马尔堡病毒糖蛋白RBD基因的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

原核表达并纯化马尔堡病毒(Marburg virus,MARV)糖蛋白(glycoprotein,GP)受体结合域(receptor binding domain,RBD)蛋白,并以此为抗原免疫家兔制备抗MARV-GP-RBD多克隆抗体。参照GenBank提供的MARV GP全基因序列,找到主要抗原表位区域,设计特异性引物,采用PCR方法扩增RBD基因,扩增产物经双酶切(EcoRⅠ/XhoⅠ)后定向克隆至原核表达载体pET-30a(+),构建重组表达质粒pET-30a(+)-GP-RBD,转化BL21(DE3)感受态表达宿主菌,在不同条件下(时间、IPTG浓度、温度)诱导表达目的蛋白,并用His-Band N+柱进行亲和层析纯化;以纯化的重组pET-30a(+)-GP-RBD蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体。通过SDS-PAGE、Western blot和IFA鉴定重组蛋白的反应原性及免疫原性。结果显示:PCR扩增到长度为453bp的RBD基因片段;构建的重组质粒pET-30a(+)-GP-RBD经双酶切后得到与目的片段长度相同的特异性条带,测序结果显示没有突变;转化产物在培养7h、终浓度为0.4mmol/L IPTG和37℃条件下能够充分诱导目的蛋白表达,得到相对分子质量为25 000的重组蛋白,主要以包涵体形式存在,BCA试剂盒产量测定,每升诱导的重组菌可纯化约20mg纯度较高的目的蛋白;Western blot检测证实重组pET-30a(+)-GP-RBD蛋白能同时被抗His标签的单抗和兔源多抗识别并发生特异性反应,证明重组蛋白有良好的反应原性;IFA鉴定证实所制备的兔源多抗能够特异性识别表达MARV GP蛋白的重组杆状病毒rBacmid-GP-VP40,证明重组蛋白具有良好的免疫原性。结果表明:成功表达、纯化了MARV GP RBD蛋白,并完成了兔源多抗的制备,为MARV亚单位疫苗的制备和抗原、抗体检测方法的建立奠定基础。     

牦牛EPF的原核表达及多克隆抗体制备

本试验旨在制备牦牛早孕因子(early pregnancy factor,EPF)多克隆抗体,为牦牛妊娠早期高效快速诊断技术研究奠定基础.采用RT-PCR方法,从牦牛胎盘和卵巢组织中提取RNA,反转录为模板后进行EPF基因扩增,并将其克隆到改造后的载体pET28-His10-Sumo上,构建pET28-His10-Su...     

山羊痘病毒糖蛋白基因ORF112的原核表达及多克隆抗体的制备

为探索山羊痘病毒(GTPV)糖蛋白基因ORF112在疫苗和诊断中的应用,应用PCR技术扩增GTPV弱毒疫苗株AV 41ORF112基因,将其克隆到pET-32a载体,转化感受态细胞BL21,经IPTG诱导后获得与预期大小相符的约37ku的融合蛋白,为可溶性和包涵体表达。应用镍离子亲和树脂对可溶性表达的目的蛋白进行纯化,然后用纯化的融合蛋白免疫Balb/c小鼠,制备多克隆抗体。免疫荧光试验表明该多克隆抗体可以与GTPV反应,为GTPV新型疫苗和诊断试剂的研究奠定了基础。     

牛病毒性腹泻病毒E0蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】应用大肠杆菌表达系统表达牛病毒性腹泻病毒(BVDV) E0蛋白,纯化后免疫小鼠制备E0蛋白多克隆抗体用于BVDV的检测技术研究。【方法】采用PCR扩增BVDV的E0基因,将其连接至pET-28a (+)构建重组表达载体pET28a-E0。将重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导、亲和层析纯化后,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定E0蛋白的表达情况。将纯化的E0蛋白免疫小鼠制备BVDV E0多克隆抗体,并通过Western blotting、细胞免疫荧光试验、ELISA等试验检测该多克隆抗体的特异性和效价,以及在BVDV检测中的应用。【结果】成功构建原核表达载体pET28a-E0,表达并纯化E0蛋白,制备的BVDV E0多克隆抗体可特异性识别纯化的E0蛋白及pET28a-E0在BL21中表达的总蛋白。进一步Western blotting、细胞免疫荧光试验、双抗夹心法ELISA证明制备的E0多克隆抗体可用于BVDV的检测。间接ELISA结果表明,E0多克隆抗体效价高于1∶64 000。【结论】制备的BVDV E0多克隆抗体效价高、抗原结合特异性强,为BVDV E0蛋白的生物学功能研究及BVDV的检测提供了材料支持。     

