PCV2 Rep蛋白N-糖基化位点突变对病毒复制的影响

N-糖基化对病毒的感染与增殖均具有重要作用,与PCV2复制相关的Rep蛋白含有三个N-糖基化位点。为了分析PCV2Rep蛋白N-糖基化位点突变对病毒复制的影响,本试验构建了三个双拷贝突变体感染性克隆2M23、2M256、2M286,并成功拯救病毒。通过间接免疫荧光检测病毒的拯救效果,TCID50测定病毒的感染力,荧光定量PCR检测细胞病毒的载量。结果显示,PCV2Rep蛋白的23~25aa、256~258aa N-糖基化位点突变后降低病毒的复制能力,而286~288aa突变后增强病毒的复制能力,为进一步阐明PCV2的复制及致病机制提供参考。     

猪圆环病毒2型2015JS株的分离鉴定及全基因序列分析

采用细胞传代法对PCR检测为猪圆环病毒2型(PCV2)阳性的病料进行病毒分离,通过PCR、间接免疫荧光试验(IFA)对分离的病毒进行初步鉴定,应用IFA测定分离株的TCID50。应用PCR特异性扩增出该分离株的全基因组,经测序后进行同源性和系统进化分析。结果:成功分离到1株PCV2毒株,全基因组长度为1 766 bp,命名为2015JS株,分离株在细胞上的TICD50为10-5.50,与乌拉圭毒株Uy99(Gen Bank登录号KP867050)的同源性最高(99.8%),同属PCV2d型;与丹麦PCV2c毒株DK1980PMWSfree(Gen Bank登录号EU148503)的同源性最低(94.3%)。研究结果为江苏PCV2流行病学的研究和遗传变异的防控提供了参考资料,也为江苏PCV2疫苗毒株提供了选择依据。     

猪圆环病毒1型感染性克隆的构建与病毒拯救

用PCR法扩增猪圆环病毒1型（PCV1）全长基因组,将2个基因组顺式连接插入到pUC19质粒载体中构建感染性分子克隆。通过引物设计替换碱基,在病毒基因组内插入SalI酶切位点作为分子靶标,拯救出带有分子标记的克隆病毒,命名为recPCV1／G株。通过免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）在病毒感染细胞中检出病毒抗原,其抗原性仅与PCV1／Cap蛋白单价特异性抗体发生反应,而与抗PCV2／Cap蛋白抗体无交叉。克隆毒株基因组内插入一个SalI酶切位点,可用PCR结合限制性片段长度多态性分析法（PCR-RFLP）与亲本病毒相鉴别。该毒株经细胞连续传10代,体外培养增殖性能稳定,病毒滴度达10^4.8 TCID50/mL。构建的PCV1感染性克隆,为今后开展该病毒的起源与演化、遗传变异规律、分子鉴别诊断等研究奠定了基础。     

猪圆环病毒2型ORF1部分位点突变对病毒复制能力的影响

猪圆环病毒2型(PCV2)可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征,导致仔猪逐渐消瘦。PCV2 ORF1表达的Rep蛋白及其剪切体Rep′是PCV2复制所需的重要蛋白。为了研究PCV2 ORF1部分位点对PCV2复制能力的影响,本试验通过构建PCV2 ORF1区域点突变双拷贝感染性克隆质粒,在无PCV2污染的PK-15细胞中进行病毒拯救,使用荧光定量PCR检测不同位点突变病毒培养不同代次上清液的Ct值。结果：将PCV2 Rep的17 aa、19 aa、20 aa和21 aa突变为丙氨酸后病毒无法成功拯救,2 aa突变后严重影响病毒的复制能力,3 aa、5 aa和18 aa突变后病毒的复制能力增强且细胞病毒载量高于PCV2原毒株,推测17 aa、19 aa、20 aa和21 aa是影响PCV2复制的关键作用位点。本研究结果为未来PCV2复制相关研究提供了试验依据。     

