朗伍德王莲腐霉叶腐病及病原鉴定

2009年,南京中山植物园王莲育苗池中的朗伍德王莲(Victoria‘Longwood Hybrid’)发生了叶片腐烂病。按照柯赫氏法则对其进行了病原物的分离、纯化和致病性测定,并对菌株进行了形态学和分子生物学鉴定。从发病部位稳定分离到形态一致的低等真菌;致病性测定结果表明,回接后发病株产生与自然侵染相同的症状,并重新分离到相同菌株。通过病原菌形态特征和核糖体rDNA ITS序列分析,病株分离物被鉴定为旋柄腐霉(Pythium helicoides)。这是国内外首次报道在王莲上分离出旋柄腐霉并证明其为王莲的致病菌。该病害被定名为王莲腐霉叶腐病。     

柑橘绿霉病菌中多聚半乳糖醛酸酶基因(PdPG2)的表达分析

柑橘绿霉病菌Penicillium digitatum是储藏期柑橘腐烂病最主要的病原之一,严重影响柑橘产业的发展。已有研究表明,柑橘绿霉病菌中多聚半乳糖醛酸酶(PdPG2)对其致病性有重要作用,PdPG2基因功能缺失突变株的致病性会下降,然而有关PdPG2基因的表达研究尚不完善。本文研究了PdPG2基因在不同条件下的表达情况,结果表明PdPG2是酸性表达基因,其表达量随着pH的升高而降低,pH为3.0时其表达量为对照条件下的10倍,pH为8.0时其表达量为对照条件下的0.36倍。柑橘果胶能够诱导PdPG2的表达,其表达量为对照的3.6倍。因此,在侵染过程中PdPG2表达的升高是由于发病部位酸化以及橘皮降解物诱导共同引起的。     

凸脐蠕孢菌玉米、高粱专化型的细胞壁降解酶活性及基因表达分析

为探明玉米专化型和高粱专化型凸脐蠕孢菌的细胞壁降解酶在致病过程中的作用,采用酶活性检测方法测定了2种专化型的细胞壁降解酶活性,并检测了相关基因的表达。结果表明:高粱专化型凸脐蠕孢菌的聚甲基半乳糖醛酸酶(PMG)活性为115.84 U/mg,略高于玉米专化型;玉米专化型的多聚半乳糖醛酸酶(PG)和纤维素酶(Cx)的活性分别为151.76 U/mg和168.53 U/mg,略高于高粱专化型;且同一种专化型菌株的细胞壁降解酶活性存在差异。2种专化型的细胞壁降解酶基因表达量存在差异,Cx基因在2种专化型互作过程中均随病程的延长而大幅度上调表达;高粱专化型的PG基因随病程的延长大幅度上调表达,而玉米专化型的PG基因随病程的延长上调表达量有所下降;高粱专化型的PMG基因随病程的延长大幅度上调表达,而玉米专化型的PMG基因随病程的延长下调表达。推测产酶能力、基因表达和基因时间表达的差异可能是引起凸脐蠕孢菌专化型致病专化性的诱因之一。     

一种值得关注的花生新病害：花生新赤壳菌基腐病

2010年在我国广东省首次报道了由侵管新赤壳菌(Neocosmospora vasinfecta)侵染引起的花生新赤壳菌基腐病.罹病花生植株萎蔫、植株茎基部和根系变黑腐烂,在潮湿条件下,罹病部位有浅红色子囊果.这是我国大陆首次报道的花生新病害.该病害在广东省的多个市县有发生,严重的发病率高达30％.除广东省外,该病在我国江西省也有分布和危害,其致病菌可进一步鉴定为侵管新赤壳菌非洲变种(N.vasinfecta var.africana).在广东省也发现了由侵管新赤壳菌侵管变种(N.vasinfecta var.vasinfecta)引起的大豆茎枯病.对侵管新赤壳菌的文献进行了简要的综述.     

匙叶天南星褐腐病的检出

 匙叶天南星是华南地区近几年新引入的一种重要花卉植物,1995年秋广东省广州市和顺德市栽种引自台湾的植株发生褐腐病,导致大量死亡。通过病原菌鉴定及对病土和各种种花基质进行的一系列试验,表明该病是由Cylindrocladium spathiphyli Schoulties et al.引起;病原菌是自台湾省随种苗和介质传入大陆的。建议在进行引种种苗时严格注意对植物根和介质的检疫。     

滑县花生果腐病发生及综合防治措施

花生果腐病对花生造成极大的为害,介绍花生果腐病的为害症状和发病特点,提出综合防治措施。     

福建省泉州市花生茎腐病的发生与防治

花生茎腐病俗称烂脖子病、枯萎病、倒秧病、烂腰病、掐脖瘟,是一种暴发性病害,依据近几年的调查,发现花生茎腐病呈现逐年加重趋势.该病主要危害茎秆,造成花生茎秆腐烂而枯死,植株早期感病后很快枯萎死亡,后期感病者果荚常腐烂或种仁不饱满,严重影响花生的产量和品质.     

