慢病毒介导稳定表达增强小反刍兽疫病毒复制的山羊Vero/SLAM细胞系的建立

利用Gateway技术和慢病毒表达系统将山羊淋巴细胞信号活化因子SLAM稳定整合在Vero细胞基因组染色体上,建立稳定表达可增强小反刍兽疫病毒(PPRV)复制的SLAM的Vero阳性细胞亚克隆,并验证阳性细胞亚克隆Vero/SLAM表达SLAM的活性、遗传稳定性及其对PPRV复制的增殖效果。分离山羊外周血淋巴细胞,提取基因组Total RNA,一步RT-PCR获得完整ORF的SLAM基因,采用BP及LR位点的基因重组技术,构建入门载体pDONR/SLAM并获得表达骨架pDEST/SLAM,与Packaging Mix pLP1、pLP2及VSV-G共转染293-FT细胞,获得SLAM复制缺陷型慢病毒样粒子,用其感染Vero细胞,杀稻瘟菌素抗性筛选获得阳性细胞克隆,通过靶标基因扩增、间接免疫荧光、激光扫描共聚焦显微技术、Western blot免疫印迹检测技术、致细胞病变效应及Realtime RT-PCR等技术分别验证SLAM基因组整合、转录,SLAM蛋白表达、反应活性以及PPRV在表达SLAM阳性细胞亚克隆上的增殖效果。结果显示:SLAM受体基因被稳定整合在Vero细胞基因组染色体上,该受体蛋白表达于细胞周质,建立的细胞连续传代不丢失,接种病毒后致细胞病变时间由4～7d缩短为3.5d,TCID₅₀·0.1mL^-1由4.25增加为5.67,相对于正常Vero细胞,整合有SLAM的Vero细胞,由于表达了PPRV特异的细胞受体使PPRV对其易感性显著增强。成功建立一株稳定表达靶向增强PPRV复制的Vero/SLAM细胞:该细胞表达的SLAM具有明显增强PPRV复制的功能,不仅可以从细胞模型水平阐明增强PPRV复制的关键靶基因,也为PPRV感染引起宿主细胞的变化以及对机体的致病机制等提供研究工具。     

小反刍兽疫病毒受体SLAM基因的克隆及其结构与功能分析

信号淋巴激活分子（SLAM）为小反刍兽疫病毒（PPRV）感染其自然宿主的细胞受体。本试验从山羊外周血淋巴细胞中克隆获得了SLAM基因,并对其结构和功能的关系进行分析,为研究SLAM的功能及其在PPRV侵染过程中的作用奠定基础。利用RT-PCR的方法对山羊SLAM基因全长进行克隆,通过生物学软件对其核苷酸序列和氨基酸序列进行了比对,利用Swiss-Model进行三级结构预测,然后分析其结构和功能之间的关系。山羊、绵羊、黄牛、水牛、虎鲸和海豚SLAM基因同源性较高,分别是98.7%、96.6%、96.3%、89%和88.8%,氨基酸的相似性分别是97.6%、94.1%、93.2%、83.5%和83.6%。山羊SLAM蛋白V结构域中存在8个影响宿主—病毒特异性结合的8个关键氨基酸,且与绵羊、黄牛和水牛的均完全保守;胞内区含有三段高度保守的富含酪氨基酸（Tyrosine）的基序（TXXYXXV/I/A）。本试验成功地克隆小反刍兽疫病毒受体SLAM基因,分析和预测了SLAM蛋白的结构和功能的关系,为其进一步的生物学功能研究及其应用奠定了基础。     

