北极狐TYRP1基因启动子活性及转录调控区域分析

通过分析调控北极狐毛色基因TYRP1启动子核心区域及转录因子,为探究该基因的表达调控机制提供理论依据,并为狐狸毛皮品质分子育种和彩色毛皮新材料的创制提供思路。通过基因组测序技术获得了北极狐TYRP1基因启动子序列,并利用生物信息学方法对北极狐TYRP1基因核心启动子区域和转录因子结合位点进行预测;以北极狐基因组DNA为模板,PCR扩增北极狐TYRP1基因不同长度的启动子缺失片段克隆至pGL3-Basic载体,将重组质粒瞬时转染到A375和293T细胞,利用双荧光素酶基因检测仪进行活性验证。结果表明,成功构建了9个含有不同长度启动子片段的重组质粒,经双荧光素酶活性检测发现北极狐TYRP1基因-699/+35区域为核心启动子区域,-699/-93区域存在着TYRP1基因正调控元件。生物信息学预测分析发现该区域存在4个转录因子结合位点;利用重叠延伸PCR技术成功构建了4个突变载体,经双荧光素酶活性检测发现4个突变载体活性均显著下降(P0.05),表明这4个转录因子是北极狐TYRP1基因转录调控的正调控元件。本研究确定了北极狐TYRP1基因启动子核心区域-699/+35,Sp1(-656/-646)、CREB(-598/-589)、Sp1(-539/-530)和Sp1(-163/-154)为北极狐TYRP1基因转录的正调控元件。     

山羊PMEL基因启动子活性及转录调控元件分析

旨在筛选调控山羊毛色基因PMEL的启动子活性区域及转录因子,为探究该基因的表达调控机制提供理论依据,并为彩色山羊的育种和改良提供思路。以山羊基因组DNA为模板,PCR扩增PMEL基因不同长度的启动子缺失片段,定向克隆至pGL3-basic载体,将重组质粒转染到293T和A375细胞,通过双荧光素酶检测系统测定相对荧光素酶活性值;利用生物信息学方法对PMEL基因核心启动子区的转录因子结合位点进行预测,随后利用重叠延伸PCR分别对pGL3-327质粒上预测的转录因子结合位点进行点突变并构建突变载体,利用双荧光素酶检测系统进行活性验证。结果显示,本研究成功构建了7个不同长度的启动子片段,其中6个片段具有明显的启动子活性。经过双荧光素酶活性检测发现山羊PMEL基因-251/+76区域为核心启动子区域。通过不同长度的启动子片段的活性比较发现,-251/-62区域的缺失造成启动子活性从最高到消失,表明该区域对山羊PMEL基因转录调控有重要影响,生物信息学分析发现该区域存在5个转录因子结合位点,利用点突变构建了5个突变载体,经过双荧光素酶检测发现5个突变载体的活性均显著下降。提示这5个转录因子是山羊PMEL基因转录的正调控元件。本研究确定了山羊PMEL基因启动子核心区域为-251/+76,NF-1(-206/-197)、Sp1(-186/-174)、Sp1(-151/-139)、CREB(-91/-82)和Sp1(-82/-71)结合位点为山羊PMEL基因转录的正调控元件。     

水貂DCT基因启动子的克隆及转录调控元件分析

为了找到水貂多巴色素异构酶(DCT)基因启动子活性区域及转录因子结合位点,试验采用PCR扩增与克隆,构建双荧光素酶报告基因重组质粒,分别转染到293T细胞和A375细胞,测定其活性,并利用在线软件对序列进行生物信息学分析,预测水貂DCT基因核心启动子区域的转录因子结合位点。结果表明:得到的6个不同长度的启动子片段均具有明显的启动子活性,且-1 292～+113 bp区域活性最高,提示其为水貂DCT基因核心启动子区域;成功筛选出337 bp水貂DCT基因活性较高的启动子片段,发现转录因子特异性蛋白1(Sp1)可能是调控启动子活性的重要转录因子。     

