Ⅰ群禽腺病毒4型Penton基因的克隆及原核表达

通过对Ⅰ群禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAdV)血清4型毒株Penton基因的克隆及原核表达,获得可溶性表达的Penton蛋白。依据GenBank已公布的Ⅰ群禽腺病毒4型Penton全基因设计引物,对实验室保存有Ⅰ群禽腺病毒血清4型毒株进行PCR扩增及测序分析,并将Penton基因克隆至pCold-SUMO载体,然后进行诱导表达。测序结果及序列分析表明,Ⅰ群禽腺病毒血清4型毒株为近几年国内流行毒株的新型突变株,命名为SX17株(GenBank登录号为MF592716);SDS-PAGE电泳及Western blot结果表明,获得可溶性表达的Penton蛋白,且Penton蛋白表达、过柱的效果较好,分离后蛋白纯度可达到80%~90%。原核表达获得了可溶性表达的Penton蛋白,且纯化出的蛋白具有较高的纯度,为后续研究Ⅰ群禽腺病毒4型Penton蛋白的生物活性以及制备其蛋白抗体奠定了基础。     

山东省部分地区鸭Ⅰ群禽腺病毒的检测与分析

为了解Ⅰ群禽腺病毒在山东省种鸭场中的流行及变异情况,从而为今后调整综合防治措施提供依据,对定期从山东省部分大型种鸭场采集的鸭胚、雏鸭及种鸭样品,进行病毒分离和PCR鉴定。本研究共采集鸭胚461枚,检出阳性137枚,阳性率为37.5%,最早可从8日龄鸭胚中检测到阳性;采集1日龄雏鸭样品120份,检出阳性41份,阳性率为34.2%;从德州市某种鸭场采集120份健康鸭泄殖腔棉拭子,检出阳性34份,阳性率为28.3%。对分离到的4株Ⅰ群禽腺病毒进行基因序列分析发现:1株为血清1型,3株为血清4型;分离株与近年来我国大陆地区的其他分离株具有极高的同源性,但在Hexon基因区域有19个核苷酸位点出现突变。检测结果表明:Ⅰ群禽腺病毒在山东省部分地区鸭群中有较高的流行率,其中以血清4型为主;虽然分离株与其他毒株同源性较高,但存在变异风险;我国种鸭场存在Ⅰ群禽腺病毒隐形感染情况,有垂直传播风险,应引起高度重视。     

Ⅰ群禽腺病毒hexon基因分型与序列分析

对鸡群中感染的Ⅰ群禽腺病毒hexon基因进行分型与序列分析,以期明确Ⅰ群禽腺病毒基因型的分布和hexon基因变异情况。参考GenBank上FAdV基因序列,设计2对引物,采用套式PCR技术扩增临床病料中Ⅰ群禽腺病毒hexon基因,测序后获得了8株FAdV hexon基因片段。结果表明,构建系统进化树发现,其中HM、SXFS、LQQD、HXGB、GSPL、DYQY和FP共7株属于FAdV-4型,而GS株属于FAdV-1型。7株FAdV-4型毒株核苷酸同源性在99.9%～100%之间,推导的氨基酸序列同源性均为100%,提示这7株FAdV-4型流行毒株高度同源。FAdV-1型的GS与CELO株核苷酸、推导的氨基酸序列同源性均为99.2%,提示GS与CELO株亲缘关系较近。在鸡群中发现存在FAdV-1型和FAdV-4型Ⅰ群禽腺病毒,各血清型毒株之间高度同源,毒株遗传稳定性高。     

2022年湖北Ⅰ群禽腺病毒流行病学调查及分离鉴定

禽腺病毒是全球家禽常见的传染病病原之一，目前对禽腺病毒进行流行病学调查，已给全球家禽业造成了巨大的经济损失。为了调查禽腺病毒在湖北地区的流行情况，在2021～2022年从湖北市场收集了224份鸡肝样本，为FAdV疫苗研制提供参考。基因测序结果显示：其中14株携带FAdV,Hexon L1环基因序列系统发育，12株为C型，2株为D型。在鸡肝癌细胞株（LMH）中培养并分离得到FAdV-11 HB200株，对分离物的Hexon基因进行了扩增和测序。遗传进化分析表明：FAdV-11 HB200与多个FAdV-11毒株处于同一分支。FAdV-C的流行率仍然占主导地位，相关部门应采取预防FAdV感染的措施。     

