鉴别猪流行性腹泻病毒野毒株与疫苗株双重RT-PCR检测方法的建立

为建立鉴别猪流行性腹泻病毒野毒株与疫苗株的检测方法,本研究根据GenBank中登录的猪流行性腹泻病毒(PEDV)M、ORF3基因序列,设计合成了2对特异性引物,通过PCR扩增条件的优化,建立了鉴别PEDV野毒株和疫苗株的双重RT-PCR检测方法。特异性试验显示,该检测方法对猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、Salmonella及E.coli等结果均为阴性;敏感性试验显示,所建立的双重PCR检测方法对M基因和ORF3基因的最低有效检测量分别为44.5拷贝/μL和481拷贝/μL。本研究建立的双重RT-PCR检测方法可实现对PEDV野毒和疫苗毒的快速检测,适合于现地猪流行性腹泻的鉴别诊断。     

猪流行性腹泻病毒野毒株/疫苗株RT-PCR鉴别诊断方法的建立

开放阅读框3(Open reading frame 3,ORF3)是猪流行性腹泻病毒(PEDV)基因组中的惟一辅助基因。前期研究表明,PEDV疫苗株的ORF3在245²93位缺失49个核苷酸。在ORF3缺失区域两端设计合成引物建立反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)可以对PEDV野毒株和疫苗株进行鉴别诊断,野毒株扩增产物为319 bp,疫苗株扩增产物为270 bp。用该鉴别诊断方法对猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒和猪繁殖和呼吸综合征病毒的cDNA进行扩增均无特异性条带,说明该方法特异性强。现地病料的检测结果表明,该鉴别诊断方法能够区分PEDV野毒和疫苗株,而且可以排除其他病毒的影响,有助于减少免疫猪被淘汰的可能,降低经济损失。     

猪流行性腹泻病毒疫苗株与野毒株RT-PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank中猪流行性腹泻(PED)疫苗株与野毒株ORF3的特点设计特异性引物,建立能够快速区分PEDV疫苗株与野毒株的RT-PCR检测方法。建立的RT-PCR检测方法能够对PEDV疫苗株与野毒株扩增出特异性片段,其大小分别为278 bp和327 bp。该方法具有快速、特异、通用等特点,可用于实验室快速诊断、野毒株的区分,为该病的诊断及免疫防控提供参考依据。     

猪流行性腹泻病毒野毒株及弱毒疫苗株RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用

为建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)野毒株及弱毒疫苗株快速鉴别检测方法,根据Gen Bank中公布的PEDV野毒株及弱毒疫苗株的ORF3基因序列,在缺失区的两端设计合成1对特异性扩增引物,用以特异性的扩增PEDV ORF3基因片段,根据目的片段大小判断PEDV的毒株类型;通过退火温度等反应条件优化,建立了区分PEDV野毒株和弱毒疫苗株的RT-PCR鉴别检测方法。结果显示:所建立的RT-PCR鉴别检测方法能特异性区分PEDV野毒株和弱毒疫苗株;PEDV野毒株扩增出234 bp目的片段,PEDV弱毒疫苗株扩增出185 bp目的片段;与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、A群猪轮状病毒(PRo VA)、猪嵴病毒(PKV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪乙型脑炎病毒(JEV)及猪细小病毒(PPV)均无交叉反应;敏感性试验显示,该方法能检测到病毒滴度为1.3×10~3TCID_(50)/mL。利用该方法对采集自广西部分地区93份临床腹泻样品进行检测,临床腹泻样品中PEDV野毒株阳性率为61.29%(57/93),弱毒株阳性率为5.38%(5/93)。结果表明:该RT-PCR鉴别检测方法特异性强、灵敏度高、操作简便,能快速、准确地区分PEDV自然感染野毒株和弱毒疫苗毒株,为猪流行性腹泻的快速诊断及病原分子鉴别检测研究提供了可供借鉴的技术手段。     