甘蔗NBS-LRR类抗梢腐病基因的筛选及定量表达分析

本文旨在探讨核苷酸结合位点和富含亮氨酸重复(NBS-LRR)类基因参与甘蔗抗梢腐病菌侵染应答机制,为后续克隆关键抗病基因以及研究抗病机理提供理论依据。试验利用Illumina高通量转录组测序技术检测高抗梢腐病品种‘粤糖94-128’和高感梢腐病品种‘桂糖37号’接种前后NBS-LRR类抗梢腐病基因的表达情况,然后设计引物对显著差异表达基因进行不同接种时期下的荧光定量PCR验证。结果表明,16个NBS-LRR类基因在甘蔗叶片受到梢腐病菌侵染后持续上调表达,但表达趋势存在两种情况,13个基因在诱导后7 d显著或极显著上调表达,3个基因在诱导7 d后上调表达不显著,在诱导14 d后才显著上调表达。据此可将其分为瞬时基础防御基因(0~7 d)和滞后特异性防御基因(14~21 d),确定NBS-LRR类基因参与甘蔗防御梢腐病菌的侵染。     

黑尾叶蝉NcPGRP基因克隆及表达模式分析

为明确黑尾叶蝉肽聚糖识别蛋白(Nephotettix cincticeps peptidoglycan recognition protein,Nc PGRP)的功能,利用RT-PCR克隆长度为552 bp的Nc PGRP开放阅读框,其编码蛋白大小为19.9 k D,无信号肽,含3个锌离子结合/酰胺酶催化位点,1个二氨基庚二酸型(Dap型)肽聚糖识别位点。系统发育分析表明,Nc PGRP与其他昆虫亲缘关系较远。利用显微注射技术对黑尾叶蝉进行病原细菌诱导,定量PCR结果显示Nc PGRP在受大肠杆菌及藤黄微球菌刺激后,其转录水平显著上调。组织分布研究表明,Nc PGRP的m RNA在各组织中均有表达,且头部表达量最高。黑尾叶蝉取食感染水稻普通矮缩病毒RDV的水稻后,Nc PGRP转录水平受抑制。本文研究表明,Nc PGRP是一种诱导型表达的PGRP,黑尾叶蝉感染RDV能显著抑制其转录,进而削弱黑尾叶蝉免疫能力,这可能有利于RDV与黑尾叶蝉共生。     

柑橘黄龙病侵染相关抗病基因同源序列的克隆鉴定与表达分析

[目的]从黄龙病耐病寄主植物cDNA中筛选抗病基因相关序列并对其进行表达分析研究。[方法]根据已克隆的植物抗性基因表达产物NBS-LRR保守区域设计简并引物,以耐HLB的柑橘属柚cDNA为模板扩增RGAs,并进行实时荧光定量PCR。[结果]通过RFLP分析及克隆测序共得到5个NBS类抗病基因相似序列(RGAs)片段,在GenBank上登录号为HM777043～HM777047。通过Clustalx、DNAMAN等软件分析5个RGAs及其推导的氨基酸的相似性,结果显示它们均含有典型NBS-LRR类抗性基因所具有的保守区域:P-loop、Kinase-2a、GL-PLAL,其与已克隆的烟草N、亚麻L6、拟南芥RPS2、RPS5、RPP8、RPM1等抗病基因在保守区域氨基酸水平上的相似性为19.71%～42.86%。根据得到的序列设计特异性引物,对5个RGAs在HLB侵染过程中的表达进行定量PCR,结果显示嫁接病芽接穗后的8次连续采样中5个RGA的表达受到不同程度的调控。[结论]表明5个RGAs可能与黄龙病的侵染有关。     

西藏一种芥菜型油菜PGIP基因的克隆与序列分析

防治油菜菌核病的有效方法是培育抗菌核病的油菜品种。多聚半乳糖醛酸酶阻遏蛋白(polygalacturonase inhibiting protein,PGIP),是植物体内一种重要的抗真菌蛋白。本研究根据NCBI中发表的PGIP基因序列设计引物,从芥菜型油菜‘藏油6号’中克隆得到全长1 048bp的PGIP基因序列。其核酸序列与NCBI数据库中登录的PGIP基因序列同源性为99%。该序列翻译后得到的氨基酸序列与NCBI上公布的油菜PGIP序列同源性为99%。该蛋白质序列中包含8个亮氨酸重复区(leucine-rich repeat,LRR)。过去研究结果显示芥菜型油菜比甘蓝型、白菜型油菜对菌核病的抗性普遍较高,但是未能搞清楚具体的原因,只是提出抗菌核病基因主要分布在芥菜型油菜中,其次是甘蓝型油菜中。通过研究证实了芥菜型油菜上PGIP基因具有保守性、疏水性,而且结构稳定,具有多个信号肽,能够高效地发挥其抗核盘菌的功能。今后在油菜育种上应利用芥菜型油菜的优势,发挥其抗病育种的潜力。     