禽腺病毒AH株的分离与鉴定

为获得禽腺病毒毒株,将临床疑似Ⅰ群禽腺病毒感染病例的肝组织,通过接种SPF鸡胚进行病毒分离,用PCR方法对分离产物进行扩增,将PCR产物进行序列测定,对测定的序列在NCBI网上进行分析,结果显示,从病料可分离出病毒,用PCR方法特异性地扩增出了与设计片段大小相一致的片段,序列分析表明,分离株序列与禽腺病毒SD1-15分离株序列同源性99%,说明分离株为Ⅰ群禽腺病毒血清4型。     

Ⅰ群禽腺病毒山东株的分离鉴定及hexon基因的克隆与分析

从山东省自然发生疑似鸡包涵体肝炎的商品肉鸡群中分离到4株病毒。这些毒株的复制可被5-溴尿嘧啶2-脱氧核苷抑制,表明毒株的核酸类型为DNA;对乙醚和氯仿有抵抗力;耐酸不耐碱;对热敏感。根据已发表的Ⅰ群禽腺病毒hexon基因的保守区域设计合成了2对引物。用这2对引物对4株病毒的核酸模板进行PCR扩增,结果均扩增出与设计片段大小一致的片段。测序分析表明,4株分离株为Ⅰ群禽腺病毒。用本实验室自制的Ⅰ群禽腺病毒12个血清型参考毒株的抗血清进行双向琼脂扩散试验,证明4株病毒中1株为血清2型,其余3株为血清8型。     

不同时期NDV地方株F基因的克隆及序列分析与基因型研究

利用RT-PCR技术对1998-2002年闯洛阳地区新城疫典型发病禽群中所分离到的15个毒株的F基因主要功能区片段进行了克隆和序列分析，并根据其47～435位核苷酸序列构建了系统进化树，确定了其毒力强弱和基因型。结果显示，依据核苷酸和推导的氨基酸同源性的不同，15个地方毒株可分为3群，群内各毒株同源性较高，群间差异较大，未发现有因分离禽品种不同所引起的明显的株间差异。其中第1群9株，涉及到各时间段分离的毒株和所有分离禽品种，属典型的基因Ⅶ型强毒株，高度集中于进化树的基因Ⅶ型C亚型区；第2群4株，属传统的基因Ⅵ型强毒株。分散于进化树的基因Ⅵ型区；第3群2株，属古典基因Ⅱ型的弱毒株，分散于进化树的基因Ⅱ型区。结果表明，近年来该地区流行的新城疫病毒以新的基因Ⅶ型为主，同时兼有传统的基因Ⅵ型和古老的基因Ⅱ型；并提示基因Ⅶ型各毒株在该地区流行的时间较短，株间差异不大。     

贵州省鸡心包积液-肝炎综合征实验室诊断与病原基因分型

为证实鸡心包积液-肝炎综合征(hydropericardium hepatitissyndrome,HHS)在贵州省的流行、病原遗传变异和基因分型情况,对贵州首个疑似HHS病例进行实验室检测,并基于Hexon基因进行病原基因分型。结果显示:病例组织材料中PCR扩增获得约295 bp特异性Hexon基因片段;基于Hexon基因分型显示,本病例病原与国内外报道的禽腺病毒Ⅰ群血清4型(FAd V-4)同源性高达100%,与禽腺病毒Ⅰ群代表株CELO株(U46933)同源性达到64.5%;系统进化分析显示,FAd V-4贵州流行株与禽腺病毒Ⅰ群代表株CELO株和FAd V-4国内外流行株均处于同一进化分支,而与禽腺病毒Ⅱ群和禽腺病毒Ⅲ群处于不同进化分支。结果表明:本病例确为贵州省首次报道HHS病例,病原基因分型为禽腺病毒Ⅰ群血清4型,研究结果为贵州省HHS防控提供参考。     