鉴别猪流行性腹泻疫苗毒株与野毒株巢式PCR检测方法的建立及初步应用

根据Gen Bank中猪流行性腹泻病毒(PEDV)的基因序列分别设计两对引物,在完成最佳条件筛选、特异性、敏感性试验的基础上,建立一种快速区分PEDV疫苗毒株与野毒株的巢式PCR检测方法。建立的PCR快速检测方法能分别对PEDV疫苗毒株和野毒株扩增出特异性片段,片段大小分别为774 bp、150bp。该方法对传染性胃肠炎病毒(TGEV)、轮状病毒(Po RV)、猪瘟病毒(HCV)、伪狂犬病病毒(PRV)则不能扩增出特异性片段。该方法具有快速、灵敏、特异、通用等特点,可用于实验室的快速诊断、分子流行病学的调查和野毒株的分离鉴定。     

犬瘟热病毒野毒株与疫苗株鉴别检测RT-LAMP方法的建立

为建立一种鉴别犬瘟热病毒(CDV)野毒株与疫苗株的反转录-环介导等温扩增方法(RT-LAMP),本研究通过比对野毒株与疫苗株H基因设计特异性引物,对反应体系中的Mg2+、Betaine、Bst DNA Polymerase、dNTP和反应温度等条件分别进行优化,建立用于鉴别检测CDV野毒株与疫苗株的RT-LAMP。建立的RT-LAMP方法检测CDV野毒株时,在65℃水浴锅中反应40 min即可完成。该方法具有高度特异性,对犬细小病毒、犬腺病毒、狂犬病毒、犬冠状病毒无交叉反应,敏感度可达40 copies/μL,是常规RT-PCR方法的100倍。     

猪伪狂犬病病毒疫苗株与野毒株鉴别PCR检测方法的建立及初步应用

本试验根据疫苗株缺失gE基因、野毒株和疫苗株均有gB基因的特点,设计两对引物,建立了PCR方法,使用该方法分别对PRV、PCV2、PPV、CSFV、PRRSV进行PCR检测,结果只能从PRV Fa野毒株DNA提取物中扩增出354、237 bp的核苷酸片段,从PRV Bartha-K61疫苗株扩增出237 bp的片段,其他病毒均未扩出条带,达到了区分疫苗株与野毒株的目的。同时,应用该方法对吉林省各大猪场进行了临床病料检测,结果表明,在采集的205份病料中有32份检测为猪伪狂犬病病毒野毒感染,阳性率为15.6%。     

猪流行性腹泻病毒变异毒株与传统毒株RT-PCR鉴别诊断方法的建立

为建立猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)变异毒株和传统毒株RT-PCR鉴别诊断方法,本研究根据GenBank中PEDV变异毒株(JN381492.1)和传统毒株(JN599150.1)S基因序列,设计两对特异性引物,进行反应条件优化。结果显示:建立的RT-PCR鉴别诊断方法能够特异性区分PEDV变异毒株和传统毒株,能扩增出变异毒株442 bp的目的片段,而传统毒株是270 bp的目的片段,并且与猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、猪呼肠孤病毒、猪瘟病毒、猪脑心肌炎病毒、轮状病毒均无交叉反应;敏感性结果表明该方法能检测出变异毒株和传统毒株的底限均为4×104 copies;利用该方法对42份临床腹泻样品进行检测,PEDV阳性率为69%(29/42),变异毒株占总PEDV毒株的93.1%(27/29),传统毒株占总PEDV毒株的6.9%(2/29)。该RT-PCR方法为PEDV的病原鉴别诊断和流行病学调查提供了技术手段。     

鉴别犬瘟热病毒野毒株与疫苗株双重一步法RT-PCR检测方法的建立与应用

为了建立一种简单、快速鉴别检测犬瘟热病毒(CDV)野毒株与疫苗株的方法,试验根据GenBank中CDV野毒株与疫苗株H基因序列设计鉴别检测引物,建立鉴别CDV野毒株与疫苗株一步法RT-PCR,并验证该方法的特异性、敏感性、重复性及符合性;利用建立的鉴别CDV野毒株与疫苗株双重一步法RT-PCR检测方法对2017—2020年采集于江苏省11个不同地市的505份发病犬喉拭子样品和病料样品进行检测,确定CDV野毒株与疫苗株双重一步法RT-PCR的临床适用性。结果表明：该方法对CDV野毒株、CDV疫苗株、CDV野毒株/疫苗株可分别扩增出477 bp、677 bp、477 bp/677 bp的特异性条带,而检测犬细小病毒(CPV)、犬腺病毒(CAV)、犬副流感病毒(CPIV)、犬冠状病毒(CCV)均为阴性;该方法的检测灵敏度为23.1 pg RNA;与RFLP方法的符合率为100%;批内重复性检测和批间重复性检测的结果完全一致;利用该方法检测505份临床样品,CDV野毒株和疫苗株的阳性率分别为8.91%和72.48%。说明建立的鉴别CDV野毒株与疫苗株一步法RT-PCR检测方法具有良好的特异性、...     