牛乳头瘤病毒2型L1基因的原核表达及多克隆抗体的制备

试验旨在表达牛乳头瘤病毒（BPV）的L1衣壳蛋白,并制备其多克隆抗体。对疑似牛乳头状瘤的病料进行病理组织学检查,采用L1基因简并引物FAP59/FAP64进行扩增,然后设计特异性引物,将衣壳蛋白L1基因亚克隆至pET-30a （+）表达载体中,构建重组原核表达载体pET30a-BPV2-L1,在E.coli Rosetta^TM（DE3） pLysS宿主菌中表达重组蛋白rBPV2-L1,并以纯化的rBPV2-L1蛋白为免疫原制备兔抗BPV2-L1蛋白多克隆抗体,随后间接ELISA检测其效价,并进行间接免疫荧光试验分析。病理组织切片观察结果显示,病变部分表皮细胞增生、角质过度并出现细胞挖空等BPV感染的组织病变情况;序列分析确定BPV分离株的基因型为2型,L1基因编码区长1 494 bp,可编码一个含有497个氨基酸的衣壳蛋白,蛋白分子质量为55.5 ku;与各型BPV的L1氨基酸序列系统进化树分析结果显示,其与BPV2-SW01（GenBank登录号：KC878306.1）、BPV2（GenBank登录号：KX113620.1）处于同一遗传进化分支,且属于Delta属成员;诱导表达的rBPV2-L1蛋白主要以包涵体形式存在于沉淀中;间接ELISA法检测多克隆抗体效价高达1：163 840,间接免疫荧光分析表明,兔抗BPV2-L1多克隆抗体能与瞬时表达的BPV2-L1蛋白发生特异性反应。以上结果证实,本研究成功克隆、表达了BPV2 L1基因,且重组蛋白rBPV2-L1具有较好的免疫原性,所制备的BPV2-L1蛋白多克隆抗体具有良好的免疫活性,为进一步研究BPV2亚单位疫苗奠定基础。     

禽流感病毒NS2蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

为制备禽流感病毒(AIV)NS2蛋白的多克隆抗体,本研究将人工合成的NS2基因克隆至表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达His-NS2重组蛋白。SDS-PAGE和western blot试验表明,该重组蛋白获得大量表达,可溶性高,并且具有较好的反应原性。将纯化后的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,并通过间接ELISA检测其效价达1∶20 000以上。Western blot和间接免疫荧光试验显示,多克隆抗体能够与NS2蛋白特异性结合。     

猪瘟病毒E0蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

为表达猪瘟病毒E0蛋白并制备其多克隆抗体,本研究构建E0蛋白的原核表达载体,转化至BL21(DE3)菌株,IPTG诱导表达,亲和层析及切胶回收纯化重组蛋白。SDS-PAGE和Western blot分析显示E0重组蛋白主要以包涵体形式表达,亲和层析纯化获得了E0重组蛋白,用其免疫Balb/c小鼠4次制备E0重组蛋白的多克隆抗体。间接ELISA显示,免疫小鼠血清中E0蛋白抗体效价为1∶50 000。获得的E0蛋白多抗能与病毒感染细胞及E0-EGFP融合表达细胞中天然结构的E0蛋白发生特异性反应。本研究制备的E0重组蛋白及其多克隆抗体为进一步研究E0蛋白的功能和免疫原性奠定了基础。     

双峰驼Cyp-A的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】制备双峰驼亲环素A(cyclophylin A,Cyp-A)的多克隆抗体,为揭示双峰驼体内的黏膜免疫反应机理提供依据。【方法】从GenBank数据库中双峰驼Cyp-A基因序列(登录号：XM＿010969543.1)上选取编码区,截取不含信号肽的膜外序列进行碱基优化后,与pET-28a(+)载体连接构建重组质粒pET-28a-Cyp-A。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导表达并对表达条件进行优化,优化诱导条件后通过SDS-PAGE鉴定重组蛋白的表达情况。纯化重组蛋白并免疫家兔,制备兔抗双峰驼Cyp-A多克隆抗体,分别使用ELISA和Western blotting检测抗体效价及特异性,并采用HE和SABC免疫组化染色法对Cyp-A多克隆抗体进行定位观察。【结果】重组质粒pET-28a-Cyp-A主要以包涵体形式表达,Cyp-A蛋白约为17 ku,最佳诱导条件为0.7 mmol/L IPTG诱导8 h,杂蛋白最佳洗脱液为5 mmol/L咪唑。经ELISA和Western blotting检测,兔抗双峰驼Cyp-A多克隆抗体的效价为1∶64 000,能...     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