茶树病程相关蛋白基因CsPR5的克隆及表达分析

为探究茶树中病程相关蛋白5(pathogenesis-related protein 5,PR5)在茶树中的功能,采用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA end,RACE)技术克隆了PR5基因的全长;通过荧光定量PCR方法检测了CsPR5在龙井43茶树不同组织部位、植物激素(茉莉酸、乙烯利和水杨酸)处理、茶炭疽病菌Colletotrichum camelliae侵染和小贯小绿叶蝉Empoasca onukii为害后的表达特征。结果表明,CsPR5基因开放阅读框为843 bp,编码281个氨基酸。CsPR5基因在茶树根、茎、嫩叶、花和种子5个组织中的相对表达量分别为0.187、3.093、0.928、0.045和0.012,且五者之间差异显著,主要在茎和叶中表达,其分别为根中相对表达量的16.54倍与4.96倍。水杨酸处理6 h及乙烯利处理6、12 h后,茶树CsPR5基因的相对表达量分别为1.622、2.344和1.845,分别比对照显著上调2.20倍、3.18倍和2.35倍;但是外施茉莉酸对茶树CsPR5基因的相对表达量无影响。茶炭疽病菌侵染显著诱导了茶树CsPR5基因的相对表达量,处理后的相对表达量为1.977,是对照的1.90倍;小贯小绿叶蝉取食显著抑制了其为害部位CsPR5的相对表达量,为7.273,仅为对照的38.80%,但该诱导不具系统性。     

辽宁花生主栽品种(系)对褐斑病和网斑病抗性鉴定

本研究旨在明确辽宁花生主栽品种(系)对花生褐斑病和网斑病的抗性,以期为抗病育种及田间病害防治提供理论依据。试验采用田间自然病圃法,对辽宁主栽的16个花生品种(系)进行了褐斑病和网斑病田间抗性鉴定。结果表明,供试花生品种(系)对两种叶部病害抗性存在显著差异,但缺乏免疫和高抗品种。对花生褐斑病抗性鉴定结果表明,‘阜花17’属抗病类型,‘鲁花11’、‘铁引花2号’、‘良青8号’、‘新花2号’和‘锦花15’属中抗类型,其余属高感或感病类型。对花生网斑病抗性鉴定结果显示:‘鲁花11’、‘铁引花2号’和‘白花生’属抗病类型,‘黑花生’、‘新花2号’、‘花育20’、‘锦花14’、‘新花1号’、‘锦花15’和‘良青8号’属中抗类型,其余属高感或感病类型。多数花生品种(系)对花生叶斑病综合抗性较差。     

来源于桃和苹果的苹果褪绿叶斑病毒的部分分子生物学特性和cp基因的原核表达

 从桃和苹果上分离得到苹果褪绿叶斑病毒ACLSV-HBP和ACLSV-C2个分离物,采用RT-PCR法进行扩增,所获扩增片段经序列测定,其全长分别为1768nt(ACLSV-HBP)和1751nt(ACLSV-C)。这2个分离物扩增片段全长的同源性为83%,mp基因片段核苷酸和推导编码氨基酸序列同源性分别为82.6%和87.1%;cp基因均由582nt组成,其核苷酸和推导编码氨基酸序列同源性分别为87.8%和95.9%。将2个分离物的cp基因与已报道ACLSV分离物进行序列同源性比较,结果显示ACLSV-HBP与SX/2的cp基因核苷酸序列及推导编码氨基酸序列同源性最高,分别为94.0%和96.4%。将ACLSV-HBP分离物的cp基因克隆到原核表达载体pGEX-KG,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,SDS-PAGE分析表明,融合蛋白大小约为46kDa。Western-blot分析表明,该基因在大肠杆菌内得到高效表达,融合蛋白具有抗原性。     

