粘虫过氧化物酶MsPOD基因的克隆及不同温度胁迫的诱导效应

过氧化物酶（POD）是昆虫体内一种很关键的抗氧化酶,在维持昆虫体内氧化还原的动态平衡及保护昆虫免受氧化损伤方面起到重要的作用。本试验通过转录组测序方法获得一条粘虫过氧化物酶基因的cDNA序列,该序列命名为MsPOD（GenBank登录号：MH606240）。该序列全长2433 bp,开放阅读框长度为2061 bp,编码686个氨基酸组成的多肽,分子量约76.1 ku,等电点5.68,具有1个标志性的动物亚铁血红素过氧化物酶细胞粘附蛋白结构域。氨基酸序列比对表明,MsPOD的氨基酸序列与鳞翅目夜蛾科其他昆虫亲缘关系较近,其中与棉铃虫POD氨基酸序列同源性最高,达92%。基因表达水平研究发现,MsPOD基因在不同发育阶段和不同组织中差异表达,在蛹期和唾腺中表达量最高。温度梯度诱导后,MsPOD基因在不同时间点的表达量具有显著差异,经35℃下12 h处理后表达量最高。研究结果为进一步研究过氧化物酶在昆虫体内的保护性作用以及利用该基因进行分子设计来防治粘虫奠定理论基础。     

黏虫几丁质酶MsCHT7基因的克隆、表达及蜕皮激素的调控

几丁质酶是几丁质水解的关键酶,在昆虫生长发育中具有重要作用。本试验通过高通量转录组测序获得黏虫几丁质酶基因cDNA序列MsCHT7（GenBank登录号MG551526）。cDNA全长3360 bp,包含一个长度为2970 bp的开放阅读框,编码989个氨基酸,具有1个糖苷水解酶18家族高度保守序列,2个Glyco_18催化结构域和1个几丁质结合结构域ChtBD2。通过基因表达水平研究发现,黏虫MsCHT7基因在不同发育阶段和不同组织中均有表达,且具有差异性。预蛹期和表皮MsCHT7基因表达量最大,蛹期最后1 d和成虫表达量较高,且幼虫各龄期最后1 d表达量均高于第1 d表达量。20E（20-羟基蜕皮酮）处理幼虫后,不同时间点MsCHT7基因表达量存在显著差异,在1～24 h基因表达量随时间逐渐升高,24 h时最高,之后表达量迅速降低。4种不同浓度20E处理后,MsCHT7基因表达量存在一定差异,当浓度为10 μg/μL时,MsCHT7基因表达量最大。通过生物学观察发现,不同浓度20E处理后5龄幼虫蜕皮时间均提前。由于MsCHT7基因表达量受蜕皮激素调控,MsCHT7可能在黏虫蜕皮过程中发挥一定作用。     

黏虫热休克蛋白Hsp90基因的克隆及不同温度对其诱导反应

热休克蛋白是昆虫体内一种很重要的抗逆蛋白,Hsp90是热休克蛋白家族中的重要成员。本试验利用高通量测序法获得Hsp90的c DNA的全长序列,通过Real-time PCR探讨黏虫各龄期、组织和黏虫3龄幼虫受到不同高、低温胁迫不同时间的Hsp90基因的相对表达量。在黏虫体内得到Hsp90的c DNA全长序列(Gen Bank登录号MF773751)2422 bp,命名为Ms Hsp90,编码717个氨基酸,分子量约为82.576 ku,等电点是4.98,序列包含有Hsp90的保守序列,与鳞翅目夜蛾科的甜菜夜蛾、苜蓿夜蛾、斜纹夜蛾亲缘关系较近,且氨基酸序列相似性都在98%以上。Real-time PCR结果显示黏虫的不同发育阶段和组织中均有Ms Hsp90表达,其中2龄幼虫和后肠的相对表达量最高。40℃处理6 h的相对表达量最高,处理12、24、48 h时,20℃的相对表达量最高。上述分析可知,Ms Hsp90相对表达量的高低表明在黏虫不同组织,不同发育阶段和不同时间、温度处理中发挥的作用存在差异。     