绵羊CCL19基因启动子活性分析及其转录调控元件筛选

【目的】 鉴定绵羊趋化因子C-C基序配体19(C-C motif chemokine ligand 19,CCL19)基因启动子的核心启动子区域和关键转录因子,探究该基因在转录调控方面的作用机制。【方法】 选取绵羊CCL19基因5'-侧翼序列1 000 bp,PCR扩增启动子的7个不同长度的截短片段,并连接至pGL3-Basic质粒;将重组质粒与pRL-TK质粒共转染到293T细胞中,结合双荧光素酶报告基因检测系统分析不同截短片段的相对荧光活性。利用在线预测软件分析和筛选CCL19基因核心启动子区域内的转录因子结合位点。采用定点突变技术构建转录因子结合位点缺失的荧光素酶报告载体,与pRL-TK质粒共转染到293T细胞,分析转录因子结合位点缺失质粒的相对荧光活性。【结果】 成功构建了7个不同长度(pGL3-P、pGL3-P1、pGL3-P2、pGL3-P3、pGL3-P4、pGL3-P5及pGL3-P6)的CCL19基因启动子片段的荧光素酶报告载体;采用双荧光素酶报告基因检测系统鉴定出转录起始位点上游－256/－186 bp为CCL19基因启动子核心启动子区域,表明该区域对CCL19基因转录调控有重要作用。生物信息学分析预测到该区域存在POU5F1(-201/-189 bp)、ZBTB26(-228/-217 bp)、FOXI1(-239/-228 bp)、GLI2(-255/-243 bp)和SP2(-219/-211 bp) 5个转录因子的结合位点,并成功构建了转录因子结合位点缺失的荧光素酶报告载体。双荧光素酶报告基因检测系统分析显示,POU5F1转录因子的结合位点缺失后绵羊CCL19基因转录活性极显著降低(P<0.01),FOXI1、ZBTB26、SP2转录因子结合位点缺失后绵羊CCL19基因转录活性均极显著升高(P<0.01)。【结论】 试验成功构建CCL19基因启动子荧光素酶报告载体,确定CCL19基因启动子的核心启动子区域为转录起始位点上游－256/－186 bp,并鉴定出转录因子POU5F1结合位点可能是CCL19基因转录的重要调控位点,为下一步研究绵羊CCL19基因在先天性免疫、适应性免疫和淋巴细胞迁移等方面的功能提供理论基础。     

牛MYOZ2基因启动子克隆及活性分析

旨在克隆测定牛肌原调节蛋白2基因(Myozenin2,MYOZ2)启动子的全长序列,进行活性区域分析,为牛MYOZ2基因功能和表达调控机理研究提供理论依据。通过5′RACE方法确定牛MYOZ2基因转录起始位点;采用PCR技术,以牛基因组为模板克隆MYOZ2基因启动子序列。利用在线软件分析启动子区域中可能包含的转录因子结合位点。依据分析结果重新设计引物,构建7个包含不同缺失片段的双荧光素酶报告基因载体,转染C2C12细胞系,利用双荧光素酶系统检测不同片段的启动子活性。结果表明,克隆得到牛MYOZ2基因启动子序列2 065bp,确定MYOZ2基因的转录起始位点;MYOZ2基因片段-84/+125荧光素酶相对活性极显著高于空载体pGL3-Basic(P0.01),MYOZ2基因片段-683/+125荧光素酶相对活性极显著高于基因片段-263/+125(P0.01)。MYOZ2基因启动子核心区域位于-84/+125bp,而且MEF2,SRF,MyoD,YY1等转录因子可能参与MYOZ2基因的转录调控。     

