马铃薯干腐病优势病原菌Fusarium sambucinum 分子检测技术的建立

马铃薯干腐病是马铃薯最重要的贮藏期病害之一,现已成为马铃薯贮藏期烂窖的重要原因。实现病原菌的快速检测对病害诊断和科学防控具有重要的实践意义。本研究基于镰刀菌翻译延伸因子序列设计了一对检测接骨木镰刀菌Fusarium sambucinum的特异引物Fs-F/Fs-R。该特异引物可从接骨木镰刀菌中获得309bp的特异性扩增片段,而其他种类镰刀菌及马铃薯重要病害病原菌中均无此片段,说明该引物具有专一性。该体系的灵敏度检测结果表明,最低能检测到的接骨木镰刀菌基因组DNA浓度为70pg/μL。该引物也适用于发病马铃薯块茎中接骨木镰刀菌的快速检测。     

利用环介导等温扩增(LAMP)技术快速检测辣椒疫霉菌

<正>辣椒疫霉(Phytophthora capsici)是一种重要植物病原菌,能造成植株坏死、果实腐烂,严重影响产量[1]。辣椒疫霉侵染植物的早期病症并不明显,易被忽视。因此,对辣椒疫霉早期快速、准确检测显得尤为重要。聚合酶链式反应(PCR)为动植物病原物检测的重要方法,但需要较昂贵的仪器、试剂与耗材,后期的电泳检测也费时费力,致使这一技术很难在生产一线普及推广。Notomi等2000年研发了环介     

环介导等温扩增技术快速检测麦根腐平脐蠕孢

 为建立麦根腐平脐蠕孢简单快速的分子检测方法,基于环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术,以核糖体DNA的ITS为靶标序列,设计和筛选出一组麦根腐平脐蠕孢的特异性引物,成功开发可快速准确检测麦根腐平脐蠕孢的LAMP方法。甜菜碱作用测试显示LAMP体系中是否添加甜菜碱对扩增结果无明显影响;特异性测试显示该LAMP方法能够从14种植物病原菌中特异地检测出麦根腐平脐蠕孢;灵敏度测试显示该LAMP方法的检测极限为10^-3 ng·μL^-1,是常规PCR检测方法灵敏度的100倍;通用性测试显示该LAMP方法能够准确检测洛阳、安阳、开封和邯郸等不同地理来源的麦根腐平脐蠕孢菌株;发病组织检测显示该LAMP方法能够准确地从人工接种的小麦发病组织中检测出麦根腐平脐蠕孢,检出时间为侵染12 h及以上。这些研究结果表明所建立的麦根腐平脐蠕孢LAMP检测方法特异性好、灵敏度高、适用性强,可用于小麦根腐病的早期快速诊断。     

环介导等温扩增技术在植物病原物检测中的应用

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是一种新型的由环介导的等温核酸扩增分子技术,不仅特异性强、操作简便、成本低,还能快速、高效地检测病原物,为植物病害的防控提供更精准的防治适期,从而可以减少农药的滥用。本文主要针对LAMP技术的原理、发展、优缺点、在真菌、细菌、病毒等多种植物病原物检测及在抗药性检测中的应用进行总结,并结合国内外研究进展对其应用前景进行了分析。     

南方镰孢Fusarium meridionale特异性PCR检测方法的建立与应用

为建立快速、稳定的南方镰孢Fusarium meridionale特异性检测方法,对已报道的镰孢属reductase-like基因部分序列进行比对分析,寻找特异性SNP位点,设计出特异性检测引物F-Fm/R-Fm3。利用该引物对包括南方镰孢在内的30株镰孢的基因组DNA进行PCR扩增。结果显示仅在7株南方镰孢中均扩增出400 bp左右的特异性条带。PCR灵敏度试验结果表明该方法的检测灵敏度达到500 pg基因组DNA。     

基于环介导等温扩增技术的玫烟色棒束孢可视化检测

玫烟色棒束孢Isaria fumosorosea是一种重要的虫生真菌,已成为微生物源农药的一个要资源。由于缺乏有效手段,无法对罹病害虫中玫烟色棒束孢进行大量、快速、准确的检测,严重制约了该生防菌株防治效果的科学评价。本研究通过环介导等温扩增（LAMP）技术的引物设计和体系优化,建立了玫烟色棒束孢菌株可视化的LAMP检测方法。该检测方法特异性强,准确率高,与其他常见生防菌株和病原菌无交叉反应;检测时间短,60 min可得到阳性结果;灵敏度高,是常规PCR方法的100倍。该方法的建立为田间条件下玫烟色棒束孢菌株的毒力测定与安全性评价提供了新技术。     