一例鸡安卡拉病的实验室诊断与毒株鉴定

2016年5月份江苏省徐州市一养鸡场突发疑似鸡安卡拉病,并蔓延到周边地区。为了确诊该地区养鸡场鸡所发生疾病,并研究病毒分离株的基因遗传进化情况,试验根据鸡安卡拉病所属禽腺病毒(FAV)的相关基因组设计引物,建立鸡安卡拉病的PCR诊断方法。用鸡胚接种的方法进行病毒分离,并将分离出的病毒在SPF鸡上攻毒成功复制出该病例,获得鸡安卡拉病徐州株(SN2016),将SN2016株与国内其他毒株的Hexon基因进行遗传进化分析。结果表明:徐州地区该养鸡场发生的疾病为鸡安卡拉病,从该养鸡场分离出的鸡安卡拉病徐州株SN2016属于Ⅰ群禽腺病毒C基因型,与我国主要流行的FAV-C毒株(KT899324、FAU26221、NC_015323、HQ709228、EU931692、HE608152、KU587519)核苷酸序列的同源性最高,为95.8%～100%,与血清4型参考株在同一进化分支上。说明试验建立的PCR检测方法特异性良好,徐州地区该养鸡场发生的疾病是安卡拉病,分离株SN2016株的血清型为Ⅰ群禽腺病毒C基因型。     

11株血清4型禽腺病毒的分离鉴定及遗传进化分析

为了阐明Ⅰ群禽腺病毒在我国部分地区鸡群的感染状况,对2015年10月~2016年10月采集自山东、河北等鸡场疑似禽腺病毒感染病鸡的肝脏样品,通过病毒分离、PCR、动物回归试验等进行分离鉴定,最终鉴定出11株血清4型禽腺病毒。根据Gen Bank上发表的Ⅰ群禽腺病毒(FAd VⅠ)Hexon基因序列设计引物,对分离的11个毒株测序,并与其他血清型参考毒株进行比较分析。结果表明:分离的11株FAd V同源性高达99.7%以上,与FAd V-4参考毒株的核苷酸序列的同源性在98.3%~99.7%之间,与FAd V-10血清型序列同源性较近,为97.2%,而与FAd V-5、FAd V-8血清型同源性较低,仅在66.4%~87.2%之间。研究结果为FAd V的防控和新疫苗研发提供了可靠的理论依据。     

I群禽腺病毒的分离鉴定与同源性分析

为了解鸡群中I群禽腺病毒(FAd V-I)的流行现状,从山东、黑龙江、吉林等地部分大规模养鸡场采集病料,进行病毒分离、PCR鉴定及同源性分析。结果显示:从76份病料中分离到10株FAd V-I,分离率为13%;10株FAd V-I中,1株为血清4型,6株为血清8b型,1株为血清9型,2株为血清11型。结果表明,山东、黑龙江、吉林等地均存在一定的FAd V-I流行,主要流行血清型已由4型转变为8b型,因此需要评估当前的4型灭活苗能否有效防控这些地区的FAd V-I流行。     

广西猪源I型副粘病毒F基因测序分析

对广西猪源I型副粘病毒F基因测序分析,为今后开展猪源副粘病毒的相关研究提供参考,也为有效防控副粘病毒感染奠定基础。参考GenBank发表的相关禽副粘病毒I型（Avian paramyxovirus serotypeI,APMVx）基因组序列,设计了1对特异性引物,用RT—PCR法分别扩增出病毒各F基因片段,并将目的基因片段回收纯化。测定得F基因的序列结果表明,从猪组织中分离获得1株猪源禽I型副粘病毒,分离株F基因112～117住裂解住点的氨基酸组成为R—R—Q－R—R-F,与强毒株DQ417113、AF458012的裂解位点一致。同源性分析结果表明,分离株与标准强毒株的核苷酸同源性分别为87．5％和87．4％。猪源禽I型副粘病毒分离株为强毒株,属于基因I型是传统型毒株,广西地区禽I型副粘病毒宿主范围呈不断扩大趋势。     

华东某活禽市场新城疫病毒和低致病性禽流感病毒的初步分离与鉴定

为了解春季活禽市场新城疫病毒(NDV)和低致病性禽流感病毒(LPAIV)的携带情况,2016年3~4月采集华东某活禽市场健康家禽的泄殖腔新鲜棉拭样品100份(鸡源样品40份,鸭源28份,鹅源32份)。以鸡胚接种方法分离病毒,接种后5 d收集鸡胚尿囊液用于血凝试验,共获得7株具有HA活性的病毒,均来源于水禽。采用双重RT-PCR对分离毒株进行鉴定,同时对NDV的F基因和AIV的M基因进行扩增,并对扩增的测序进行分析。结果显示:从样品中分离到NDV 4株,为ClassⅠ系列毒株;分离到AIV 3株,M基因遗传演化分析显示,其中2株病毒与国内流行的H6亚型AIV遗传关系较近,另外1株病毒与国内流行的H9亚型AIV毒株遗传关系较近。     