为体外表达猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）糖基化囊膜蛋白GP5,以及制备其多克隆抗体,以PRRSV PC疫苗株RNA为模板,应用RT-PCR扩增GP5基因,并克隆至原核表达载体pET-32a（+）,构建重组表达载体pET-32a-GP5。经过酶切和测序鉴定后,将阳性重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,加入IPTG低温诱导表达。使用亲和层析法纯化PRRSV GP5蛋白。然后将纯化的蛋白免疫北京大耳白兔制备多克隆抗体,并进行酶联免疫吸附试验（ELISA）和间接免疫荧光分析（IFA）。结果显示,表达的PRRSV GP5原核蛋白以可溶性和包涵体两种形式存在,相对分子质量大约30 kDa;制备的GP5蛋白多克隆抗体ELISA效价可达1:64 000;IFA检测显示,制备的多克隆抗体能够识别PRRSV。重组PRRSV GP5蛋白及其多克隆抗体的成功制备为PRRSV血清学检测方法的建立提供了良好的生物学材料。     

非洲猪瘟病毒360-12L蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

【目的】获得抗原性好的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)12L蛋白用于ASFV血清学诊断技术研究。【方法】根据GenBank ASFV参考序列(登录号:NC₀44959.2)合成360-12L基因,并插入pET-28a(+)载体,构建原核表达质粒pET-28a-12L,将经测序鉴定正确的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导培养,筛选最佳诱导温度,同时分析其可溶性。随后通过亲和层析纯化蛋白,并对所获得的12L重组蛋白进行SDS-PAGE分析。将获得的12L重组蛋白作为免疫原免疫BALB/c雌性小鼠,以获得鼠抗ASFV 12L蛋白的多克隆抗体,通过间接ELISA方法测定所制备的多克隆抗体效价,并用间接免疫荧光试验进行验证。【结果】成功构建了ASFV 12L蛋白原核表达质粒,重组菌pET-28a-12L-BL21在37℃6 h时表达量较高,主要以包涵体形式表达,可在54.7 ku处出现明显条带。间接ELISA结果显示,制备的鼠抗ASFV 12L蛋白多克隆抗体效价>1∶512 000,间接免疫荧光试验结果表明,所制备的...     

猪FcRn胞浆尾区的克隆表达及多克隆抗体制备

采用RT-PCR方法从猪肝脏总RNA中克隆猪FcRn基因,然后利用PCR技术亚克隆猪FcRn胞浆尾区（FcRn-CT）,构建重组原核表达质粒KG-CT和pET32a-CT,分别在大肠杆菌BL21中获得了高效表达,并利用Glutathione Sepharose 4B和HisTrap FF crude亲和层析柱纯化目的蛋白。用纯化蛋白KG-CT免疫新西兰白兔,制备了多克隆抗体。利用纯化蛋白pET32a-CT建立了间接ELISA法,检测多抗效价达1∶32 000。Western blot检测结果表明该多抗特异性良好,为进一步研究FcRn在猪体内的表达分布及功能研究奠定了基础。     

Sf9细胞PHB2蛋白的原核表达及其抗血清的制备

为了研究Sf9细胞PHB2蛋白(Sf-PHB2)的功能及其对虾白斑综合症病毒(WSSV)极早期基因ie1的转录调控作用,本研究从昆虫细胞Sf9中扩增sf-phb2基因编码区,克隆至表达载体pET30a中,转化到大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达6His-Sf-PHB2重组蛋白.SDS-PAGE分析表明,表达的重组蛋白以...     