甘肃省马铃薯镰刀菌干腐病优势病原的分离鉴定

 为明确甘肃马铃薯镰刀菌干腐病的优势病原,2006 年12 月~ 2007 年3 月由西至东从甘肃张掖、天祝、永登、临洮、渭源和西和等6 县市的马铃薯贮藏窖中采集表现有镰刀菌干腐病症状的马铃薯薯块,以组织分离法分离病原,单孢纯化镰刀菌(Fusarium spp. )菌株后,以形态学为基础,参照Nelson 镰刀菌分类系统进行鉴定。结果表明:6 个采样区共分离到293株镰刀菌菌株,其中以接骨木镰刀菌(F. sambucinum)和茄病镰刀菌(F. solani)出现频率高,是优势种。分析发现第一优势种随采样区而异,张掖、天祝和渭源采集的样品中茄病镰刀菌分离频率分别为42. 6% 、42. 1% 和32. 4% ,接骨木镰刀菌分离频率分别为14. 8% 、5. 3% 和26. 5% ,茄病镰刀菌为第一优势种;永登、临洮和西和采集的样品中接骨木镰刀菌分离频率分别为52郾1% 、50. 9% 和55. 2% ,茄病镰刀菌的分离频率分别为23. 3% 、32. 7% 和20. 7% ,接骨木镰刀菌为第一优势种。本文进一步对其在PDA、CLA 上的培养特征进行了观察和描述。按照柯赫氏法则用混合菌株接种法对大西洋(Atlantic)、夏波蒂(Shepody)以及一地方品种进行致病性测定,证实了优势菌种对块茎的致病性。利用EF鄄1琢基因引物(EF鄄1H 和EF鄄2T)对接骨木镰刀菌菌株GAUF鄄F12 进行基因组DNA 的PCR 扩增,将PCR 产物回收测序后在GenBank 上比对,菌株GAUF鄄F12 与GenBank 登记的接骨木镰刀菌5 个菌株的同源性均达99% ;用DNASTAR 分析软件将同源性较高的登记菌株的序列与GAUF鄄F12 菌株构建同源性树,结果表明:该菌株与以上5 个接骨木镰刀菌菌株均位于同源性树的同一分支,聚为一类,与形态学的鉴定结果一致。     

江苏省水稻恶苗病菌种群鉴定及抗药性检测

由藤仓赤霉复合种Gibberella fujikuroi species complex引起的恶苗病(rice bakanae disease)是严重危害水稻的种传病害.为探明江苏省水稻恶苗病菌的种群结构及对多菌灵、咪鲜胺和氰烯菌酯的抗药性现状,分别对2019年江苏省13个县(市)和2020年18个县(市)采集的恶苗病...     

大豆根腐病致病镰孢菌的多重PCR检测技术

为建立大豆根腐病镰孢菌的多重PCR检测方法,以四川大豆根腐病致病菌包括尖孢镰孢菌、腐皮镰孢菌、禾谷镰刀菌和木贼镰孢菌为对象,设计镰孢菌翻译延伸因子基因EF-1α的种特异引物,建立多重PCR扩增体系,并进行优化与验证。结果表明:25μL体系为最优镰孢菌多重PCR扩增体系,4种镰孢菌等体积混合DNA 4.0μL,各镰孢菌特异正向引物1.0μL,共用反向引物4.0μL,最佳退火温度为54℃,当循环30次时,能清晰地扩增出各镰孢菌EF-1α条带,对4种镰孢菌混合DNA的检测灵敏度可达0.1 ng/μL。室内环境样本验证结果表明,依据EF-1α扩增片段大小,该体系能够特异地检测出大豆黄化苗与致病镰孢菌混合样本中的镰孢菌,但无法从其它真菌的DNA中扩增获得目的片段。表明基于EF-1α基因特异引物建立的镰孢菌多重PCR检测技术可快速、特异地检测大豆根腐病镰孢菌。     