小反刍兽疫病毒疫苗毒株N75-1感染细胞源外泌体对山羊SLAM表达的影响

淋巴细胞信号活化分子（SLAM）是小反刍兽疫病毒（PPRV）在淋巴细胞的主要受体。本研究旨在探索PPRV感染细胞源外泌体对山羊SLAM表达的影响。通过荧光定量PCR法、流式细胞术和Western blot技术检测PPRV疫苗毒株N75-1感染山羊外周血单核细胞（PBMCs）源外泌体（Exo-PPRV）共育对接纳细胞（正常山羊PBMCs）中SLAM表达水平和细胞因子分泌水平的影响。结果表明,与正常细胞分泌外泌体（Exo-Mock）共育组相比,Exo-PPRV共培养组细胞SLAM mRNA和细胞表面表达水平均显著上调（P<0.05）,TNF-α、IL-10和IFN-γ表达水平升高,而IFN-α水平降低（P<0.05）。进一步研究表明,Exo-PPRV中荷载高水平的PPRV H蛋白且可以将其传递至接纳细胞中,同时pcDNA3.1-H转染组中SLAM表达水平较pcDNA3.1对照转染组和未转染组明显升高。以上结果表明,PPRV感染PBMCs源外泌体对接纳细胞中SLAM表达水平具有显著正调控作用,外泌体中载荷高水平PPRV H蛋白是其调控接纳细胞SLAM表达的关键分子之一。     

Novel＿miR218对山羊外周血单核细胞中SLAM受体表达的影响

为研究山羊源novel_miR218对小反刍兽疫病毒(PPRV)在淋巴细胞的主要受体——淋巴细胞信号活化分子(SLAM)表达水平的调节作用,通过荧光定量PCR法和Western blot技术检测PPRV疫苗毒N75-1株接种山羊外周血单核细胞(PBMCs)中SLAM和novel_miR218表达变化以及病毒增殖水平,然后检测novel_miR218模拟物(novel_miR218mimic)和拮抗物(novel_miR218inhibitor)转染山羊PBMCs中SLAM表达水平变化及对PPRV增殖的影响。结果表明,山羊PBMC感染PPRV后24h(hpi)即可检测到细胞病变效应,特别在感染后48～72hpi尤为明显;与对照组相比,PPRV感染组中SLAM受体mRNA表达水平在24hpi极显著升高(P0.01),随后逐渐降低,而novel_miR218表达水平在24hpi极显著降低(P0.01),随后逐渐升高,对照组中novel_miR218和SLAM的mRNA表达水平在各检测时间点未发现显著变化;感染组中SLAM受体的蛋白表达规律与其mRNA表达相似,而PPRV-N蛋白的表达水平呈现不断增加的趋势;novel_miR218mimic转染组中SLAM和PPRV-N蛋白表达水平较对照组显著降低(P0.05或P0.01),且呈转染剂量依赖性,而novel_miR218inhibitor转染组中SLAM和PPRV-N蛋白表达水平较对照组显著升高(P0.05或P0.01),且呈转染剂量依赖性。结果表明,PPRV感染山羊PBMCs中novel_miR218和SLAM表达水平具有相关性,细胞转染检测结果提示novel_miR218对SLAM受体的表达水平具有负调控作用并影响PPRV在山羊PBMCs中的复制水平。     

可诱导表达小反刍兽疫病毒P蛋白细胞系的建立

为研究小反刍兽疫病毒(PPRV)磷蛋白(P)的生化功能,本研究通过PCR将PPRV p全长基因扩增后克隆至真核表达载体pcDNA4/TO中,构建了重组质粒pcDNA4/TO-PPRVP。将该质粒转染至已稳定转入pcDNA6/TR质粒的T-REx293细胞中,并用博来霉素和稻瘟菌素筛选存活克隆。将强力霉素添加至存活细胞克隆中诱导P蛋白表达,Western blot及间接免疫荧光试验鉴定出可诱导表达P蛋白的细胞克隆,扩增阳性克隆获得能够稳定表达P蛋白的细胞系。Western blot显示该细胞系表达的P蛋白能够与山羊PPRV阳性血清反应,并能够有效抑制聚肌胞苷酸诱导的STAT1磷酸化,表明该细胞系表达的重组PPRV P蛋白具有与野生型P蛋白类似的生物活性。本研究利用Tet on系统建立了表达PPRV P蛋白的真核细胞系,为深入研究PPRV的致病机制奠定了基础。     

