鸡马立克病活疫苗中污染禽网状内皮组织增生症病毒检测方法的建立

为建立鸡马立克病(MD)活疫苗中污染禽网状内皮组织增生症病毒(REV)的间接免疫荧光检测方法,本研究通过向MD活疫苗中添加不同剂量的REV,用拟定的方法对样品检测REV。结果表明,Ⅰ型MD活疫苗、火鸡疱疹病毒活疫苗(Fc-126株)和MD二价活疫苗(HVT+CVI988株)中污染REV的最低检出量分别为每500羽份疫苗中污染5TCID50、10TCID50和15TCID50的REV。应用建立的方法对国内10家企业生产的43批MD活疫苗进行了检验,结果显示,2个企业生产的4批疫苗REV检测阳性。随机选取了5批IFA检测阴性样品和4批IFA检测阳性样品,按鸡检查法进行外源病毒检验,结果两种方法对REV污染检验结果的符合率为100%。因此,本研究建立的IFA法可替代鸡检查法,用于疫苗中REV污染的检验。     

禽用活疫苗外源病毒污染情况的调查研究

为对禽用活疫苗污染外源病毒的情况进行彻底摸底调查,抽取了目前使用量大、覆盖面广的禽用活疫苗重点品种共8种28批,涉及18家国内生产企业、7家国外企业,疫苗生产用SPF鸡胚来自国内8家企业。按照《中国兽药典》2010年版三部鸡检查法和《欧洲药典》对抽检的禽病活疫苗进行了外源病毒污染和禽腺病毒污染检验。结果显示所抽检的禽用活疫苗均无外源病毒污染和禽腺病毒污染,表明我国禽用活疫苗的质量控制和安全性良好。     

鸡马立克氏病活疫苗外源性禽网状内皮组织增生病病毒的检测

采用免疫荧光技术检测鸡马立克氏病(MD)活疫苗中禽网状内皮组织增生病病毒(REV)的污染.将MD活疫苗稀释成每0.1ml含10羽份,同等量的MD阳性血清中和后接种于原代鸡胚成纤维细胞(CEF)上,37 C 5%CO2条件下培养4d,同样条件进行培养,连续传3代.第3代时将收获的细胞培养液接种于放入盖玻片的细胞平皿中,培养4d后,用抗REV的荧光抗体37C染色60min,然后在荧光显微镜下进行观察.结果所检测的8批MD活疫苗样品均未产生荧光,为阴性,REV对照组为阳性产生了黄绿色荧光,细胞对照为阳性未产生荧光.     

猪蓝耳病活疫苗中猪瘟外源病毒检测

试验采用IFA法对2批随机抽样的PRRS活疫苗(每批4瓶)、阳性对照(CSFV)、阴性对照(未被CSFV污染的猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV))和特异性试验检测病毒(猪圆环病毒2型(porcine circo virus 2 type,PCV-2))接种于生长良好的PK-15细胞进行间接免疫荧光染色检测CSFV,以期建立快速、准确的间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay,IFA)调查猪蓝耳病活疫苗中猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)的污染情况;在不同时间、相同试验条件下,相同批次的疫苗被重复检测了3次。试验结果表明:阳性对照接种的PK-15细胞出现特异性黄绿色荧光,阴性对照、PCV-2和待检样品接种的PK-15细胞均未出现特异性黄绿色荧光,即待检2批PRRS活疫苗未被CSFV污染;通过3次重复操作,最终的检测结果一致,说明IFA检测猪瘟病毒包涵体的特异性强、敏感性高。     

鸡马立克氏病活疫苗外源性禽网状肉皮组织增生病病毒的检测

采用免疫荧光技术检测鸡马立克病（MD）活疫苗中禽网状肉皮组织增生病病毒（REV）的污染。将MD活疫苗稀释成每0．1ml含10羽份，同等量的MD阳性血清中和后接种于原代鸡胚成纤维细胞（CEF）上，37℃5％CO2条件下培养4d，同样条件进行培养，连续传3代。第3代时将收获的细胞培养液接种于放入盖玻片的细胞平皿中，培养4d，用抗REV的荧光抗体37℃染色60min，然后在荧光显微镜下进行观察。结果所检测的8批MD活疫苗样品均匀未产生荧光，为阴性，REV对照组为阳性产生了黄绿色荧光，细胞对照为阴性未产生荧光。     