猪流行性腹泻病毒变异毒株一步法RT-PCR鉴别检测方法的建立及临床应用

为了建立一种快速鉴别检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异毒株的病原学方法和掌握洛阳市PEDV变异毒株的流行规律,试验根据GenBank中PEDV变异毒株的特异性序列设计引物,通过优化退火温度、模板添加量、引物添加量建立PEDV变异毒株一步法RT-PCR鉴别检测方法,并分析了该方法的特异性、敏感性和重复性;同时应用该方法检测采集自洛阳市的251份临床样品,并对不同地区、不同年份、不同养殖模式的检测结果进行比较分析。结果表明：优化后的退火温度为51℃,模板添加量为5μL,引物添加量为0.5μL;该方法对PEDV变异毒株能够扩增出550 bp特异性条带,而检测的PEDV经典毒株、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(RV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)均为阴性;对PEDV变异毒株RNA的最低检测限达到0.74 ng,对3份PEDV变异毒株阳性病料和3份PEDV变异毒株阴性病料重复检测3次的结果完全一致;检测采集于洛阳市251份临床样品的平均阳性率为29.48%,其中不同地区阳性率...     

猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株RT-PCR-RFLP鉴别检测方法的建立

本研究旨在建立猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株RT-PCR-RFLP鉴别检测方法。根据Shimen株设计1对特异性引物,建立猪瘟病毒RT-PCR-RFLP检测方法;对20份疑似猪瘟临床样品进行检测,并对检出的山东8株流行野毒株和2株疫苗株PCR产物进行克隆与序列分析,验证上述方法。结果RT-PCR扩增片段为825bp,产物经RFLP分析,野毒株的PCR产物能被ApaⅠ酶切为322bp和503bp 2个片段,兔化弱毒疫苗株则不能被酶切,检测出RNA的最低浓度为0.028 6μg.mL-1;8株流行野毒株都含GGGCCC序列(ApaⅠ酶切位点),2株疫苗株相应序列为GAGCCC,不能被ApaⅠ酶切;8株流行野毒株属于基因2群,2株疫苗株与HCLV遗传关系近,为基因1群。建立了可鉴别猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株RT-PCR-RFLP检测方法,为猪瘟的防控提供有效手段。     

基于US区缺失位点猪伪狂犬病病毒疫苗株与野毒株鉴别诊断方法的建立

依据GenBank中公布的猪伪狂犬病病毒全基因组序列,针对gI、gE、28K、TK四个基因序列,设计、合成了5条引物,并对野毒株SA株、gI-/gE-/PRVSA双基因缺失株和Bartha K61疫苗株进行了扩增,得到2061bp、1323bp、801bp和963bp特异性目的条带,其中BarthaK61疫苗株基因组检测最小浓度为136pg/μL。建立了针对野毒株和两种疫苗株的鉴别诊断方法。     

鉴别猪流行性腹泻病毒经典株与变异株双重纳米RT-PCR检测方法的建立和应用

为了建立快速高效鉴别猪流行性腹泻病毒(PEDV)经典株与变异株的检测方法,本研究参照GenBank中PEDV经典株CV777和变异株CH-HB1-2018的S基因序列,设计了3条特异性引物,并以纳米金颗粒作为热导介子,通过优化PCR反应条件,建立了能够区分PEDV经典株和变异株的双重纳米RT-PCR检测方法.利用该方法...     