稳定表达山羊SLAM受体的BHK-21细胞系的建立及应用

信号淋巴激活分子(SLAM)又称为CD150,是小反刍兽疫病毒(PPRV)和犬瘟热病毒(CDV)等麻疹病毒属病毒感染淋巴细胞的主要受体,在病毒侵入细胞中发挥重要作用。为建立稳定表达山羊SLAM(g SLAM)的真核细胞系,本研究将人工合成的g SLAM基因克隆至真核表达质粒p IRESpuro3中,并在该基因的3'端引入Flag标签序列作为分子标记,构建了重组质粒p IRES3-g SLAM。将该重组质粒转染BHK-21细胞,经嘌呤霉素加压筛选及采用表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组PPRV病毒(r PPRV/GFP)感染鉴定后,筛选到稳定表达g SLAM基因的细胞系。r PPRV/GFP感染和western blot鉴定表明,无论是否有嘌呤霉素压力的存在,该细胞系在传代至第20代,仍能稳定表达g SLAM蛋白。由于g SLAM氨基酸序列与犬的同源性较高,以表达GFP重组CDV强毒株(r CDV/GFP)感染该细胞系,病毒可以感染且能形成明显的细胞病变,表明该细胞系可用于CDV强毒分离和致弱机制等相关研究。     

小反刍兽疫病毒感染对山羊外周血单核细胞源外泌体分泌水平的影响

提取小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)疫苗毒N75-1株感染以及未感染对照山羊外周血单个核细胞(PBMCs)源外泌体,通过纳米颗粒示踪分析技术(NTA)测定提取外泌体粒径和分布范围,并通过Western blot技术和流式细胞术检测外泌体表面标志物CD63和CD81的表达水平;然后将PPRV感染PBMCs源外泌体与正常山羊PBMCs共培养,同时设定正常山羊PBMCs源外泌体共培养组以及PBMCs培养对照组,通过荧光定量PCR法和Western blot技术检测以上各组受体细胞中PPRV特异性受体淋巴信号活化分子(SLAM)表达水平变化。结果显示,PPRV感染及对照山羊PBMCs中外泌体粒径主要分布在100 nm,且感染组外泌体(Exo-PPRV)分泌水平较正常对照组(Exo-Mock)显著升高(P0.05);Exo-PPRV共培养组SLAM mRNA和蛋白质表达水平较Exo-Mock组显著上调(P0.05),Exo-Mock组与PBMCs培养对照组间SLAM mRNA和蛋白质表达水平差异不显著。结果表明,PPRV感染能够诱导山羊PBMCs中外泌体分泌水平升高且该外泌体对未感染PBMCs中PPRV受体SLAM的表达水平具有显著的正调控作用。     

鹅γ-干扰素的原核表达及抗病毒活性研究

本研究采用RT-PCR方法从培养的鹅外周血淋巴细胞总RNA中成功扩增到鹅IFN-γ基因。将克隆在pMD18-T载体中的鹅IFN-γ基因插入原核表达载体pGEX-6P-1,得到重组质粒pGEX-6P-1-IFN-γ。重组质粒转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导后作SDS-PAGE分析,得到约43 ku融合表达蛋白特异条带。用GST亲和纯化柱对原核表达产物中目的蛋白进行纯化,得到1.2 mg/L的纯化蛋白。用100TCID50病毒量在鹅副黏病毒(GPMV)/鹅胚成纤维细胞系统上测定表达蛋白的抗病毒活性,观察不同处理组的细胞形态并用RT-PCR方法鉴定,发现表达蛋白稀释倍数小于104可抑制GPMV复制,按照Reed-Muench法计算表达的鹅IFN-γ抗病毒效价为2.0×103U/mL,表明表达蛋白具有良好的抗病毒活性。     

犬瘟热病毒V蛋白的表达、鉴定及亚细胞定位

为研究犬瘟热病毒（canine distemper virus,CDV） V蛋白的功能,将CDV V基因片段与pGEX-6P-1载体连接,构建pGEX-6P-1-CDV-V重组表达质粒,通过原核表达系统表达了V蛋白,并将纯化的V蛋白免疫BALB/c小鼠,制备阳性血清。同时,将CDV V基因片段与pcDNA3.1载体连接,构建pcDNA3.1-CDV-V重组表达质粒,经转染Vero细胞后,用激光共聚焦技术确定V蛋白在真核细胞中的分布及亚细胞定位。结果显示,成功表达了V蛋白,并制备了阳性血清。重组质粒pcDNA3.1-CDV-V在外源真核细胞Vero中获得了表达,表达蛋白主要聚集于细胞质。本试验结果为进行CDV V蛋白的功能研究奠定了基础。     