猪圆环病毒2型感染性克隆的构建

为构建猪圆环病毒2型(PCV2)感染性克隆,采用PCR方法从已鉴定为PCV2阳性的病料中扩增PCV2全长基因组片段后将其定向克隆至PVAX1载体中,构建了PCV2感染性克隆质粒p VAX1-PCV2;将重组质粒转染细胞进行病毒拯救,通过免疫过氧化物酶和RT-PCR进行拯救病毒检测,并初步测定了拯救病毒在体外细胞培养的增殖能力和遗传稳定性。结果表明,构建的PCV2感染性克隆质粒,成功拯救出PCV2,拯救病毒盲传8代后毒价可达104.78TCID50/m L,体外增殖能力较为稳定。本试验为深入研究PCV2的基因功能及致病机制等奠定基础。     

猪繁殖和呼吸综合征病毒GP3蛋白糖基化位点突变株的构建及其生物学特性分析

为研究猪繁殖与呼吸系统综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）GP3蛋白糖基化位点的作用,在弱毒疫苗株HuN4-F112感染性克隆的基础上,采用点突变的方法对GP3蛋白N29、N42、N50、N131位进行单点或多点组合突变去糖基化,构建了不同糖基化位点的单点和多点突变的PRRSV全长cDNA克隆,最终成功救获N29Q、N42Q、N50Q、N131Q、N29Q/N50Q、N29Q/N195Q六株含糖基化位点突变的病毒,而其余几种糖基化位点突变组合的全长cDNA未能拯救出病毒。对拯救毒株进行滴度测定及多步生长曲线绘制等特性分析,结果显示N29Q、N42Q、N50Q、N131Q位单个糖基化位点的缺失虽不影响子代病毒的产生但会不同程度地降低PRRSV感染细胞的能力,其中N50Q突变体较亲本下降6个滴度且生长明显延迟。多个糖基化位点同时缺失则会影响病毒的拯救,推测这些糖基化位点可能是产生具有感染性病毒粒子所不可或缺的。     

猪圆环病毒2型标记毒株的构建与iDNA疫苗的初步研究

为实现携带分子标记的猪圆环病毒2型标记毒株的构建,对其进行感染性DNA(iDNA)疫苗的初步研究,即构建的感染性克隆质粒既能发挥DNA疫苗的作用,同时又能在动物机体内拯救出活病毒,发挥病毒活疫苗的作用,本研究以PCV2Cap蛋白末端具有赖氨酸延伸特征的GZ-RH1株为材料,构建该毒株的感染性克隆质粒pcDNA3.1(+)-PCV2,并在病毒基因组中引入1个SalⅠ酶切位点作为鉴别拯救病毒的分子标记。将该感染性克隆质粒转染PK-15传代细胞进行病毒拯救后,通过IPMA、PCR-RFLP以及全基因组测序等试验对拯救病毒进行检测和鉴定,并初步测定了拯救病毒在体外细胞培养的增殖能力。结果表明,利用构建的感染性克隆质粒拯救获得的PCV2标记毒株,经盲传10代后毒价可到105.3 TCID50/mL,分子标记能够稳定存在,该感染性克隆质粒可以应用到PCV2iDNA疫苗的初步研究中。昆明小鼠接毒试验结果表明,构建的感染性克隆质粒在小鼠体内也具有感染性,能够拯救出PCV2标记毒株,且可以诱导产生抗PCV2的抗体,与体外拯救的标记毒株免疫小鼠具有类似的体内生物学特性,表明PCV2iDNA新型疫苗构建策略是可行的。本研究为进一步研究PCV2iDNA疫苗奠定了基础。     

PCV2a和PCV2b感染性克隆的体外拯救

 研究旨在获得PCV2a和PCV2b的拯救毒株。对筛选得到的PCV2a和PCV2b感染性克隆分别进行酶切,使酶切得到的全长基因组DNA自身环化并分别转染PK15细胞。经IFA和PCR验证,确认成功拯救出两亚型PCV2病毒。病毒传至第9代时对PCV2a和PCV2b的毒价分别进行测定,结果显示PCV2a的毒价为103.5TCID50/mL, PCV2b的毒价为104.6TCID50/mL。本试验为分型特异性序列与病毒致病力相关性的研究打下了基础.     