不同方法对网状内皮组织增殖病病毒的检测

从山东、江苏、上海等地的鸡场中，收集疑为网状内皮组织增殖病病毒（REV）感染鸡的脾脏、肝脏56份，分别通过聚合酶链式反应（PCR）、斑点杂交试验（Dot-blot)和间接免疫荧光试验（IFA）对其进行REV检测。结果有21份呈PCR阳性，20份呈Dot-blot阳性，15份呈IFA阳性，且所有IFA阳性样品，PCR和Dot-blot检测都呈阳性，20份Dot-blot阳性样品中有19份呈PCR阳性。研究表明，PCR检测REV较其他方法敏感，可作为REV的常规检测方法之一。     

禽弱毒疫苗中REV低剂量污染检测方法的比较

使用污染有禽网状内皮组织增生症病毒(REV)的弱毒疫苗是REV感染途径之一,而通常弱毒疫苗中REV的污染剂量较低,难以检测,本研究对不同方法在检测弱毒疫苗中REV低剂量污染进行了比较研究。将定量好的REV以不同剂量分别人为污染一批商品化新城疫病毒(NDV)弱毒疫苗,提取核酸后分别以TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测、常规RT-PCR检测以及PCR产物结合核酸斑点杂交检测等不同方法进行检测。结果显示常规RTPCR检测仅可检测到10TCID50/羽份的REV污染,而另外两种方法均检测到1TCID50/羽份的低剂量REV污染。将人为污染1TCID50/羽份和2TCID50/羽份REV的NDV弱毒疫苗各接种10只SPF鸡,定期针对REV抗体及其核酸进行检测,结果显示在免疫污染疫苗后7周内REV抗体全部为阴性,而核酸检测均可以检测到一定比例的阳性,提示通过接种SPF鸡检测弱毒疫苗中REV污染时,仅仅通过抗体判定可能会对一些剂量较低的REV污染造成漏检,通过结合对病原的检测有助于降低漏检率。     

部分禽源生物制品外源病毒的检测

进行了部分禽用生物制品外源病毒检测的鸡胚检查法、细胞检查法和鸡检查法。鸡胚检查法应用SPF鸡胚检验;细胞检查法主要通过鸡红细胞吸附试验、禽白血病病毒ELISA和禽网状内皮组织增生症病毒IFA检验疫苗是否含有外源鸡红细胞吸附因子、禽白血病病毒和禽网状内皮组织增生症病毒,并提出疫苗检验的判定标准,为各兽用生物制品生产企业新城疫疫苗的外源病毒检验提供参考。     

禽网状内皮组织增生症流行现状及检测技术研究进展

禽网状内皮组织增生症(RE)是禽类一种重要的致瘤性和免疫抑制性疾病。近年来,国内外鸡群中网状内皮组织增生症病毒(REV)流行比较严重;REV与马立克病病毒(MDV)、鸡贫血病病毒(CAV)和J亚群禽白血病病毒(Avianleukosis virus subgroup J,ALV-J)几种免疫抑制性病毒的混合感染在我国部分养鸡场中均普遍存在,使得鸡群处于免疫力低下的状态,导致禽流感、新城疫等重要疫苗免疫失败,并容易造成继发感染,使疫病的诊断和防控难度加大。另外,REV可以整合到MDV和鸡痘病毒(Fowlpox virus,FPV)基因组中,从而导致商品化疫苗受到污染,并可用做将外源基因插入到鸡和哺乳动物细胞内的表达载体;基于REV传统检测方法的基础上,新型的分子生物学检测技术如PCR、实时荧光PCR、LAMP提高了诊断REV的敏感性和特异性。     