不同NDV株V蛋白多克隆抗体的制备和初步应用

新城疫病毒(NDV)的V蛋白是一种干扰素拮抗蛋白,该蛋白表达量的差异对NDV细胞嗜性的影响是目前的热点问题.为制备NDV V蛋白多克隆抗体,本研究以Class Ⅰ NDV 9a5b株和Class Ⅱ NDV ZJl P基因为模板扩增V蛋白PNT结构域和V蛋白半胱氨酸富集区(CTD)结构域,分别克隆至pET-28a(+)载体和pCold TF载体中,获得表达V蛋白或其CTD结构域的重组表达质粒.将重组质粒转化大肠杆菌诱导表达;纯化重组蛋白,并分别免疫小鼠,制备针对Class Ⅰ和ClassⅡNDV V蛋白的多克隆抗体.利用该多克隆抗体,western blot检测NDV 9a5b、La Sota、ZJ1、Herts/33株感染HeLa和DF1细胞后V蛋白的表达量变化.结果显示制备的多克隆抗体可以用于NDV V蛋白的检测,V蛋白在易感宿主禽源细胞中的表达量明显高于哺乳动物细胞.研究表明NDVV蛋白的表达水平与宿主细胞的种属差异相关.     

重组黑白花奶牛γ-干扰素在大肠杆菌中的原核表达与鉴定

根据黑白花奶牛γ-干扰素(BovIFN-γ)基因的序列,通过RT-PCR扩增出BovIFN-γcDNA,并将其定向插入原核表达质粒pET-30a(+)和pGEX-6P-1,经DNA测序后,分别转化大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,分别表达出大小在23和43 ku左右的融合蛋白。通过对诱导剂的浓度、诱导起始时间、诱导持续时间的筛选,对表达条件进行了优化,BL21(DE3)/pET-30a(+)-BovIFN-γ与BL21/pGEX-6P-1-BovIFN-γ的融合蛋白的相对表达量最高时可分别达到菌体总蛋白的60%和45%左右。使用纯化的融合蛋白rHis-BovIFN-γ和rGST-BovIFN-γ进行细胞病变抑制试验,证实表达产物具有较高抗病毒感染活性,在牛肾细胞(MDBK)上抑制水疱性口炎病毒的活性分别为2.15×107和1.21×105U·mg-1。     

稳定表达小反刍兽疫病毒N蛋白的CHO细胞系的建立及表达产物的抗原性鉴定

为制备具有天然抗原活性的小反刍兽疫病毒(PPRV)核衣壳(N)蛋白,本研究建立了稳定表达PPRV N蛋白的真核细胞系。首先,将去除核定位信号(NLS)编码序列并且在其5'端引入组织纤维蛋白溶酶原抗原信号肽(tPA SP)编码序列的PPRV N基因克隆至真核表达质粒pCAGG-neo中,构建了重组质粒pCAGG-N△NLS/his。并将其转染于CHO细胞中,经G418压力培养并采用间接免疫荧光试验(IFA)及western blot试验筛选鉴定,获得稳定表达PPRV N蛋白的细胞系。通过IFA及western blot试验鉴定His标签表明该细胞系传代至22代仍能够稳定表达PPRV N蛋白。最后通过western blot等试验表明该蛋白能够与绵羊抗PPRV多克隆抗体反应,进一步表明该细胞系表达的PPRV N蛋白具有天然的N蛋白抗原性,为PPRV病原学诊断等相关研究奠定了基础。     