猪瘟病毒野毒株与疫苗株E2基因双重TaqMan real-time PCR鉴别检测方法的建立

为建立猪瘟病毒(CSFV)野毒株和疫苗株快速定量鉴别检测方法,根据CSFV野毒株和疫苗株E2基因序列差异,设计了2对特异性引物及1条Taq Man探针,以含CSFV HB株和C-株E2基因的重组质粒p BS-E2C和p BS-E2作为标准品,建立了能同时检测CSFV野毒株和疫苗株的双重Taq Man real-time PCR鉴别检测方法。结果表明,建立的CSFV双重Taq Man real-time PCR标准曲线Ct值与1×101~1×106copies/μL之间的E2基因拷贝数呈良好的线性关系,灵敏度达10 copies/μL,且特异性和重复性很好。综上,本试验建立的Taq Man real-time PCR检测方法可用于CSFV野毒株和疫苗株的鉴别诊断及病原定量分析。     

猪流行性腹泻病毒胶体金检测方法的建立

应用胶体金免疫层析技术,建立了一种快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的方法。采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记纯化的抗猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体m Ab-PEDV1C12和(m Ab)-PEDV2C11,并将m Ab-PEDV2C11和羊抗鼠Ig G抗体喷在硝酸纤维素膜上分别作为检测线和质控线,对pH值、抗体浓度、封闭时间等条件摸索与优化。测试结果表明,该猪流行性腹泻病毒快速检测试纸条的检测下限达到310个TCID50的病毒量,检测时间为10 min,批内和批间重复性为100%。结论:该方法使用简单快速,适合猪场检测猪流行性腹泻病毒。     

猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立

试验根据GenBank上发表的猪流行性腹泻病毒(PEDV)核衣壳(N)蛋白基因序列,设计合成了一对寡聚核苷酸引物,扩增大小为245 bp的目的片段,建立起PEDV N基因的RT-PCR检测方法。试验结果表明,该方法具有很强特异性和很高的敏感性,可作为猪流行性腹泻临床快速诊断的一种方法。     

鉴别MS-H疫苗株和MS野毒株的MAMA-PCR检测方法的建立与初步应用

根据Kreizinger Z等~([1])已发表的研究,依据obg基因第367位和629位的核苷酸转换,我们建立了依托琼脂糖凝胶电泳(常规PCR)的错配扩增突变分析(MAMA)方法以区分ts+MS-H疫苗株、ts-MS-H再分离株以及MS野毒株。本研究对本实验室保存的客户送检的MS分离株的阳性病料,以及日常场区送检咽喉拭子MS通用引物检测的阳性样品进行MAMA-PCR扩增,用以比对各分离株目的片段的差别,建立MS-H疫苗株与MS野毒株的鉴别方法,这将为临床鸡群MS感染状态的评估提供参考依据,也为MS的净化和防控提供技术指导。     

猪流行性腹泻病毒RT-LAMP检测方法的建立与应用

针对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M基因设计LAMP引物,对反应体系的条件优化并进行特异性及敏感性等试验。结果显示:该方法在60℃下恒温扩增60min,使PEDV的M基因得到了高效率特异性扩增。本试验方法特异性好,与猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRSSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪细小病毒(PPV)及猪伪狂犬病病毒(PRV)等无交叉反应,同时也具有较好的灵敏性,最低检测分子拷贝数为1.0×102 copies/μL。反应结束后加入SYBR GreenⅠ在紫外灯下观察颜色变化,结果显示阳性扩增产物呈现绿色荧光。结果表明:该LAMP检测方法特异性强,灵敏度高,操作便捷,适于临床检测PEDV。     

猪流行性腹泻病毒RT-LAMP检测方法的建立与应用

为建立一种适用于现场快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的环介导等温扩增(LAMP)检测方法,针对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M基因编码区序列,分别设计合成3组引物,通过对引物的筛选和反应条件优化,建立了PEDV RT-LAMP可视化快速检测方法。灵敏度和特异性试验结果显示,本方法在65℃45 min对PEDV的检测灵敏度为2 copies/μL,与猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒均无交叉反应。利用该方法对30份送检的临床样品进行检测,检出阳性样品8份,与荧光定量RT-PCR检测结果一致。试验表明,所建立的RT-LAMP检测方法具有特异性好、灵敏度高、快速、结果可视、设备适用范围广等优点,适用于PEDV现场快速检测。