玉蜀黍黑粉菌环介导等温扩增检测体系的建立及应用

 本文根据玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis )的UmPep1、UmPit2和UmSee1基因各设计4套环介导等温扩增(LAMP)引物,从中筛选出1套引物对LAMP反应体系进行3因素(Bst DNA聚合酶浓度、Mg²⁺浓度、内外引物浓度比)3水平的优化试验。并对优化的U. maydis LAMP反应体系进行特异性、灵敏度及田间检测可行性试验。特异性试验表明,该方法能特异性检测U. maydis,而与其他病原菌的DNA没有交叉反应;灵敏度试验表明,该反应体系的最低检出限为44 fg·μL^-1 pEasy-Pep质粒DNA,制作的标准曲线可对U. maydis进行定量分析。该方法也适用于在U. maydis侵染前或侵染早期对田间样品进行检测,对现场采集的172份田间样品进行检测,其中140个样品显示为阳性。本研究所建立的LAMP体系具有特异性好、灵敏度高、重复性好的特点,并能在45 min内完成对田间样品的检测,是快速、定量检测U. maydis的有效手段。     

基于环介导等温扩增技术快速诊断由Fusarium andiyazi引起的水稻恶苗病

水稻恶苗病是水稻上的重要病害,在我国各水稻主要种植区均有发生,造成水稻产量的严重损失。Fusarium andiyazi是近年来国外报道的水稻恶苗病的病原菌之一,本研究基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAM P),以F.andiyazi的TAT(trichothecene 3-O-acetyltransferase)基因为靶标设计并筛选出一套灵敏、特异的LAM P引物,建立了可快速诊断该病菌所引起的水稻恶苗病的LAMP检测技术。在等温条件下(64℃)只需进行核酸扩增反应80 min,反应前向体系中加入了金属离子指示剂HNB(羟基萘酚蓝),反应后即可肉眼观察反应产物颜色变化判断检测结果,阳性反应呈天蓝色,阴性呈紫色。该TAT-Fan-LAMP技术的最低检测灵敏度为100 pg·μL~(-1)。应用该技术成功地对南京江宁和镇江句容田间采集的由F.andiyazi引起的水稻恶苗病进行快速诊断。该LAMP检测技术的建立为F.andiyazi引起的水稻恶苗病的诊断提供了简便快速的新技术。     

基于环介导等温扩增技术快速检测美澳型核果褐腐病菌

本文建立了美澳型核果褐腐病菌(Monilinia fructicola)环介导等温扩增技术,并利用此技术开展了M.fructicola的检测和鉴定。采用M.fructicola SCAR分子标记的MO368特异片段为靶标序列,设计并筛选出M.fructicola的特异性LAMP引物,建立了该病菌快速诊断方法。试验结果表明,仅M.fructicola的菌株DNA扩增后呈天蓝色的阳性反应,而在其他真菌的供试菌株中均呈紫色的阴性反应。检测灵敏度可达到100 pg/μL。利用该方法对无锡机场截获的7份疑似李子褐腐病样本进行检测,结果有3份样品呈LAMP阳性反应。本文建立的M.fructicola LAMP检测方法具有灵敏度高、特异性好,简便易行等优点,为美澳型核果褐腐病菌的快速检测提供了一种新技术。     

基于环介导等温扩增技术检测由强雄腐霉引起的玉米茎腐病

为建立强雄腐霉Pythium arrhenomanes的快速分子检测技术,基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)以β-tubulin基因为靶标序列,设计强雄腐霉的特异性引物,建立了一种准确快速的LAMP检测方法,并对该检测方法的特异性、灵敏度和实际应用效果进行评估。25μL LAMP最终反应体系为:10×ThermoPol Buffer 2.5μL、10 mmol/L dNTPs 3.5μL、6 mmol/L MgSO_4 2μL、5 mol/L甜菜碱4μL、40μmol/L FIP-1/BIP-1各1μL、5μmol/L F3-1和B3-1各1μL、40μmol/L LB-1 1μL、Bst DNA polymerase 1μL、2.5 mmol/L HNB 1.9μL、模板DNA 2μL、灭菌水3.1μL。LAMP体系在等温64℃条件下反应60 min,HNB显色反应显示天蓝色即为阳性反应;扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳验证为梯形条带,也可判定为阳性反应。特异性检测结果显示,LAMP体系能特异性地检测出强雄腐霉,而其它卵菌近缘种和常见植物病原真菌均未检测出。灵敏度检测结果显示,LAMP体系的最低检测灵敏度为10 pg/μL,是普通PCR反应灵敏度的1 000倍。在实际应用中,LAMP体系能够快速检测出人工接种和实际发病玉米组织中的病原菌。表明本研究建立的快速、准确、可视化的LAMP检测方法能在60 min内检测出强雄腐霉。     

