小麦白粉菌环介导等温扩增检测技术体系的建立与应用

为建立简便、快速和灵敏的小麦白粉菌Blumeria graminis f.sp.tritici(Bgt)分子检测技术体系，基于环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术，以BGT96224V316＿LOCUS1725基因(GenBank:VCU40465.1)为靶标序列，设计并筛选特异性引物，建立小麦白粉菌的LAMP检测方法，并对其特异性、灵敏度和应用效果进行测定。结果表明，基于筛选出的1套特异性引物建立的LAMP方法能够从8种白粉菌属菌株和1种腐生菌中特异性地检测到小麦白粉菌；对小麦白粉菌DNA样品的检测灵敏度可达到300 fg/μL;对发病叶片的检测显示该LAMP方法能从人工接种的小麦叶片中准确检测出小麦白粉菌，检出时间为接种4 h及以上。综上，本研究建立了一种小麦白粉菌的LAMP检测方法，具有简便快捷、灵敏度高等特点，丰富了小麦白粉菌的检测体系。     

小麦白粉菌ISSR分子标记体系构建及其分离菌株的多样性分析

为了对小麦白粉菌群体的多样性进行研究,构建了其ISSR分子标记体系。以小麦白粉菌基因组DNA为模板,用正交设计和单因素水平优化的方法对ISSR反应程序中的一些重要参数进行摸索和优化,建立了小麦白粉菌ISSR-PCR反应的优化反应体系;对20个ISSR引物的退火温度进行了优化,并筛选出一些多态性较好的ISSR引物。对33个分离菌株的ISSR扩增表明,ISSR标记在我国小麦白粉菌中存在较高的多态性;对ISSR标记揭示的白粉菌的遗传多样性和毒性多样性进行了比较,结果表明两者之间存在一定程度的相关性。     

小麦根部内生细菌ZY-1对小麦白粉菌的抑菌活性及拮抗机理

从小麦根部分离到6株代谢表面活性剂的菌株,比较各菌株排油性和抑菌性,结合PCR方法优选出一株具广谱抗菌性且含有srfA、fenA、ituB和bacD等4个关键基因的细菌ZY-1。经BIOLOG生理生化试验测定和16S rDNA序列系统发育学分析,将其鉴定为蜡样芽孢杆菌。平板和盆栽试验结果显示,菌株ZY-1的发酵液对活体专性寄生菌小麦白粉菌的生防效果分别达到（97.94±1.25）%和（82.56±2.11）%,优于10 mg/L的三唑酮化学药剂（P<0.05）。组织学显微观察表明,菌株ZY-1发酵液对小麦白粉病菌的分生孢子萌发和吸器形成具有极显著的抑制作用。产脂肽细菌ZY-1是一株应用前景广阔的生防菌。     

小麦小GTP结合蛋白基因TaRop3克隆及其表达分析

利用同源克隆法从小麦抗条锈病基因Yr5近等基因系（Taichung29*6/Yr5）克隆到编码Rop蛋白基因的全长cDNA序列,并将基因命名为TaRop3（Triticum aestivum Rop3）,聚类分析其所在Rop蛋白家族中的亚组,并利用半定量RT-PCR方法分析其组织表达特异性和不同诱导条件下表达动态。序列分析表明,TaRop3开放阅读框为639 bp,预测编码含213个氨基酸残基Ⅱ型Rop蛋白,C末端具有膜定位基序,与大麦HvRop4和水稻OsRac4聚类在同一亚组。TaRop3基因在小麦幼苗和成株根、茎、叶片和茎节、柱头及花药中均有表达,其中在幼苗及成株茎部表达水平较高。非亲和条锈菌小种CYR17侵染和水杨酸处理诱导TaRop3表达增强,而干旱、高温胁迫以及脱落酸、乙烯利和茉莉酸甲酯处理均降低该基因表达水平。     

小麦淀粉合酶基因Ⅱ克隆及反义和RNAi载体构建

采用RT-PCR方法从小麦品种豫教2号的籽粒中克隆出淀粉合酶Ⅱ基因(Starch synthaseⅡ,SSⅡ)部分cDNA片段(600bp)(GenBank No.EF221761),同源性比较结果显示,它与GenBank上已报道的SSⅡ基因有高度同源性。以pCMBIA1301质粒为基础,构建了由35S启动子调控的SSⅡ基因的反义表达载体pCMBIA1301SSIIA;另外,还以pFGC5941质粒为基础,构建了SSⅡ基因的RNAi载体pFGC5941SSIIsa,这些载体的构建为研究此基因的功能奠定了基础。     