猪DKK1基因启动子区的克隆及其活性分析

旨在初步探索DKK1基因转录调控机制,本研究利用启动子在线预测软件分析了该基因启动子区序列特征,根据Ensembl数据库已公布的猪DKK1基因的5′侧翼区序列,设计特异性PCR引物进行扩增、测序,进而构建启动子区不同缺失片段的pGL3-DKK1双荧光素酶表达载体,分别转染293T细胞和Hela细胞,并进行双荧光素酶报告基因检测。结果显示,DKK1基因启动子中含有1个TATA-box、多种转录因子和1个CpG岛;DKK1基因启动子对239T细胞具有偏好性,其中p-1 679/+292bp启动子片段活性最高,且显著高于其他缺失片段(P0.01)。-953~-1 679bp为核心启动子区域,-586~-953bp区域可能存在负调控元件,在-953~-1 679bp区域可能存在正调控元件。本试验通过对DKK1基因进行生物信息学分析并结合不同长度启动子片段双报告基因活性检测,证实了DKK1基因的5′侧翼区序列具有启动子转录活性,并初步确定了该基因的启动子区域,找到了启动子的核心区域和主要调控区域,为进一步研究DKK1基因转录调控机制奠定基础。     

北极狐MITF-M基因启动子活性及转录调控元件的分析

为了探究MITF-M基因对狐狸毛色的遗传调控机制,利用PCR扩增技术对北极狐MITF-M基因启动子区6个缺失片段(2 279,1 738,1 313,1 040,524和236 bp)进行扩增,利用双荧光素酶报告基因检测技术对该基因启动子表达载体转染细胞(A375和293T)的相对活性进行检测,通过在线软件对核心启动子区转录因子结合位点进行预测,利用重叠延伸PCR和双荧光素酶报告系统检测技术对预测出来的转录因子结合位点进行点突变活性分析。结果表明,北极狐MITF-M基因启动子区524 bp(-510 bp/+13 bp)处活性最高,预测发现-510 bp/-222 bp区域存在CREB(-312 bp/-319 bp)、Sp1(-295 bp/-307 bp)和Sp1(-249 bp/-262 bp)转录因子结合位点,这3个转录因子结合位点突变后能使北极狐MITF-M基因的启动子活性上升。综上,北极狐MITF-M基因核心启动子区在-510 bp/-222 bp区域,转录因子结合位点CREB(-312 bp/-319 bp)、Sp1(-295 bp/-307 bp)和Sp1(-249 bp/-262 bp)对北极狐MITF-M基因的转录激活起到一定的调控作用。     

调控民猪Tβ4基因转录因子的筛选与分析

为了筛选调控民猪胸腺β4(Tβ4)基因转录的增强子,探究该基因的表达调控机制,本研究以民猪基因组DNA为模板,通过PCR扩增Tβ4基因启动子区系列截短片段,与pMD18-T载体连接构建克隆质粒;通过双酶切和连接反应将系列截短片段定向连入pGL3-basic载体构建双荧光素酶重组质粒;将重组质粒转染PK15细胞系,利用双荧光素酶检测系统测定重组质粒的相对荧光素酶活性;根据相对荧光素酶活性的高低进一步筛选Tβ4基因的启动子核心区域;利用3个在线软件预测核心区域内的转录因子结合位点,根据预测结果,使用重叠PCR定点缺失转录因子结合位点构建突变载体,在PK15细胞中以野生型载体为对照检测突变载体的相对荧光素酶活性。结果表明,试验成功构建了6个Tβ4基因系列截短的启动子片段,其中5个片段具有明显的活性。经过两轮的双荧光素酶活性检测发现,-155～-105 bp区域为民猪Tβ4基因的启动子核心区域,经生物信息学分析发现,该区域存在E2F-1、MYBAS1和ELK-1转录因子的结合位点。利用定点缺失构建了3个转录因子缺失的突变载体,经双荧光素酶检测发现仅有ELK-1结合位点的缺失,会造成启动子活性的显著下降(P0.05)。据此推测ELK-1是民猪Tβ4基因转录的正调控元件。     