猪伪狂犬病病毒LN1301株分离鉴定及其gE和TK基因的变异分析

通过查明辽宁省猪伪狂犬病(pseudorabies,PR)的传染来源及其病原变异情况,为建立有针对性的诊断与防制方法提供基础依据。采集辽宁某猪场疑似伪狂犬病病死仔猪的脑组织病料,应用非洲绿猴肾(Vero)细胞分离培养,通过电子显微镜观察、病毒中和试验、聚合酶链反应、病毒TCID50测定和动物试验对所分离的病毒进行鉴定。结果确认从辽宁省成功分离到1株猪伪狂犬病病毒野毒株,暂命名为PRVLN/1301株。应用猪伪狂犬病毒(PRV)标准株设计引物对分离到的病毒进行gE和TK基因PCR扩增、T-A克隆、测序,成功扩增克隆出猪伪狂犬病病毒辽宁株PRVLN1301的主要毒力基因gE和TK基因序列。通过系统进化树分析表明该毒株与国内外参考毒株的同源性均在97%以上,核苷酸序列分析结果显示所分离的PRVgE基因存在第995位点由C-A的突变、第999位点由T-G的突变,氨基酸序列比对结果显示存在1个氨基酸L-Q位点的变化,即由亮氨酸变为谷氨酰胺,TK基因没有变异和缺失。说明该毒株与其他地区毒株为同一来源,但存在部分位点的变异。     

鹅源副黏病毒致弱株的“拯救”及分子生物学鉴定

以本课题组前期构建的鹅源副黏病毒NA-1株的全长感染性克隆为模板设计2对引物,用overlap PCR方法将其F蛋白裂解位点处的112、115和117位碱性氨基酸定点突变成为具有典型弱毒株特征的非碱性氨基酸。随后将突变后的F基因序列替换全长感染性克隆的对应序列,构建突变后的克隆质粒FL-cDNA-F′。将改造后的感染性克隆质粒与pCI-NP、pCI-P和pCI-L 3个辅助表达质粒共转染VT7细胞系,成功拯救出了致弱的鹅源副黏病毒。经过分子生物学鉴定,该毒株F基因序列具有典型的弱毒株特征。救获病毒的鸡胚最小致死剂量平均死亡时间(MDT)为96h,表明救获的病毒毒力已被成功致弱,可以作为当前流行的鹅副黏病毒病的一个较为理想的疫苗候选株。     

天津及周边地区猪圆环病毒2型流行情况调查及分离鉴定

为了调查天津及周边地区猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)的感染情况及其分子特征,本研究应用PCR方法对疑似PCV2感染病例开展调查,将阳性病料接种dulac细胞分离病毒,应用PCV2 ORF2基因特异性引物对分离的PCV2进行PCR扩增,克隆、测序后进行核苷酸序列同源性分析。结果显示,不同地区PCV2的阳性率为25.0%~38.1%,其中夏季的阳性率明显高于其他3个季节,达到44.0%;不同阶段猪群中,育肥猪群的PCV2阳性率最高,而哺乳母猪相对较低。经细胞分离得到24株PCV2,其ORF2序列与GenBank中PCV2序列的同源性为87.8%~99.2%,24株分离株之间的同源性为89.4%~100.0%;遗传进化分析显示,24个分离株归属于2个分支。对其中一株分离毒株(Y16155-1株)的体外增殖特性研究表明,第4代接种dulac细胞后6h即可检出PCV2核酸,72h病毒含量达到高峰,病毒滴度为10-4.3 TCID50/0.2mL。本试验结果为进一步研究该地区PCV2分子流行病学及相关疾病的免疫防控奠定了基础。     