2013年我国部分麦区小麦白粉菌群体对温度敏感性及其与毒性的关系

 研究小麦白粉病菌群体对温度的敏感性及其与毒性的关系,可为气候变化背景下小麦白粉病的长期发生趋势预测和防治提供依据。本研究对2013年采自云南、四川、河南、北京和陕西五省（市）的小麦白粉菌标样进行分离纯化,获得90个单孢子堆分离物,采用小麦离体叶段法进行温度敏感性测定,并利用32个已知抗病基因品种（系）进行毒性测定,且对两者之间的相关性进行分析。结果表明,供试菌株ET50分布于19.78℃~25.15℃,平均ET50为23.22℃,其中73.34%的供试菌株ET50值介于22℃到24℃之间,小于22℃的菌株占10%,大于24℃的菌株占16.67%。利用Popgen1.32软件对5个省（市）小麦白粉病菌群体的毒性进行多样性分析,结果表明五省市小麦白粉菌群体毒性水平上的多样性指数 H 值为0.237 0,其中四川群体毒性多样性水平最高,Nei’s基因多样性指数 H 值为0.221 2,河南群体最低, H 值为0.197 5。小麦白粉菌群体对温度敏感性与毒性多样性相关性分析结果表明,ET50与毒性多样性（ H 和 I 值）间存在显著的负相关。     

1个小麦NBS类抗病基因同源cDNA序列的克隆与鉴定

 利用cDNA末端快速扩增技术对小麦抗叶锈病近等基因系TcLr35中所获得的抗病基因同源片段S2A2 5'端和3'末端序列进行扩增,并根据拼接序列设计特异性引物,进行全长基因的扩增,获得了1个通读的NBS类抗病同源基因S2A2 cDNA序列,该序列全长为3476 bp,编码866个氨基酸序列。经BLASTp比较,该片段含有NB-ARC保守结构域和多个LRR结构域,与已知植物抗病基因I2C-1、L6、RPS2等相应区域相一致。半定量RT-PCR分析表明,该基因在小麦叶片中为低丰度组成型表达。本研究在TcLr35小麦中成功获得了抗病同源基因,这为最终克隆小麦抗叶锈病基因Lr35奠定了基础。     

2012年部分麦区小麦白粉菌群体对三唑酮敏感性及其与毒性的关系

 抗病品种和化学防治是控制植物病害最有效的两种措施,病原菌在长期选择压下可改变其群体结构,以逐步适应品种抗性和杀菌剂压力。本研究采用拌种离体叶段法对 2012年采自我国9个省(市)的129个小麦白粉病菌Blumeria graminis f. sp. tritici单孢堆分离物进行了三唑酮敏感性检测,同时采用31个已知抗病基因品种(系)对其进行苗期毒性测定,并对二者之间的相关性进行分析结果表明:129个供试菌株对三唑酮的EC₅₀为 109.97 mg/L,平均抗药性水平达到52.62倍,变异系数为 107.2。所有供试菌株中,99.22% 的菌株产生了抗药性,其中高抗菌株占58.91%,中抗菌株占37.98%。北京菌株的抗药性水平明显高于其他8个省市。利用Popgen1.32软件对9个省(市)小麦白粉病菌群体的毒性多样性分析结果表明,四川群体毒性基因多样性水平最高,Nei基因多样性H值为0.224 1,浙江群体最低,H值为0.096 8。小麦白粉菌群体对三唑酮的敏感性和毒性的相关性分析表明,EC₅₀或EC₅₀变异系数与毒性多样性之间均不存在显著的相关性,但EC₅₀与毒性基因数目之间的关系符合对数方程。此结果可为杀菌剂和抗性品种的合理利用提供依据。     

