子生物学检测方法,试验根据GenBank中PCV-2的序列设计1对特异性引物,用PCR方法扩增猪PCV-2基因保守区序列,并对PCR扩增程序进行优化,对PCR检测方法的特异性、敏感性、重复性进行研究;并用该方法对来自红河州规模化猪场的178份临床发病猪的肺脏和淋巴结样品进行检测。结果表明:该法具有快速、敏感、特异等优点,可用于PCV-2的检测和流行病学调查等;178份临床病料中有83份阳性样品,阳性率为46.6%。 相似文献
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将杆状病毒表达系统表达并经梯度离心纯化的PCV2Cap蛋白作为标准品,利用双抗夹心法建立了针对猪圆环病毒2型Cap蛋白的ELISA检测方法,并应用于圆环病毒2型基因工程疫苗的质控。结果表明,多抗最适包被浓度为1μg/mL,最佳封闭液为1%BSA,最佳单抗反应浓度为2μg/mL,反应时间60min,最佳二抗使用稀释度1:40000,反应时间60min。该方法与St9细胞、BSA和其他猪病病毒抗原之间无交叉反应,最低检测抗原量为5ng。 相似文献
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根据猪圆环病毒2型(PCV2)Rep基因序列,设计引物及探针,建立了PCV2实时荧光重组酶介导等温扩增(recombinase-aid amplification, RAA)检测方法。该方法能在40℃恒温条件下20 min内对病原进行快速检测,与猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪传染性胃肠炎病毒、繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒3型和口蹄疫病毒均无交叉反应;对病毒核酸的最低检测限为21.2 copies/μL。用荧光PCR检测方法与建立的荧光RAA检测方法对66份临床样品进行检测,两种方法符合率为90.09%。结果表明,建立的PCV2实时荧光RAA方法适用于PCV2的快速检测。 相似文献
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猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)给养猪业造成了重大的经济损失,建立经济、快速的检测方法尤为重要。本研究旨在利用巢式PCR技术,建立高灵敏度PCV2检测平台,以加强对猪圆环病毒病的防控。根据PCV2 ORF2基因保守区,设计内、外2对巢式PCR引物,通过优化PCR反应条件,建立巢式PCR检测方法,并对猪场临床样本进行检测。结果显示,本研究建立的巢式PCR检测方法灵敏度高、重复性强,最低检出量为10拷贝/μL,检出率达97.3%。本研究建立的巢式PCR检测方法为快速、高效地检测PCV2以及为猪圆环病毒病的防控提供有力手段。 相似文献
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为建立可同时检测猪捷申病毒(PTV)与猪圆环病毒2型(PCV2)的双重PCR方法,本研究根据GenBank登录的相关病毒基因序列,选择保守区域设计引物,经过反应条件的优化,建立了可同时检测以上2种病毒的PCR诊断方法,扩增片段长度分别为187bp(PTV)、120bp(PCV2)。通过实验证明该方法具有良好的特异性和较高的敏感性,对PTV、PCV2核酸检测最低浓度分别为2.8×10^-2ng和6.6×10^-3ng。应用该方法对43份临床样品进行检测发现,PTV阳性率为23%,PCV2阳性率为38%,PTV与PCV2共感染率为16%。该方法的成功建立,为快速高效地检测以上2种病毒提供有力手段。 相似文献
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