水稻热休克蛋白HSP70基因克隆、表达分析及原核表达

为明确水稻热休克蛋白70（heat shock protein 70,HSP70）基因在逆境胁迫下的表达特征,以日本晴粳稻水稻品种为材料,通过基因克隆方法获得水稻HSP70基因cDNA全长序列,并采用生物信息学的方法分析其序列特征,利用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,RT-qPCR）技术测定不同水稻组织、不同激素、不同温度以及不同逆境下HSP70基因的相对表达量,同时对其原核表达条件进行优化。结果表明,水稻HSP70基因全长1 950 bp,预测蛋白大小为71.18 kD,等电点为5.10,亚细胞定位于细胞质内,有较强的亲水性。水稻HSP70蛋白序列与香蕉HSP70蛋白序列的亲缘性较高;水稻HSP70基因表达具有组织特异性,在茎中的相对表达量最高,在根中最低;低温胁迫后,水稻HSP70基因在12 h内基因相对表达量相对稳定,在24 h时相对表达量达到峰值,为9.60;高温胁迫后,在较短时间内水稻HSP70基因显著上调并达到峰值,为79.10;激素吲哚乙酸、脱落酸和油菜素内酯均能诱导水稻HSP70基因表达;但在甘露醇模拟干旱和NaCl盐胁迫处理下,水稻HSP70基因的相对表达量呈现先升后降的趋势。水稻HSP70蛋白的最佳诱导温度是30℃,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷最佳诱导浓度为1.2 mmol/L。     

七星瓢虫乙酰辅酶A羧化酶基因克隆及表达分析

乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase,ACC)是脂肪酸合成第一步反应的限速酶,参与长链脂肪酸的合成。本试验基于七星瓢虫Coccinella septempunctata L.转录组数据,探究ACC在滞育七星瓢虫脂代谢中的调控作用。利用RT-PCR和RACE技术从七星瓢虫中克隆得到ACC基因全长,命名为CsACC(GenBank登录号:MT012819),该基因cDNA序列全长7 217 bp,开放阅读框(ORF)长为6 792 bp,编码2 263个氨基酸,预测蛋白质分子量为255.9 kDa,理论等电点(pI)为5.90,无跨膜螺旋结构,无信号肽。通过氨基酸多序列比对分析,结果显示CsACC与鞘翅目的赤拟谷盗Tribolium castaneum乙酰辅酶A羧化酶同源性较高。利用实时荧光定量PCR技术检测CsACC基因在七星瓢虫正常发育及滞育诱导不同阶段的相对表达量,结果显示,滞育诱导30 d表达量达到最高,滞育诱导60 d、滞育解除期以及正常发育30 d表达量几乎持平。本研究为揭示CsACC基因在脂代谢通路中的调控作用提供理论依据。     

甘蔗黄叶病毒外壳蛋白基因克隆及其实时荧光RT-PCR检测

 甘蔗黄叶病毒（Sugarcane yellow leaf virus, SCYLV）引起的甘蔗黄叶病是一种新的全球性病毒病害。本文以YLSCPF1和YLSCPR591为引物,采用RT-PCR方法克隆了甘蔗黄叶病毒福建分离物（CHN-FJ1）外壳蛋白（CP）基因,编码196个氨基酸。分析不同地理来源的SCYLV病毒分离物cp基因核苷酸及其推导编码的氨基酸序列,同源性达95%以上。根据cp基因的保守序列,设计1对特异性引物和TaqMan探针,建立了SCYLV的TaqMan实时荧光RT-PCR方法。结果表明,检测下限为初始质粒模板DNA 1 000拷贝/μL（约3.61 fg/μL）,比常规PCR方法的灵敏度提高100倍。检测甘蔗花叶病毒、宿根矮化病菌和黑穗病菌,没有典型的扩增曲线和无Ct值。应用实时荧光RT-PCR、常规RT-PCR和组织印迹免疫杂交（TBIA）对田间甘蔗叶片样品进行检测,阳性检出率分别为100%、61.5%和69.2%,表明该方法比常规RT-PCR和TBIA具有更高的灵敏度,适合于对SCYLV的检测。     

小麦诱导抗性基因TaWIR1b的克隆及表达分析

全蚀病是小麦上一种重要的土传病害。选育和种植抗病品种是防治小麦全蚀病的根本途径,抗病基因研究是抗病育种的基础性工作。根据基因TaWIR1b(Accession no.M94959.1)的全长序列设计引物扩增‘新农19’的cDNA,获得了完整ORF,编码85个氨基酸残基,比对后发现与TaWIR1b序列同源性达100%。根据获得的TaWIR1b基因全长序列设计定量引物,分析TaWIR1b在全蚀菌胁迫条件下不同互作模式的表达特征。结果表明接种全蚀病菌后抗病小麦品种‘新农19’中TaWIR1b基因被诱导表达,接菌后3d达到峰值143.97,感病品种‘新麦19’中峰值出现在接菌后8d,表达量仅为对照的4.22倍,提示该基因可能参与小麦对全蚀病的抗病过程。