猪NLRP3蛋白的原核表达与多克隆抗体制备

为了获得猪源NLRP3重组蛋白以及针对猪NLRP3蛋白的多克隆抗体,本试验采用原核表达技术对猪源NLRP3蛋白的主要抗原区域进行了截短表达与鉴定,并以重组蛋白为免疫原免疫兔制备兔抗NLRP3蛋白多克隆抗体。结果显示,经RT-PCR方法扩增到大小为864 bp的NLRP3蛋白的主要抗原区域基因;将目的片段定向克隆至pET-32α原核表达载体,转化大肠埃希菌BL21,经IPTG诱导获得了大小为50 000的重组蛋白;重组蛋白经纯化后Western blot检测其可与抗His标签单克隆抗体发生特异性反应;以纯化蛋白为免疫原制备的兔抗NLRP3蛋白多克隆抗体的抗体效价达1∶25 600,Western blot检测其可与NLRP3重组蛋白发生特异性反应。结果表明,获得了具有良好反应活性的NLRP3重组蛋白与多克隆抗体,为研究NLRP3蛋白的结构与功能、NLRP3蛋白与猪炎症性疾病的相互作用机制奠定了基础。     

猪YTHDF2蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

YTH家族蛋白2(YTH domain-containing family protein,YTHDF2)作为一种m~6A修饰的结合蛋白,可对底物mRNA的剪接,翻译,降解等过程进行调控。本研究通过RT-PCR首次获得了猪YTHDF2编码基因序列,全长1 743 bp,编码580个氨基酸,基因进化树分析显示该基因在各物种间保守性较高。将猪YTHDF2编码基因克隆至原核表达载体pET-28a (+)中,重组质粒pET-28a (+)-YTHDF2在大肠杆菌BL-21菌株中进行原核表达,成功获得了大量带His标签的猪YTHDH2重组蛋白,大小约70 kD。以纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰大白兔制备猪YTHDF2多抗血清,ELISA结果表明制备的兔抗猪YTHDF2多抗血清效价为1:204 800,间接免疫荧光(IFA)和Western blot试验均表明该多克隆抗体具有良好的反应性和特异性。猪YTHDF2基因序列的获得及多克隆抗体的制备为进一步研究YTHDF2在猪mRNA m~6A甲基化过程中的生物学功能奠定了基础。     

小反刍兽疫病毒M蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

为制备鼠抗小反刍兽疫M蛋白多克隆抗体,提取小反刍兽疫病毒(PPRV,Nigeria 75/1疫苗株)总RNA,用RTPCR方法扩增M基因并克隆到pMD18-T载体中,以鉴定正确的质粒进行酶切,回收目的片段后克隆于原核表达载体PGEX-4T-1,获得重组质粒PGEX-4T-1-M,转化大肠杆菌Transetta(DE3)并进行诱导表达,优化诱导蛋白表达条件,放大培养收获目的蛋白,并进行纯化,用纯化后的目的蛋白制备免疫原免疫昆明鼠制备多克隆抗体,利用间接免疫荧光方法检测抗体的结合能力。结果成功扩增出大小约为1 005bp(去掉终止密码子)的PPRV M基因;并构建了真核表达载体PGEX-4T-1-M,经IPTG诱导后目的蛋白以包涵体的形式表达,蛋白表达的最优条件为37℃,0.4mmol/L IPTG诱导4h;用经Ni-NTA纯化后的重组蛋白3次免疫昆明鼠后成功获得了PPRV M蛋白鼠源多克隆抗体,间接免疫荧光试验显示该多克隆抗体能够特异性识别非变性全长M蛋白。     

迟缓爱德华菌菌毛蛋白原核表达及多抗血清制备

为研究迟缓爱德华菌菌毛蛋白PILI的功能和免疫原性,本研究利用PCR方法从迟缓爱德华菌基因组中克隆出pili基因,并将其构建到pET-32a原核表达载体上,重组载体转化BL21大肠杆菌诱导重组蛋白表达,通过SDSPAGE和Western blot方法验证重组蛋白表达。用亲和层析方法纯化蛋白,纯化的蛋白免疫小鼠,所得的多抗血清能够特异性识别迟缓爱德华菌PILI蛋白,为研究PILI蛋白奠定基础。     

犬布氏杆菌Cu/Zn-SOD基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为检测犬布氏杆菌(Brucella canis)重组Cu/Zn-SOD蛋白的抗原性,本研究通过PCR方法扩增B.canis的Cu/Zn-SOD基因,将其克隆于表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-SOD.将该质粒转化受体菌E.coli BL21 (DE3),经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳分析,...