鼠伤寒沙门菌SseB和SseL蛋白的原核表达和多克隆抗体的制备

为制备鼠伤寒沙门菌SseB和SseL蛋白的特异性多克隆抗体(多抗),以鼠伤寒沙门菌S025为供体菌,PCR扩增sseB和sseL基因,插入原核表达载体pGEX-6P-1,转化BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,获得纯化蛋白免疫小鼠制备多抗;使用λ-red同源重组方法构建sseB和sseL基因缺失株;通过野生株和缺失株的Western-blot分析验证制备血清的特异性。结果显示:成功构建出重组质粒pGEX-6P-1-sseB和pGEX-6P-1-sseL,转化感受态细胞后,在IPTG 1 mmol/L、温度28℃、转速为220 r/min、诱导时间12 h的条件下,SseB和SseL蛋白呈可溶性表达;纯化蛋白免疫小鼠制备了多抗,Western-blot分析显示该多抗可特异性检测鼠伤寒沙门菌中的SseB和SseL蛋白。这两种蛋白多抗的获得为进一步研究其功能奠定基础。     

稳定表达山羊SLAM受体的Vero细胞系的建立

信号淋巴激活分子（signalling lymphocyte activation molecule, SLAM）又称CD150,是小反刍兽疫病毒（peste des petits ruminants virus, PPRV）和犬瘟热病毒（canine distemper virus, CDV）等麻疹病毒属病毒感染淋巴细胞的主要受体,在病毒侵入细胞中发挥着重要作用。为了建立稳定表达山羊SLAM真核细胞系,本研究将全基因合成的gSLAM基因克隆至真核表达质粒pIRES2-GFP中,构建了重组质粒pIRES2-gSLAM。将该重组质粒转染非洲绿猴肾细胞（Vero）,经G418筛选后,筛选到稳定表达gSLAM基因的细胞系Vero-gSLAM,该细胞系在传代至第10代,仍能稳定表达gSLAM基因,PPRV N75/1病毒株可以感染且能形成明显的细胞病变（CPE）,相比在Vero细胞上10^-4.65 TCID₅₀/0.1 mL的毒价,在Vero-gSLAM上为10^-5.75 TCID₅₀/0.1 mL,其毒价有所提高。该细胞系可用于PPRV强毒分离和致弱机制等相关研究。     

BALB/c小鼠Doppel蛋白的原核表达及其抗血清的制备

利用已克隆的BALB/c小鼠Doppel蛋白基因,将其成熟蛋白编码区亚克隆至表达载体pGEX-6P-1上,构建重组表达质粒pGEX-6P-1-PRND。将重组蛋白表达载体转入E.coli BL21（DE3）中诱导表达,SDS-PAGE及Western blot分析结果表明,BALB/c小鼠Doppel蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达。对表达的蛋白进行提取和纯化并免疫新西兰大白兔制备兔抗血清,初步建立了小鼠睾丸Doppel蛋白组织学分布的免疫组织化学方法。为进一步研究Doppel的结构、功能及其在TSEs发生发展中的作用提供基础材料和数据。     

熊源粪肠球菌EfaA基因的原核表达

试验旨在构建EfaA基因的原核表达质粒,并对其进行表达。根据GenBank中粪肠球菌EfaA基因序列(登录号:U03756)设计合成1对引物,利用PCR法扩增、克隆EfaA基因,并进行生物信息学分析,将EfaA基因亚克隆于pGEX-4T-1原核表达载体,构建pGEX-4T-EfaA原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导表达,筛选最佳诱导时间并分析其表达蛋白的生物学特征。结果发现,试验成功获得大小为873bp的粪肠球菌EfaA基因。经IPTG诱导后,获得分子质量约为59ku的EfaA重组蛋白,以37℃、0.5 mmol/L IPTG诱导6h表达量最大。经Western blotting分析发现,具有较好的反应原性。本试验成功构建原核表达质粒pGEX-4T-EfaA,并在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中成功表达。     