3′-U3区碱基突变不影响禽白血病病毒的体外复制能力

为探索近年蛋鸡分离株中出现规律性突变的J群禽白血病病毒(ALV-J)3′-U3区对病毒体外复制能力的影响,以ALV-J原型毒株HPRS-103为骨架,利用融合PCR技术构建含蛋鸡分离株SD09DP04的3′-U3区的嵌合病毒的cDNA克隆。嵌合病毒的感染性克隆与原型毒株HPRS-103的感染性克隆分别在脂质体介导下转染DF-1细胞,对收获的病毒分别用间接免疫荧光试验、禽白血病抗原和反转录酶试剂盒检测,结果表明成功拯救到2株病毒。对拯救的2株病毒,进行其3′-U3区启动子活性和增强子活性的检测,以及复制动力学比较分析结果显示,出现特异性规律性突变的U3区对于原毒株的体外复制能力无显著影响。所构建的3′-U3区的嵌合病毒的成功拯救对于进一步探索近年ALV-J流行毒株其3′-U3区出现的规律性突变的功能及意义奠定了基础。     

马传染性贫血病毒疫苗株S2基因不同变异位点逆向突变感染性克隆的体外复制特性分析

为研究EIAV弱毒疫苗株(EIAV_(FCCV15))S2基因发生的稳定性突变对疫苗株特性的作用以及S2基因的功能,以EIAVFDDVl5感染性克隆质粒pFDDV3-8为模板,根据疫苗研制过程中S2基因发生的4个主要稳定性变异位点,构建及拯救出S2基因不同差异位点逆向突变为强毒株相应氨基酸的6株感染性克隆衍生毒株.经实时定量PCR、逆转录酶活性和western blot等检测表明,疫苗株S2基因4个稳定性变异位点全部逆向突变的感染性克隆衍生毒、,pFDDVS2rl-3-4-5在体外培养靶细胞中的复制水平低于亲本疫苗株感染性克隆衍生病毒和其他组合的逆向突变的感染性克隆衍生病毒,提示ELAV疫苗株S2蛋白4个稳定突变位点的综合作用可能是决定疫苗株和强毒株特性差异的因素之一.以上结果为体内感染S2基因逆向突变感染性克隆衍生病毒,进一步揭示S2基因在ELAV弱毒疫苗致弱过程中的作用提供了依据.     

PCV2a-ORF3基因缺失株感染性克隆的构建

为构建猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)的感染性克隆及其ORF3缺失的感染性克隆,本研究通过比较分析Gen Bank中8种亚型的PCV2基因组序列(各3株),设计了PCV2基因全长克隆引物,以从江西省萍乡市某猪场疑似感染断奶仔猪多系统衰竭综合征病死猪的病料中提取的DNA为模板,利用PCR方法扩增PCV2全长基因序列并进行测序。利用分子生物学软件对测序结果分析,结果表明所获得的克隆为PCV2a-2A基因型。采用重叠延伸PCR(SOE-PCR)方法扩增病毒全长基因组DNA,克隆于p SP72载体中构建野生型PCV2a病毒株感染性克隆。此外,采用SOE-PCR方法,缺失野生型PCV2a感染性克隆中的阅读框3(ORF3),并将这两种重组质粒分别转染PK15细胞,盲传6代后经PCR和间接免疫荧光方法检测显示,构建的PCV2a病毒株与PCV2a-ORF3突变株克隆均具有感染性。本研究为进一步探究ORF3基因对PCV2致病机理和免疫原性的影响奠定了基础。     

猪圆环病毒2型田间分离株的全基因组克隆与基因亚型分析

为了解我国猪圆环病毒2型(PCV2)的流行态势和毒株的基因变异情况,从北京、江苏、湖北等地疑似断奶仔猪多系统综合征(PMWS)患病死亡猪中采集肺脏、脾脏和淋巴结等组织,将PCR鉴定为阳性的病料在PK-15细胞上进行增殖培养,成功分离到6株猪圆环病毒2型毒株,分别命名为B07、B12、HB、LHW、LPC和NJ。对其全基因组进行克隆和序列分析的结果显示,LPC基因组全长为1766 bp,其余均为1767 bp;6个毒株序列之间同源性高达96.0%~99.9%,6个毒株与参考毒株序列的同源性为94.4%~99.8%。PCV2全基因组的进化分析结果表明,B12、HB、LHW、LPC和NJ为PCV2b亚型,B07为PCV2d亚型,从而证实PCV2b亚型毒株成为我国猪群中分离率较高的流行毒株,并且我国猪群存在PCV2d亚型毒株。     