调控民猪Tβ4基因转录因子的筛选与分析

为了筛选调控民猪胸腺β4（Tβ4）基因转录的增强子,探究该基因的表达调控机制,本研究以民猪基因组DNA为模板,通过PCR扩增Tβ4基因启动子区系列截短片段,与pMD18-T载体连接构建克隆质粒;通过双酶切和连接反应将系列截短片段定向连入pGL3-basic载体构建双荧光素酶重组质粒;将重组质粒转染PK15细胞系,利用双荧光素酶检测系统测定重组质粒的相对荧光素酶活性;根据相对荧光素酶活性的高低进一步筛选Tβ4基因的启动子核心区域;利用3个在线软件预测核心区域内的转录因子结合位点,根据预测结果,使用重叠PCR定点缺失转录因子结合位点构建突变载体,在PK15细胞中以野生型载体为对照检测突变载体的相对荧光素酶活性。结果表明,试验成功构建了6个Tβ4基因系列截短的启动子片段,其中5个片段具有明显的活性。经过两轮的双荧光素酶活性检测发现,-155~-105 bp区域为民猪Tβ4基因的启动子核心区域,经生物信息学分析发现,该区域存在E2F-1、MYBAS1和ELK-1转录因子的结合位点。利用定点缺失构建了3个转录因子缺失的突变载体,经双荧光素酶检测发现仅有ELK-1结合位点的缺失,会造成启动子活性的显著下降（P<0.05）。据此推测ELK-1是民猪Tβ4基因转录的正调控元件。     

水牛HSD17B1基因启动子荧光素酶报告基因载体构建与分析

试验旨在筛选水牛HSD17B1基因启动子活性区域及影响因素，并预测其转录结合因子，为探究该基因在水牛繁殖性能中的调控机理提供理论依据。以水牛血液基因组DNA为模板，PCR扩增得到3个HSD17B1基因启动子活性区域序列，并定向克隆至pGL3-promoter载体；将重组质粒转染到水牛卵泡颗粒细胞，通过双荧光素酶检测系统测定相对荧光素酶活性，并探究其与促黄体素（luteinizing hormone，LH）和促卵泡素（follicle stimulating hormone，FSH）的关系；利用生物信息学方法对HSD17B1基因启动子区进行转录结合因子预测。结果显示，本试验成功克隆了3个不同长度的HSD17B1基因启动子片段，并成功构建了双荧光素酶报告载体。经不同长度启动子片段的活性检测发现，pGL-pro-HSD17B1-1500活性最强，证实－866/－1 500 bp为HSD17B1基因核心启动子区域，表明该区域对HSD17B1基因转录调控有重要作用。荧光素酶活性检测结果显示，添加LH可增强HSD17B1基因启动子活性。生物信息学分析发现，HSD17B1基因启动子区存在6个转录因子结合位点：Sp1（－2 327/－2 317 bp）、HOXA4（－2 162/－2 146 bp）、Sp1（－1 409/－1 395 bp）、Sp1（－1 391/－1 380 bp）、Sp1（－1 345/－1 319 bp）和GATA1（－812/－801 bp），但无CpG岛，有1个TATA-box和2个CAAT-box。本研究成功构建了HSD17B1基因启动子荧光素酶报告载体，确定了HSD17B1基因启动子核心区域，并证明LH可增强启动子活性。     

山羊卵巢维持基因FOXL2启动子活性及调控区域分析

旨在研究山羊卵巢维持基因FOXL2启动子活性以及探究该基因的调控机理。从NCBI数据库调取FOXL2基因启动子序列,用生物信息学软件对其核心启动子和转录因子进行预测分析。使用PCR技术克隆FOXL2基因启动子序列,并构建一系列缺失载体,瞬时转染293T和A375细胞,利用双荧光素酶基因检测仪测定相对荧光素酶活性值。结果表明,该基因启动子区域存在两个典型的CpG岛,分别位于(-920/+51(972bp))和(+125/+555(430bp))区域;经KpnⅠ和HindⅢ双酶切鉴定表明,重组载体质粒构建正确;在细胞中插入不同长度的FOXL2基因启动子片段,随着启动子5′端截短,荧光素酶转录活性先升高再逐渐降低。(-934/+324)区域存在转录活性,(-32/+324)区段包含了转录的基本元件;(-934/-456)区域在转录过程中对FOXL2基因起负调控作用,(-456/-192)区域为正调控区域。     