广东省猪流感病毒的分离鉴定及遗传进化分析

为了解广东地区猪流感病毒(SIV)的流行和变异情况,本研究于2013年10月至2014年1月从广东省4个不同地区采集猪鼻拭子和肺脏病料共203份,对样品处理之后进行鸡胚分离和RT-PCR检测,从中分离得到5株SIV,对其进行病毒纯化、全基因组测序和遗传进化分析。结果表明,5株SIV分离毒株其中3株为H1N1亚型,2株为H1N2。分离毒株HA裂解位点位于PSIQSR↓GL,具有典型的低致病性流感病毒特征。HA基因序列比对结果显示,5株SIV分离毒株与A/Jiangsu/ALS1/2011(H1N1)株同源性最高,核苷酸相似性为97%~99%。遗传进化分析结果显示,5株分离毒株的PB2、PB1、PA和NP基因片段属于PDM/09分支,M基因片段以及外部基因片段HA属于欧亚类禽分支,NS基因片段属于北美三元重组分支,3株H1N1亚型的NA基因属于欧亚类禽分支,2株H1N2亚型的NA基因属于人季节性流感分支。抗原位点分析结果表明,分离毒株的抗原位点基本保守,但YJ28分离株HA1蛋白上发现3个氨基酸突变,分别是L69S、S137P、E222G。本研究通过对广东省不同地区分离到的SIV进行鉴定分析,掌握SIV的变异趋势,为猪流感的防控提供切实有效的理论依据。     

应用PCR检测禽腺病毒

根据禽腺病毒 CELO株的基因序列 ,设计合成了 1对引物 :上游引物为 5′-CCCTCCCACCGC-TAACCA-3′,下游引物为 5′-CACGTTGCCCTTATCTTGC-3′。用这对引物对 群禽腺病毒中 1 2个血清型病毒和 1 9个分离野毒株、 群 4个血清型病毒、 群禽腺病毒株的核酸模板进行了 PCR扩增 ,结果均特异性地扩增出了与设计片段大小相一致的 4 2 1 bp片段 ,而对其他 5种禽病病原体和哺乳动物腺病毒血清 2型核酸模板的扩增均为阴性。该 PCR能检出 1 fg禽腺病毒 DNA模板     

2株Ⅰ群禽腺病毒的分离鉴定及致病性分析

为了解山东省禽腺病毒(fowl adenovirus,FAdV)毒株的基因遗传演化情况及致病性,本试验对山东省两家疑似暴发鸡包涵体肝炎和心包积液综合征鸡场采集的病料(肝脏、脾脏)进行PCR鉴定,并将鉴定为FAdV的2份阳性病料提取病毒液,接种鸡肝癌细胞(LMH)进行毒株传代培养和细胞病变(CPE)观察、PCR检测、TCID50测定、鸡胚致病性试验、SPF鸡回归试验、病毒hexon部分基因扩增及序列分析。结果显示,试验成功分离到2株FAdV,2株分离株细胞传第1代即可观察到CPE,PCR均可扩增出大小为500bp的片段,且2株分离株细胞F5代TCID50分别为10-7.75/0.1mL和10-7.60/0.1mL,均对7日龄SPF鸡胚有强致病性;第1分离株和第2分离株对21日龄SPF鸡攻毒死亡率分别为80%和15%。hexon基因核苷酸同源性分析结果显示,第1分离株与FAdV-4株同源性最高(99.57%),第2分离株与FAdV-8b株同源性最高(99.18%)。这2株FAdV分离株均与Ⅰ群禽腺病毒同源,与火鸡出血性肠炎病毒(HEV)所在的血清Ⅱ群及减蛋综合征病毒(EDSV)所在的血清Ⅲ群禽腺病毒位于不同分支。第1分离株基因型为C型,血清型为4型,命名为FAdV-SDC4株;第2分离株基因型为E型,血清型为8b型,命名为FAdV-SDE8b株。综上所述,FAdV-SDC4和FAdV-SDE8b株属于近几年国内流行毒株。本研究结果可为鸡包涵体肝炎、心包积液综合征的防控工作和疫苗株的选择提供科学依据。     