苜蓿实夜蛾几丁质脱乙酰基酶基因

几丁质脱乙酰基酶（CDA）在昆虫几丁质代谢中具有重要作用。本研究以苜蓿实夜蛾5龄幼虫虫体为材料提取总RNA,利用RT-PCR和RACE技术,扩增得到该虫CDA基因的cDNA序列。该序列含有1 984个碱基,包括1个1 626个碱基的开放阅读框,编码一个含541个氨基酸的蛋白,分子量约为61.86 ku。克隆基因推导的氨基酸序列具有几丁质脱乙酰基酶典型的3个功能区,分别是几丁质结合区（47～103）,催化区（199～355）,低密度脂蛋白受体区（124～158）。序列比对表明,克隆的苜蓿实夜蛾CDA与其他昆虫的CDA在核苷酸和氨基酸水平上的一致性存在较大差异。苜蓿实夜蛾CDA的氨基酸序列与棉铃虫CDA（GQ411189）一致性达到98%,而与另外3种昆虫粉纹夜蛾CDA（AY966402）、蓓带夜蛾CDA（EU660852）和棉铃虫CDA（GQ411190＼GQ411191＼EF600051）氨基酸序列间的一致性只有36%~38%,属于两类CDA类群中的一类。基因的cDNA序列已经登录GenBank并获得登录号GU188855。     

韭菜迟眼蕈蚊紫外敏感视蛋白基因的克隆及光强度对其表达量影响

为明确韭菜迟眼蕈蚊Bradysia odoriphaga紫外敏感视蛋白基因Bo-uv的作用及其与趋光性的关系,利用常规PCR方法克隆获得Bo-uv基因的全长cDNA序列,分析了其敏感视蛋白的氨基酸序列与其它12种昆虫同源蛋白氨基酸序列之间的系统进化关系,运用qPCR技术检测了不同发育阶段、不同组织及不同光强度下Bo-uv基因的相对表达量。结果表明,Bo-uv基因cDNA全长2 757 bp,开放阅读框1 542 bp,编码514个氨基酸。韭菜迟眼蕈蚊紫外敏感视蛋白的氨基酸序列与其它12种昆虫同源蛋白的氨基酸序列一致性为21.93%～43.00%,与橘小实蝇Bactrocera dorsalis的氨基酸序列同源性最高。Bo-uv基因在韭菜迟眼蕈蚊蛹末期、成虫期表达,在成虫头部的相对表达量较高。在0～10 000 lx光强范围内雌、雄成虫体内该基因的相对表达量均呈先增高后降低趋势。与对照相比,1 000 lx光强度下其相对表达量显著升高,10 000 lx时相对表达量显著降低。表明光强度能够有效地调控Bo-uv基因的表达,该基因在韭菜迟眼蕈蚊感知外界光刺激过程中具有重要作用。     

褐飞虱两个酚氧化酶原基因的特性及细菌诱导后的表达分析

为探讨褐飞虱Nilaparvata lugens（Stål）酚氧化酶原基因的发育表达模式及生物学功能,利用转录组数据和RACE方法获得两条褐飞虱酚氧化酶原基因NlPPO1（GenBank No.：ALE32751）和NlPPO2（GenBank No.：ALE32752）全长序列,褐飞虱NlPPO1全长为2316 bp,CDS编码区为2073 bp,编码690氨基酸;NlPPO2全长为2738 bp,CDS编码区为2100 bp,编码699氨基酸。通过实时荧光定量PCR方法检测NlPPO的发育表达模式及注射细菌诱导后NlPPO的表达量变化。发育表达模式结果显示,NlPPO1和NlPPO2在肠中都有较高的表达水平,而NlPPO1在表皮细胞表达量最低,NlPPO2在脂肪体表达量最低;在5龄幼虫阶段NlPPO1随时间增加表达量增加,NlPPO2表达量则维持相对较高水平;在成虫阶段NlPPO1表达量维持在较低水平,NlPPO2随时间增加表达量降低。注射大肠杆菌诱导NlPPO结果表明,诱导24 h后,NlPPO1表达量显著升高,NlPPO2表达量变化差异不显著;注射枯草芽胞杆菌诱导NlPPO结果表明,诱导24 h后,NlPPO1和NlPPO2表达量都显著升高。研究结果显示褐飞虱NlPPO1和NlPPO2的发育表达模式存在差异,对不同菌诱导免疫应答也存在差异,暗示二者具有不同的生物学功能。该结果为进一步探索酚氧化酶原在褐飞虱对病原菌的免疫响应机制奠定基础。     