鸡传染性贫血病毒SYBR Green Ⅰ法荧光定量PCR检测方法的建立及其在疫苗污染检测中的应用

为了更快速而灵敏地检测禽弱毒疫苗中可能存在的鸡传染性贫血病毒(Chicken infectious anemia virus,CIAV)污染,根据CIAV基因组保守区域VP2部分基因设计和合成了1对特异性引物,通过优化反应条件建立了快速检测CIAV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。结果显示,建立的检测方法灵敏度可达6.36 copies/μL,是常规PCR灵敏度的1000倍。该方法与禽网状内皮组织增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)、禽白血病病毒(Avian leukemia virus,ALV)、鸡马立克氏病病毒(Mareks disease virus,MDV)等均无交叉反应,特异性良好;批内和批间重复试验显示变异系数均小于2.5%,呈现良好的可重复性。在模拟试验中,建立的SYBR Green I荧光定量PCR能够检测到1000羽份弱毒疫苗中1个EID50的低剂量污染,应用该方法从送检的14种(批)商品化禽用弱毒疫苗中检测到2份为CIAV阳性,阳性样品按照经典的SPF鸡检查法进行检测也为CIAV阳性。因此,本研究建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法灵敏度高,特异性强,重复性好,适合用于疫苗中CIAV污染的检验。     

鸡胚中人工感染网状内皮增殖病病毒的检测

为了模仿禽网状内皮增生病毒(REV)垂直感染鸡胚,在1和3日龄的发育SPF鸡胚人工接种不同剂量的REV,并继续孵化至12日龄.在将发育鸡胚制成成纤维细胞单层后,再用抗REV单克隆抗体11B118作间接荧光抗体反应检测REV.结果表明,从所有人工感染REV的鸡胚12日龄制备的成纤维细胞中均能在培养48h检测出REV.该方法可用于检测生产弱毒疫苗的SPF鸡胚及其相应细胞有无REV的污染.     

应用聚合酶链式反应检测禽痘病毒田间分离株及疫苗株中网状内皮组织增殖病毒LTR片断,env及re1基因

本文利用聚合酶链式反应对来自澳大利亚昆士兰州、维多利亚州和新南维尔士州的４株禽痘病毒田间分离株及二疫苗株中网状内皮组织增殖病毒的ＬＴＲ片断、ｅｎｖ及ｒｅｌ基因因进行了检测。所有４株痘病毒分离株均为ＬＴＲ片断、ｅｎｖ阳性，曾被ＰＣＲ证实为ＬＴＲ阳性的一疫苗株在本实验中也为ＬＴＲ、ｅｎｖ阳性，另一疫苗株为ＬＴＲ、ｅｎｖ阴性，所有上述禽痘病毒株均为ｒｅｌ阴性。     

重组鸡痘病毒vFV282活疫苗最小免疫剂量及攻毒保护试验

将重组鸡痘病毒vFV282疫苗用生理盐水作10^-1，10^-2，10^-3，10^-4系列稀释，分别免疫7天龄鸡，于免疫后21d，分别用NDV、IBDV和FPV攻毒，观察其保护率，结果除NDV攻毒在10^-4组保护率为40％（4／10），其余各组均为100％（10／10）保护。表明该疫苗的最小免疫剂量≤10^-3TCID50/0.02mL。     

应用定量RT-PCR对猪瘟兔化弱毒疫苗的质量评价研究

为进一步验证猪瘟兔化弱毒(HCLV)疫苗荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)与兔体定型热试验之间存在正相关性,本研究利用qRT-PCR方法对278批次HCLV疫苗进行检测,分别检测其疫苗含量及牛病毒性腹泻病毒(BVDV)污染情况。结果表明,278批次猪瘟疫苗中有66批(24%)疫苗含量达不到规程标准,有42批(15%)疫苗存在BVDV污染;从所检疫苗中抽取6份qRT-PCR检测HCLV含量较低的疫苗,采用兔体定型热试验进行验证,两种方法结果吻合,表明qRT-PCR方法可以作为评价猪瘟疫苗质量的一种备选方法。     

鸡痘鹌鹑化弱毒在犊牛睾丸细胞上的适应性试验

鸡痘鹌鹑化弱毒在犊牛睾丸细胞上培养传至7代,各代次均产生程度不同的致细胞病变作用,经测定至第6代病毒收获液在犊牛睾丸细胞(BTC)上的致病变作用(CPE)最明显,细胞产毒效价最高可达105.5 EID50/0.2 mL.另外,对7个代次的病毒液进行的安全试验结果表明,该病毒收获液安全有效,符合制苗标准.此试验为用BTC生产鸡痘活疫苗提供了重要依据.     