5株猪圆环病毒2型全基因克隆和序列分析

为了解广东地区猪圆环病毒2型(PCV2)流行势态及毒株的基因变异情况,从广东珠三角地区疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)患病死亡猪中采集淋巴结,将PCR鉴定为阳性的病料在PK-15细胞上进行增殖培养,成功分离到5株猪圆环病毒2型毒株,分别标记为GD-jm、GD-sz、GD-pz、GD-gj和GD-ss。再从细胞培养物中提取病毒基因组DNA,对5株PCV2分离株全基因组进行PCR扩增并克隆到pMD18-T Simple Vector进行测序,测序结果提交GenBank,登录号分别为JX912914、JX912915、JX945575、JX945576和JX945577。借助相关生物学软件作同源性分析,这5株PCV2基因组长度均为1767 bp,其中3株为PCV2b亚型,2株为PCV2d亚型。     

猪圆环病毒2型广东分离株的遗传演化分析

为了解广东地区猪圆环病毒2型(PCV2)毒株的遗传变异情况,从广东不同地区的规模化猪场采集疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)病猪的淋巴结、肺脏和脾脏。对PCR鉴定为阳性的病料在PK-15细胞上增殖培养6代,采用PCR和相关分子生物学软件对12个分离株进行全基因组克隆和测序分析。结果显示,分离株基因组全长为1 767 nt或1 768 nt,核苷酸序列同源性为94.6%~99.9%。遗传演化分析表明,12个分离株分布于3个大群,其中5株属于PCV2b,4株属于PCV2d,3株属于PCV2e,提示广东地区PCV2流行毒株已发生变化。     

猪圆环病毒2型感染性克隆构建

基于PCV2滚环复制原理,在分析PCV2不同基因亚型代表毒株基因组结构和序列的基础上,设计2对引物用于PCR扩增PCV2基因组序列。以从收集到的疑似PCV2感染的10份猪血清样品中提取的DNA为模板,用设计的引物扩增目的片段,并进行测序分析,1株为PCV2a型,4株为PCV2b型,5株为PCV2d型。每种基因型毒株中各选取一个样本,利用上述2对引物进行PCR扩增,并将扩增产物克隆至pEASY-Blunt simple载体中,通过双酶切连接2个PCR片段,构建含有约1500 bp重叠序列的PCV2基因组的质粒。通过脂质体转染法将含PCV2全基因组的质粒转染至PK-15细胞进行病毒拯救,经PCR和IFA两种方法验证,证明成功拯救出3个基因型的PCV2毒株。通过对PCV2全基因组结构及序列分析,该方法同样适用于PCV2g、PCV2h基因型病毒的感染性克隆构建。本研究建立了一种基于反向遗传学技术的PCV2感染性克隆的构建方法,为开展PCV2的病原学研究提供了技术支持。     

羊口疮病毒威海株的分离鉴定

利用犊牛睾丸原代细胞对山东省威海市某奶山羊养殖场疑似羊口疮（Orf）山羊病料进行病毒分离,通过细胞病变观察、病毒滴度和聚合酶链反应（PCR）等方法对分离毒株进行鉴定。结果表明,研磨处理的病毒液接种于犊牛睾丸原代细胞后盲传至第5代出现病变,测得第6代分离株病毒滴度为106．5 TCID50／mL。扩增羊口疮病毒特异性 B2L 基因,发现该毒株与34个羊口疮毒株核苷酸序列同源性高达99％,包括福建株（KC588399．1、KC568398．1）。本研究成功分离鉴定了羊口疮病毒山东威海株。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp9基因第642位氨基酸突变对病毒复制的影响

为了探索Nsp9基因上与病毒复制相关的关键氨基酸位点,通过融合PCR方法突变第642位氨基酸,之后进行病毒的拯救,并对病毒的滴度进行测定。结果表明,突变第642位氨基酸之后可以成功拯救病毒,突变毒株的滴度与亲本毒株的滴度未有明显差异,但突变毒株的转录水平有所下降。初步得出结论:猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp9基因第642位氨基酸与病毒滴度无关,与病毒转录相关。