沙葱萤叶甲己糖激酶基因的克隆、相对表达量及RNA干扰效应

为揭示沙葱萤叶甲Galeruca daurica己糖激酶基因的功能,根据本课题组组装的沙葱萤叶甲转录组测序数据,应用cDNA末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends,RACE）克隆获得沙葱萤叶甲己糖激酶基因的cDNA全长序列,分析其编码蛋白的氨基酸序列与其它昆虫同源蛋白氨基酸序列之间的系统进化关系,采用实时荧光定量技术（real-time quantitative polymerasechain reaction,qPCR）测定不同发育阶段和不同温度下沙葱萤叶甲己糖激酶基因的相对表达量以及对RNA干扰的响应。结果表明,沙葱萤叶甲己糖激酶基因的cDNA全长为1 699 bp,开放阅读框长为1 479 bp,编码492个氨基酸;沙葱萤叶甲己糖激酶氨基酸序列与玉米根萤叶甲Diabrotica virgifera virgifera己糖激酶氨基酸序列一致性最高,为65.42%。己糖激酶基因在沙葱萤叶甲不同发育阶段均有表达,成虫滞育期间相对表达量维持在低水平,而滞育结束后相对表达量急剧上升达最高值。在0~40℃范围内,随着温度增加,己糖激酶基因在沙葱萤叶甲成虫体内相对表达量呈先升高后下降的趋势。采用RNA干扰技术沉默沙葱萤叶甲成虫己糖激酶基因2 d后,与对照相比,己糖激酶基因相对表达量下调90%以上,4 d后仍下调40%以上;该基因干扰后12 d内,沙葱萤叶甲成虫存活率下降了25%以上。表明己糖激酶基因可能在沙葱萤叶甲生长发育和滞育过程中起着重要作用。     

苜蓿实夜蛾几丁质脱乙酰基酶基因cDNA序列的克隆与序列分析

几丁质脱乙酰基酶(CDA)在昆虫几丁质代谢中具有重要作用.本研究以苜蓿实夜蛾5龄幼虫虫体为材料提取总RNA,利用RT-PCR和RACE技术,扩增得到该虫CDA基因的cDNA序列.该序列含有1 984个碱基,包括1个1 626个碱基的开放阅读框,编码一个含541个氨基酸的蛋白,分子量约为61.86 ku.克隆基因推导的氨基酸序列具有几丁质脱乙酰基酶典型的3个功能区,分别是几丁质结合区(47～103),催化区(199～355),低密度脂蛋白受体区(124～158).序列比对表明,克隆的苜蓿实夜蛾CDA与其他昆虫的CDA在核苷酸和氨基酸水平上的一致性存在较大差异.苜蓿实夜蛾CDA的氨基酸序列与棉铃虫CDA(GQ411189)一致性达到98%,而与另外3种昆虫粉纹夜蛾CDA(AY966402)、蓓带夜蛾CDA(EU660852)和棉铃虫CDA(GQ411190\GQ411191\EF600051)氨基酸序列间的一致性只有36%～38%,属于两类CDA类群中的一类.基因的cDNA序列已经登录GenBank并获得登录号GU1188855.     

棉铃虫CYP9G5基因的克隆、序列分析及溴氰菊酯胁迫表达

细胞色素P450是超基因家族,属于生物体内重要三大解毒酶系之一,参与内源物和外源物的合成与氧化代谢。本文通过棉铃虫溴氰菊酯短期胁迫转录组数据分析,克隆获得一条P450基因CYP9G5（GenBank：KM016757.1）,编码493个氨基酸,分子量约为57.930 kDa,理论等电点pI 7.16。通过实时荧光定量技术,分析CYP9G5基因在棉铃虫不同组织和溴氰菊酯处理后表达量的变化,发现CYP9G5在头部表达量最高,经过溴氰菊酯处理后CYP9G5表达量也显著升高。推测出CYP9G5极有可能参与棉铃虫对溴氰菊酯的代谢,可能对棉铃虫的耐药性有一定的作用。本研究为进一步探索棉铃虫的抗药性和新农药的开发奠定了基础。     

桃蛀螟细胞色素P450基因CYP4G113时空表达及功能研究

CYP家族基因是昆虫体内重要的解毒酶基因,本研究拟明确桃蛀螟体内解毒酶基因CYP4G113的基本序列特征、表达模式及其在桃蛀螟适应性进化中的功能.基于桃蛀螟转录组数据信息,克隆获得桃蛀螟CYP4G113的开放阅读框;利用实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技术,测定...     

西花蓟马FoccOBP3的分子克隆、序列分析及表达特征

鉴定昆虫嗅觉相关蛋白基因并对其序列和时空表达进行研究,可为阐明昆虫与寄主间的化学通讯机制提供依据.本文新克隆并鉴定获得一个西花蓟马OBP基因FoccOBP3(GenBank登录号:MT682352),cDNA序列全长1226bp,读码框全长432bp,编码143个氨基酸残基.氨基酸序列中六个保守的半胱氨酸位点排列方式为...     