禽腺病毒4型云南株分离鉴定及Hexon基因序列分析

【目的】分析云南省家禽及野鸟禽腺病毒4型(Fowl adenovirus-4,FAdV-4)流行情况、Hexon基因差异性及致病性,为研究FAdV-4流行及Hexon基因对病毒毒力的影响提供参考。【方法】2020年1月―2021年6月在云南省昆明市、曲靖市、楚雄州、大理州、红河州、玉溪市等家禽养殖密集区采集疑似感染FAdV-4家禽肝脏组织样品158份,候鸟迁徙地采集野鸟新鲜粪便310份,采用PCR技术检测FAdV-4核酸,对获得的代表性阳性样品进行病原分离鉴定,并对分离毒株进行致病性及Hexon基因序列分析。【结果】家禽肝脏组织样品中检出FAdV-4核酸阳性样品19份,阳性率为12.03%(19/158);黑颈鹤粪便样品中检出核酸阳性样品1份,阳性率为0.3%(1/310)。从FAdV-4核酸阳性样品中分离到7株FAdV-4,致病性研究结果显示,FAdV-4云南分离株均能致鸡胚发育不良,引起4周龄肉鸡发生心包积液-肝炎综合征,鸡胚半数致死量(ELD₅₀)为10^―6.17~10^―4.32/mL。7株分离株均聚类于FAdV-C亚群,Hexon蛋白与国内FAdV-4高致病性毒株具有相同的¹⁸⁸R、¹⁹³R、¹⁹⁵Q特征。分离株感染SPF鸡后,临床症状明显,具有高致病性且高致死率,肝细胞病变明显。【结论】研究初步掌握了云南FAdV-4的流行情况,首次在黑颈鹤粪便中检测到FAdV-4病原核酸,分离获得7株FAdV-4,部分毒株Hexon蛋白存在氨基酸突变。     

禽腺病毒血清4型QHD2021株的分离鉴定和全基因序列分析

为了解河北秦皇岛地区禽腺病毒血清4型(FAdV-4)分离株的遗传变异情况和致病性,本试验对疑似患FAdV-4病死鸡的肝脏、心脏等组织进行PCR检测,将PCR检测为阳性的组织接种鸡肝癌细胞(LMH)进行病毒分离培养,对纯化后的FAdV-4进行全基因测序,对所得的序列进行同源性和遗传进化分析及致病性试验。结果表明：将PCR检测为FAdV-4阳性的肝脏、心脏匀浆于接种LMH细胞后72 h内出现明显细胞病变,初步确定分离毒株为FADV-4毒株,命名为FAdV-4 QHD2021株。全基因测序结果显示,QHD2021株全基因组全长44 225 bp,共编码14 741个氨基酸。与国外毒株相比短1 500 bp左右,但比国内毒株长约500 bp。同源性和遗传进化分析显示,QHD2021株与国内外FAdV-4流行毒株在同一支,与国内SD1601株的同源性最高,为94.3%。序列比对发现QHD2021株与国内流行株、国外经典株相比均出现1段1 966 bp的碱基缺失,包括ORF19、ORF27和ORF48的缺失。将经LMH细胞纯化的QHD2021株接种21日龄的SPF雏鸡后,可引起心包积液、肝炎等典型...     

1株鸭3型腺病毒的分离鉴定及fiber基因序列分析

本研究通过病毒分离、PCR和基因测序等方法,从广东某鸭场疑似“白肝病”发病鸭的肝组织样品中分离了1株鸭3型腺病毒,命名为GD2019株。序列分析结果显示,分离株fiber基因包含fiber-1和fiber-2两个片段,长度分别为1380、1443 bp。鸭3型腺病毒fiber基因非常保守,GD2019株fiber-1和fiber-2基因与已报道的鸭3型腺病毒同源性均为100%,而与其他禽腺病毒同源性则较低,亲缘关系较远。     

Ⅰ群禽腺病毒血清4型QD株的分离与鉴定

为了对Ⅰ群禽腺病毒血清4型(FAdV-4)的毒株进行分离,试验采用病毒分离、DNA提取、PCR鉴定、Hexon基因序列分析、病毒毒价测定、病毒形态学观察及动物回归试验等方法对青岛地区疑似心包积水及包涵体肝炎病鸡的肝脏进行了研究。结果表明:该分离毒株提取的DNA经PCR鉴定为阳性;该分离毒株序列与已发表的Ⅰ群禽腺病毒4型序列同源性为97.7%,病毒毒价为1×10~8TCID_(50)/0.1 mL;病毒形态为球形、无囊膜、二十面体对称的粒子结构;在动物回归试验中,病死肉鸡心包有积液,发病鸡肝脏的中央静脉广泛淤血,肝细胞发生空泡样变性,细胞浆和细胞核内可见嗜碱性包涵体。说明该分离株为Ⅰ群禽腺病毒血清4型毒株。