山羊脂肪酸合酶基因(FASN)启动子结构与功能的初步分析

本研究旨在对山羊脂肪酸合酶基因(Fatty acid synthase,FASN)启动子进行结构与功能的初步分析,进而对其转录调控机制进行探讨。采用PCR技术从西农萨能羊基因组DNA中克隆FASN基因启动子,通过缺失分析,构建7个包含不同缺失片段的荧光素酶报告基因载体,转染山羊乳腺上皮细胞和MCF-7细胞,利用双荧光素酶系统检测不同片段的启动活性。结果表明,克隆得到FASN基因的启动调控序列2 589bp,生物信息学分析发现,该启动子序列含有典型的启动转录元件TATA-box和E-box,分别位于转录起始位点(+1)上游-41和-74bp处。报告基因分析表明,启动子核心区域定位在-293～-79bp,在线软件预测发现,该区域含有Sp1、NF-Y、USF和SREBP等转录因子结合位点。结果显示,FASN基因启动子前端存在负调控元件,Sp1、NF-Y、USF和SREBP等转录因子可能参与FASN基因的转录调控。     

猪StAR基因启动子区克隆及其转录活性研究

旨在通过分析猪StAR基因启动子活性区域,探究猪StAR基因的转录调控机制,从育种学角度为提高猪繁殖力提供新思路。本研究根据Ensembl数据库已公布的猪StAR基因的5′侧翼区序列,利用在线预测软件对该基因启动子区序列信息进行分析,以大白猪基因组DNA为模板,利用特异性引物,进行PCR扩增、测序,进而构建启动子区不同缺失片段的pGL3-StAR双荧光素酶表达载体,转染293T细胞并进行活性检测。结果显示,StAR基因5′侧翼区不含有典型的TATA-box和CpG岛;成功克隆了10个含有不同长度的启动子片段,并构建了各片段与表达载体的重组质粒;转染293T细胞后经双荧光素酶活性检测发现,大白猪StAR基因5′侧翼区存在着核心启动子,其中-196~+127bp这一区域活性值最高,且显著高于其他缺失片段(P0.01),表明在+127~-196bp的区域内存在重要的正调控因素,外显子1对启动子活性起重要的调控作用。-41~-196bp为核心启动子区域,该区域存在着关键的正调控元件,包含GATA2、GATA4、SP1、ZNF263、Hoxa9、KLF16和ZNF740转录因子结合位点。本试验通过对StAR基因进行生物信息学分析,并结合不同长度启动子片段双报告基因活性检测,证实了StAR基因的5′侧翼区序列具有启动子转录活性。初步确定了该基因的启动子区域,找到了启动子的核心区域和主要调控区域,为进一步研究StAR基因转录调控机制提供理论依据。     