一株马铃薯干腐病生防菌的鉴定及其抑菌活性研究

镰孢菌引起的马铃薯干腐病是影响马铃薯贮存期间产量与品质的重要病害之一。寻找高效低毒的防治马铃薯干腐病的生防药剂对提高马铃薯的产量与质量具有重要意义。本研究以腐皮镰孢Fusarium solani为病原菌, 测定分离自马铃薯块茎的菌株2-1-9-CJK-2的抑菌活性。该菌株发酵液、无菌发酵液、菌悬液、胞内组分以及挥发性有机物对腐皮镰孢均具有抑菌活性, 抑制率分别为93.37%、61.92%、80.82%、44.01%和49.16%。结合形态学、生理生化特征和多基因系统发育树构建鉴定其为贝莱斯芽胞杆菌Bacillus velezensis。马铃薯切片试验和马铃薯块茎试验表明, 当菌株发酵液浓度为1×109 cfu/mL时, 对病原菌的抑制效果最好。除此之外, 菌株可以分泌蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶, 具有溶磷能力和生物膜形成能力, 但不具有溶血性, 并且对供试的其他6种病原真菌有较强的抑菌活性。研究表明贝莱斯芽胞杆菌2-1-9-CJK-2抑菌谱广, 具有生物安全性, 对腐皮镰孢有较强的抑菌活性, 在植物病害防治中具有一定的应用潜力, 可为马铃薯干腐病生防制剂的开发奠定基础。     

环介导等温扩增技术检测大丽轮枝菌

 本研究基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),通过比对分析大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)与其相近种不同靶标序列间的差异,选取Gpd(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,甘油醛-3-磷酸脱氢酶)基因作为靶标基因,设计并筛选了四条特异性强、灵敏度高的LAMP引物和两条环引物,建立了一种基于颜色判定的简单、快速和灵敏的大丽轮枝菌的检测方法,并进行了特异性、灵敏度实验及田间发病组织的检测。该方法在62 ℃等温条件下进行核酸扩增反应70 min,扩增前加入染料HNB(羟基萘酚蓝),反应后根据染料颜色变化判定扩增结果。特异性试验中,仅含有大丽轮枝菌菌株DNA的反应管扩增后呈天蓝色的阳性反应,而其他供试菌株均呈紫色的阴性反应。该方法的最低检测限为100 pg·μL^-1,在土壤中检测的灵敏度为10个孢子/0.25g土壤。该技术能够检测出棉花发病组织中的目标菌,对采自江苏和山东的24份疑似病害样本进行检测,11份为阳性。该方法的建立为大丽轮枝菌的检测及其所致病害的诊断提供了新的技术。     

外源茉莉酸甲酯对紫花苜蓿尖孢镰刀菌根腐病抗病性的作用

 本研究以紫花苜蓿品种、茉莉酸甲酯(Methyl Jasmonnate, MeJA)浓度、MeJA诱导天数为处理因素,按照四因素三水平[L₉(3⁴)]的正交试验设计,通过测定发病情况和相关生理生化指标来探究MeJA对紫花苜蓿尖孢镰刀菌根腐病抗病性的作用。结果表明,施用外源MeJA能够降低甘农3号、龙牧803和中苜一号的发病率和病情指数。外源MeJA诱导处理可增强超氧化物歧化酶和苯丙氨酸解氨酶的活性,但对过氧化物酶的影响相对较小;经诱导处理后地上生物量鲜重和干重也有显著增加,而可溶性蛋白质的含量却显著降低。方差分析和极差分析结果表明,MeJA诱导处理存在品种、诱导浓度和诱导天数间的差异,其中MeJA浓度是影响各测定指标的主要因素。通过因子综合分析得出,本次研究中甘农3号,用MeJA 0.1 mg·mL^-1诱导处理并同时接种对尖孢镰刀菌引起的根腐病的抑制效果最佳。