黏虫保幼激素环氧水解酶基因MsJHEH2的克隆与生物学功能

保幼激素环氧水解酶（juvenile hormone epoxide hydrolase,JHEH）是调控保幼激素（juvenile hormone,JH）滴度的重要降解酶。本文在黏虫体内克隆得到一条具有EHN环氧水解酶超家族结构域的保幼激素环氧水解酶MsJHEH2基因cDNA序列（GenBank登录号：MT802192）,长度1533 bp,开放阅读框（ORF）为1389 bp,编码462个氨基酸,推测分子量和等电点分别为52.42 kDa和7.07。表达模式分析发现,MsJHEH2在黏虫各个龄期与组织中均有表达,其中在蛹期和中肠中表达量最高。RNA干扰处理4龄幼虫6 h后的基因沉默效率最高,为64.86%,此时黏虫体内JH滴度上升为对照的1.58倍。该基因沉默后对黏虫无明显致死作用,但导致其蛹历期延长、羽化率降低。本研究表明MsJHEH2可以通过调节JH含量进而影响黏虫生长发育进程。     

大豆蚜Aghsp75基因对吡虫啉及温度胁迫的应激表达

热激蛋白在昆虫抵御温度胁迫和药剂胁迫反应中具有重要作用。本试验通过高通量测序获得一条大豆蚜热激蛋白基因的cDNA序列，该序列全长2982 bp，含1个长度为2052 bp的开放阅读框，编码683个氨基酸组成的多肽，多肽等电点约为6.30，分子质量约为77.8 kDa；推导的氨基酸序列与棉蚜Aphis gossypii HSP75同源性高达99.12%，属于hsp 75家族。我们把该基因定名为Aghsp75，已提交至GenBank（登录号为MN068810）。Aghsp75通过不同浓度吡虫啉药剂和不同温度胁迫成蚜后发现，经LC₅₀吡虫啉浓度胁迫3、6和24 h时以及在LC₃₀浓度吡虫啉胁迫12 h时该基因表达量显著升高；经6℃处理6 h时以及36℃处理3 h和6 h时该基因表达量显著升高。本研究表明该基因可能参与大豆蚜的抗逆过程，为利用分子生物技术手段防治大豆蚜提供理论保障。     

饲喂法RNAi介导的HvCHS1基因沉默抑制茄二十八星瓢虫的存活和发育

几丁质的合成与降解之间的平衡关系影响着昆虫的生长发育,而几丁质合成酶1(chitin synthase 1,CHS1)是昆虫几丁质合成过程中的关键酶之一。本研究旨在使用饲喂法RNAi(RNAinterference)探究CHS1对茄二十八星瓢虫Henosepilachnavigintioctopunctata存活和发育的影响。基于从茄二十八星瓢虫基因组数据中获得的Hv CHS1序列,通过生物信息学方法分析其理化性质及与其他昆虫之间的同源性;运用RT-qPCR技术分析该基因的时空表达特性;通过饲喂体外合成和菌液表达的dsRNAs对茄二十八星瓢虫进行RNAi,统计死亡率、化蛹率,并通过苏木精-伊红（H&E）染色观察Hv CHS1基因干扰后的表皮变化。Hv CHS1的开放阅读框为4680 bp,编码1559个氨基酸残基,相对分子质量为177.5 kDa。Hv CHS1在表皮中的表达水平高于其他组织。此外,通过摄食体外合成的ds Hv CHS1导致茄二十八星瓢虫存活率和化蛹率显著下降,存在明显的剂量依赖效应,摄食50 ng/μL、250 ng/μL和500 ng/μL ds HvCHS...     

滞育七星瓢虫酰基辅酶AΔ11去饱和酶基因的克隆及表达分析

去饱和酶（Fatty acid desaturase,FAD）是生物体不饱和脂肪酸合成中的关键酶,酰基辅酶AΔ11去饱和酶基因是其中重要的一种。本试验基于七星瓢虫Coccinella septempunctata L.转录组数据,利用RT-PCR和RACE技术从滞育七星瓢虫中克隆得到酰基辅酶AΔ11去饱和酶基因全长,并命名为CsFadΔ11（GenBank登录号：MF458996）,该基因全长1447 bp,开放阅读框（ORF）1095 bp,编码364个氨基酸,预测蛋白质分子量为42.99 kD,等电点（pI）为8.87,无信号肽。氨基酸序列分析结果表明,CsFadΔ11有3个组氨酸富集区和6个跨膜结构域,与膜翅目的内华达古白蚁Zootermopsis nevadensis同源性较高。利用实时荧光定量PCR技术研究其时间表达模式,发现CsFadΔ11基因在七星瓢虫初羽化、滞育诱导10 d、滞育诱导20 d、滞育初期、滞育后期、滞育解除期以及正常发育状态下均有所表达,且在滞育早期表达量最高,其次是在滞育解除个体中。其整体表达趋势与相应时期脂积累变化情况基本相符,推测CsFadΔ11基因参与七星瓢虫脂积累调控,并进一步影响七星瓢虫滞育。