猪Nhlh2基因启动子活性及其表达调控的初步研究

旨在研究母猪Nhlh2基因启动子活性及其与转录因子之间的调控关系,为探索该基因的表达调控提供分子水平的依据,也为研究母猪繁殖机制提供一定的参考。本研究以猪卵巢组织DNA为模板,PCR扩增Nhlh2不同长度的启动子缺失片段,克隆到pGL3-basic载体构建启动子报告基因重组质粒,并将其转染到猪卵巢颗粒细胞,测定相对双荧光素酶活性值;通过染色质免疫共沉淀技术(ChIP),研究Nhlh2启动子与YY1、C/EBPβ蛋白之间的相互作用;随后构建转录因子超表达、突变载体和小干扰RNA(siRNA),利用双荧光素酶检测系统进行活性验证。经双荧光素酶报告系统检测发现,Nhlh2基因的P7(-238~+129)区域启动子转录活性最高,-654~-238片段范围可能存在负调控元件,-238~-20区域可能存在正调控元件;通过生物信息学分析和ChIP验证,Nhlh2启动子区-101~-85和-153~-140区域分别是转录因子YY1和C/EBPβ的结合位点;突变YY1和C/EBPβ的结合位点后,P7的双荧光活性显著上调;超表达YY1和C/EBPβ后,P7的双荧光活性显著下调;干扰YY1和C/EBPβ的表达后,P7的双荧光活性显著上调。本研究确定了猪Nhlh2基因的核心启动子区域为-238~+129,YY1和C/EBPβ分别结合在Nhlh2基因启动子区的-101~-85和-153~-140区域,抑制猪Nhlh2基因的转录活性。     

牛骨骼肌α-actin基因5′上游调控元件及内含子功能的初步分析

采用PCR定点突变分析法确定牛骨骼肌α-actin启动子-361~-462bp区域的调控元件Sp1/KLFs、ZF5F和Pax3结合位点的功能;利用基因重组技术,将内含子Ⅰ和内含子Ⅱ分别连在启动子缺失片段的上游和下游,构建双荧光素酶表达载体,使其转染牛骨骼肌卫星细胞和胎儿成纤维细胞,进行活性检测。结果显示,Sp1/KLFs降低牛骨骼肌α-actin基因启动子活性,ZF5F和Pax3均能增强启动子活性。内含子在启动子上游增强了启动子活性,在其下游降低了启动子活性,且顺式调控元件和内含子均具有肌肉特异性。结果表明,初步确定了参与牛骨骼肌α-actin基因转录调控的负顺式调控元件Sp1/KLFs,正顺式调控元件ZF5F和Pax3,发现了内含子插入启动子的位置很重要,为以后构建牛骨骼肌α-actin高活性的启动子奠定了基础。     

牛MyoG基因启动子的克隆及功能的初步分析

本研究旨在比较日本和牛MyoG基因的不同长度片段启动子的活性强弱并初步探讨其中的机制。根据GenBank已公布的牛MyoG基因的启动子序列,设计特异性PCR引物扩增日本和牛MyoG基因的一系列启动子缺失序列,构建重组克隆载体pMD18-T-MyoGpro,对阳性克隆进行限制性酶切鉴定、测序及生物信息学分析,进而构建一系列启动子缺失片段的pGL3-MyoGpro双荧光素酶表达载体,转染牛肌源干细胞(MDSCs)和牛胎儿成纤维细胞,并进行双报告基因活性检测。结果表明,日本和牛MyoG基因的166～2 125bp启动子都能不同程度的启动双荧光素酶报告基因在牛肌源干细胞中的表达,且具有肌肉特异性。通过生物信息学分析得知日本和牛MyoG启动子序列中有1个TATA盒,15个E-box,并可能含有MyoD、MEF2、MEF3、MTBF、TEF1、PRDF、Sp1、多个SRF、ERE、GRE及多个Oct-1等转录因子调控结合位点,本试验通过比较不同长度启动子片段的活性并结合对上述转录因子的分析,认为这些转录因子可能对启动子活性起着重要的调控作用。对牛MyoG基因启动子的克隆与功能和序列分析为进一步研究MyoG基因的表达调控奠定了基础。     