共表达Asia1口蹄疫病毒P1-2A-3C基因和猪IL-18基因重组鸡痘病毒构建及表达

为构建Asia1型口蹄疫重组鸡痘病毒疫苗,采集口蹄疫发病牛的水泡液及水泡皮,用RT-PCR法扩增出Asia 1型口蹄疫病毒的前体蛋白基因P1-2A片段和蛋白酶基因3C片段,分别克隆至pMD18-T载体上,通过酶切连接获得质粒pMD18-T-P1-2A-3C。再将P1-2A-3C片段与pUTAL-IL18片段连接起来,构建鸡痘病毒中间转移质粒pUTAL-P1-2A-3C-IL18。通过脂质体转染法,将pUTAL-P1-2A-3C-IL18与鸡痘病毒282E4株共感染染鸡胚成纤维细胞（chicken embryo fibroblasts,CEF）,通过BrdU三次加压筛选,筛选出重组鸡病毒株vUTAL-P1-2A-3C-IL18。经RT-PCR和间接免疫荧光法鉴定,证明所筛选的1株重组鸡痘病毒在CEF中能正确表达P1-2A-3C基因。本研究为研制安全、高效的亚洲Ⅰ型FMD重组鸡痘病毒疫苗奠定了基础。     

纸片微载体培养BHK-21(C-13)细胞制备兽用狂犬冻干活疫苗

为了用激流式生物反应器纸片微载体培养BHK-21(C-13)细胞制备兽用狂犬冻干活疫苗,采用纸片微载体培养BHK-21(C-13)细胞,接种狂犬病病毒Flury株(LEP),测定病毒液滴度.将收获的病毒液制备兽用狂犬冻干活疫苗,按照狂犬病活疫苗规程进行检验.结果显示,3批收获的病毒液滴度平均达1050LD50/0.03 mL;3批实验疫苗检验结果均符合质量标准.实验证明激流式生物反应器纸片微载体培养BHK-21(C-13)细胞制备兽用狂犬冻干活疫苗提高了细胞密度、病毒滴度,增加了病毒液收获体积,减小了批间差,保证了产品均一性,适合工业化大生产.     

Construction and characterization of a fowlpox virus field isolate whose genome lacks reticuloendotheliosis provirus nucleotide sequences

Fowlpox virus (FWPV) has been isolated from vaccinated chicken flocks during subsequent fowlpox outbreaks that were characterized by a high degree of mortality and significant economic losses. This inability of current vaccines to induce adequate immunity in poultry could be reflective of an antigenic and/or biologic distinctiveness of FWPV field isolates. In this regard, whereas an infectious reticuloendotheliosis virus (REV) provirus is present in the majority of the field viruses' genomes, only remnants of REV long terminal repeats (LTR) have been retained in the DNAs of each vaccine strain. Although it has not been demonstrated whether the partial LTRs can provide an avenue for FWPV to reacquire the REV provirus by homologous recombination, utilizing viruses of which genomes lack any known integrated retroviral sequences could resolve concern over this issue. Therefore, such an entity was created by genetically modifying a recently isolated field strain of FWPV. This selection, in lieu of a commercial vaccine virus, as the progenitor was based on the probability that a virus circulating in the environment would be more antigenically similar to others in this locale and thus might be a better candidate for vaccine development. A comparison in vivo of the pathogenic traits of the parental wild-type field isolate, its genetically modified progeny, and a rescue mutant in whose genome the REV provirus was inserted at its previous location, indicated that elimination of the provirus sequence correlated with reduced virulence. However, even with elimination of the parasitic REV, the modified FWPV was still slightly more invasive than a commercial vaccine virus. Interestingly, both types of attenuated FWPV elicited a similar degree of antibody production in inoculated chickens and afforded them protection against a subsequent challenge by a field virus, the origin of which was temporally and geographically distinct from that of the progenitor strain. Due to its antigenicity being retained despite a decrease in virulence, this REV-less FWPV could potentially be developed as a vaccine against fowlpox.