山羊干扰素刺激基因15克隆、生物信息学分析及亚细胞定位

【目的】对山羊干扰素刺激基因15(interferon-stimulated gene 15,ISG15)的CDS区进行克隆、表达和生物信息学分析,并探讨小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)感染山羊子宫内膜上皮细胞(caprine endometrial epithelial cells,EEC)对ISG15的影响。【方法】根据GenBank中公布的山羊ISG15基因预测序列(登录号:XM_005690795)设计特异性引物,利用RT-PCR方法扩增山羊ISG15基因CDS区,连接至真核表达载体进行测序并表达,对不同物种ISG15核苷酸及氨基酸序列进行比对,并构建系统进化树,利用生物信息学方法对ISG15蛋白理化性质、跨膜结构、修饰位点、二级结构、三级结构、亚细胞定位等进行分析。通过构建真核表达载体转染及PPRV感染EEC细胞,利用间接免疫荧光的方法观察其外源性和内源性亚细胞定位,并探究PPRV感染对EEC细胞的影响。【结果】成功克隆出山羊ISG15基因CDS区并进行了真核表达。山羊ISG15核苷酸和氨基酸相似性及进化树分析都与盘羊和绵羊亲缘关系最近。生物信息学分析结果显示,山羊ISG15基因位于16号染色体上,全长474 bp,编码157个氨基酸,分子质量约为17.47 ku,为亲水性蛋白,无跨膜区和信号肽,有1个潜在的N-糖基化位点,16个潜在的O-糖基化位点和10个潜在的磷酸化位点。二级结构与三级结构预测显示,山羊ISG15蛋白由无规则卷曲、延伸链、α-螺旋和β-转角组成,比例分别为34.39%、31.21%、21.66%和12.74%。可以与干扰素和泛素化相关的蛋白相互作用,并参与机体的抗感染作用。亚细胞定位显示,外源性和内源性ISG15均定位于细胞质中。【结论】试验成功克隆出山羊ISG15基因CDS区序列,亚细胞定位发现内源性和外源性ISG15均定位于EEC细胞的细胞质中。结果为后续ISG15基因细胞内功能研究奠定基础。     

新城疫病毒HN基因功能结构域的原核表达

本研究对新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)分离株sc05的HN基因进行了克隆、序列测定,在此基础上将其C端功能结构域76－571 aa片段亚克隆到pET32a(＋)表达载体上,构建重组表达质粒pET32a-HN,鉴定正确后转化进BL21 plysS(DE3)细胞,筛选出阳性克隆,用1 mmol/L IPTG 诱导表达,并对表达产物进行鉴定。SDS-PAGE电泳结果显示,HN基因功能结构域片段在 BL21 plysS(DE3)细胞中实现融合表达,表达产物大小约为76 ku,Western blotting试验证实其能与NDV阳性血清反应。本研究为进一步研究HN蛋白功能结构域的免疫原性和研制鸡新城疫HN基因工程疫苗奠定了基础。     

IFITM3对小反刍兽疫病毒在山羊子宫内膜上皮细胞中增殖的调控效应

干扰素诱导跨膜蛋白3(interferon-induced transmembrane protein 3,IFITM3)在调控病毒感染过程中发挥重要作用，而其在小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus, PPRV)感染中是否发挥作用尚不明确。本研究旨在探究IFITM3对PPRV感染的影响。通过Western blot技术检测PPRV感染对山羊子宫内膜上皮细胞(endometrial epithelial cells, EECs)中IFITM3表达的影响，进一步通过基因过表达及敲降技术探究IFITM3对PPRV复制的影响。结果表明，PPRV感染山羊EECs后，PPRV N蛋白表达水平持续升高，而IFITM3的表达水平较未感染对照组呈先上升后下降趋势。在感染后2 h, IFITM3的表达极显著上调(P<0.001);感染后3～4 h, IFITM3的表达水平最大(P<0.000 1);感染后24 h, IFITM3表达水平下降且与对照组差异不显著。抑制IFITM3表达与对照组相比，PPRV感染后0～6 h,细胞内PPRV的N蛋白水平下降...     

番鸭白细胞介素2基因的克隆及其原核表达

为原核表达番鸭白细胞介素2 (MdIL-2),本研究利用ConA刺激诱导番鸭脾淋巴细胞,采用RT-PCR技术扩增MdIL-2基因的编码序列,并将其克隆至pGEX-6P-1中,构建重组质粒pGEX-MdIL-2,转化E.coli BL21受体菌.测序结果表明,MdIL-2基因ORF全长420 bp,编码140个氨基酸.重组菌经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析显示,重组蛋白约为40 ku.Western blot分析表明,重组蛋白能够被抗GST单克隆抗体特异性识别.MdIL-2基因的克隆及其原核表达为进一步进行MdIL-2的活性检测以及应用研究奠定了基础.