山羊DCT基因启动子活性区及其转录因子调控探究

旨在探究山羊DCT基因启动子活性区及相关转录因子对该基因的调控作用,为山羊DCT基因的表达调控提供理论依据。通过对山羊DCT基因5′侧翼区序列及第一外显子区序列进行生物信息学分析,并与人和小鼠DCT基因启动子序列进行比对,同时结合在线启动子预测结果,采用快速克隆的方法构建5个5′系列缺失序列的启动子报告基因载体,以此为基础构建3′缺失序列的6个报告基因载体,并构建SOX10、MITF和OTX2转录因子结合位点点突变的6个报告基因载体,以瞬时转染的方法转染A375细胞,双荧光素酶检测试剂盒检测缺失片段和点突变片段的启动子活性。结果表明,成功构建了山羊DCT基因11个不同长度的启动子报告基因载体,-990~+232bp的P3片段荧光素酶活性极显著高于其他片段(P0.01),基于P3构建的3′系列缺失片段中-881~-154bp的P8片段荧光素酶活性极显著高于其他片段(P0.01)。转录因子SOX10结合位点突变的载体荧光素酶活性极显著降低(P0.01),MITF和OTX2结合位点突变的载体荧光素酶活性极显著增强(P0.01)。山羊DCT基因启动子核心调控区位于-881~-154bp区域,转录因子SOX10对山羊DCT基因发挥正调控作用,而转录因子MITF和OTX2对山羊DCT基因的调控作用尚需深入研究。     

调控民猪ZBED6基因转录元件的筛选与分析

ZBED6是锌指蛋白家族的一员,在胎盘哺乳动物中极其保守,可通过对IGF2的调控参与骨骼肌生长。为进一步探究ZBED6基因自身的表达调控机制,本研究以民猪基因组DNA为模板,通过常规PCR扩增ZBED6基因启动子区系列截短片段,构建克隆质粒,通过双酶切和连接反应定向连入pGL3-basic载体,利用PK15细胞和双荧光素酶检测系统测定重组质粒的相对荧光素酶活性;利用在线软件预测启动子区的转录因子结合位点,使用重叠PCR定点缺失转录因子结合位点,构建突变载体并在PK15细胞中检测突变载体的相对荧光素酶活性。结果表明:ZBED6基因启动子区-2053^-1777 bp存在多个转录因子结合位点,尤其是-1808^-1777 bp,该片段缺失造成启动子活性下降(P<0.01);利用在线软件在该区间预测到3个转录因子HINFP、Adf-1和CREB3,经实验验证后发现这3个转录因子均可调控ZBED6基因的转录,其中Adf-1效果最为明显。据此推测,民猪ZBED6基因的转录调控机制较为复杂,其启动子区存在HINFP、Adf-1和CREB3等多个调控元件的结合位点。     

海南黑山羊MBL2基因的转录调控元件的筛选与分析

甘露聚糖结合凝集素C(mannose binding lectin C,MBL-C)是C型(Ca²⁺依赖型)凝集素超家族的成员,其作为一种急性期蛋白,具有抗细菌感染的功能,参与机体的天然免疫反应。为鉴定出结合在MBL2基因启动子区(1 009 bp)的重要转录因子,探寻该基因的转录调控机制,本研究选取海南黑山羊MBL2基因的启动子序列1 009 bp,采用DNA重组技术克隆6个转录起始位点上游1 009 bp的启动子5'端侧翼缺失序列,克隆片段经双酶切后连接至pGL3-Basic载体。重组质粒转染至293T细胞中,结合双荧光素酶活性检测系统筛选MBL2基因的核心启动子区域。通过在线生物信息学软件预测山羊MBL2基因的核心启动子区域的转录因子结合位点,利用点突变技术构建转录因子结合位点缺失的载体,转染293T细胞后结合双荧光素酶活性检测系统分析其转录活性。结果表明,海南黑山羊MBL2基因的核心启动子区域位于转录起始位点上游-304~-45 bp范围内,在线软件分析该区域存在RELA、NF-κB2、MZF1等3种转录因子结合位点。双荧光素酶报告分析结果表明,RELA和NF-κB2的结合位点缺失后均使山羊MBL2基因的转录活性极显著下降(P < 0.01)。结果提示,RELA和NF-κB2对山羊MBL2基因的转录活性可能具有重要的正调控作用。该研究为进一步探寻海南黑山羊MBL2基因的功能提供理论依据。