小麦诱导抗性基因TaWIR1b的克隆及表达分析

全蚀病是小麦上一种重要的土传病害。选育和种植抗病品种是防治小麦全蚀病的根本途径,抗病基因研究是抗病育种的基础性工作。根据基因TaWIR1b(Accession no.M94959.1)的全长序列设计引物扩增‘新农19’的cDNA,获得了完整ORF,编码85个氨基酸残基,比对后发现与TaWIR1b序列同源性达100%。根据获得的TaWIR1b基因全长序列设计定量引物,分析TaWIR1b在全蚀菌胁迫条件下不同互作模式的表达特征。结果表明接种全蚀病菌后抗病小麦品种‘新农19’中TaWIR1b基因被诱导表达,接菌后3d达到峰值143.97,感病品种‘新麦19’中峰值出现在接菌后8d,表达量仅为对照的4.22倍,提示该基因可能参与小麦对全蚀病的抗病过程。     

小麦丙氨酸氨基转移酶基因TaAlaAT1的克隆及表达特征分析

 在已构建的受条锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)诱导的小麦非亲和抑制差减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)文库中,筛选到1个与水稻丙氨酸氨基转移酶基因高度相似的表达序列标签(expressed sequence tag,EST),利用电子克隆与RT-PCR相结合的方法,从小麦中获得1个1563bp的cDNA序列,命名为TaAlaAT1。序列分析表明,TaAlaAT1包含1个完整的开放阅读框,长1440bp,推测编码479个氨基酸。该氨基酸序列具有氨基转移酶的保守特征,与水稻、葡萄、大豆、拟南芥、苜蓿等多种植物的丙氨酸氨基转移酶高度相似,其中与水稻的亲缘关系最近。半定量RT-PCR与实时定量PCR结果显示,TaAlaAT1在小麦与条锈菌互作的非亲和组合中总体呈上调表达,在亲和组合中呈下调表达,且在2个组合中的表达差异显著。推测TaAlaAT1参与了小麦对条锈菌的防御反应。     

小麦白粉菌HSP70基因的克隆及高温胁迫对其表达的影响

小麦白粉病是由专性寄生菌Blumeria graminisf.sp.tritici引起的一种重要的气传真菌病害,该病曾于1990-1991年两年在我国发生大流行,近年来其发生面积也一直维持在500万公顷以上,给我国小麦生产造成了严重的损失.已有的研究结果表明,温度不但影响小麦白粉病的发生和流行,而且温度胁迫作用还会对白粉病菌群体产生影响,从而使病菌群体对温度的敏感性降低.目前已发现在我国白粉病菌群体中存在抗高温或耐高温的菌株,而且这些菌株在较高的温度下其寄生适合度要高于对温度高敏感性的菌株[1].由于病菌群体对温度敏感性的变化有可能影响病害越夏和越冬的范围,进而影响病害的发生和流行程度,因此,有必要对其耐高温的分子机制进行研究,这对于了解小麦白粉菌对温度的适应性以及气候变暖对此病害发生和流行的长期影响具有重要的意义.     

小麦白粉菌有性时期闭囊壳在侵染循环中作用的初步研究

通过对陕西省和河南省小麦白粉病越夏期间场院麦秸垛中闭囊壳发育、存活情况及场院附近自生麦苗发病情况的调查,结果发现闭囊壳保湿培养7~8 d后,子囊孢子形成达到高峰;自生麦苗发病率与闭囊壳存活率之间存在极显著的正相关性,且闭囊壳存活率与海拔高度之间存在显著的负相关性,采自海拔500~900 m的闭囊壳有较高的存活率,海拔超过1 000 m的存活率较低或为零。此结果说明小麦白粉菌有性时期闭囊壳可能是通过侵染自生麦苗在侵染循环中起作用。     

2009年我国部分麦区小麦白粉病菌群体对温度的敏感性研究

 用小麦离体叶段法,设置22、23、24、25和26℃共5个温度处理,对2009年采自四川、北京、甘肃、河南、河北、陕西和湖北七省（市）的小麦白粉菌标样分离获得的129个单孢堆菌株对温度的敏感性进行了测定。结果表明,供试的129个菌株平均ET₅₀为22.49℃,其中ET₅₀最高为24.48℃,最低为19.88℃,供试菌株中40.52%的ET₅₀介于23℃和24℃之间,占参试菌株的近一半,7.63%的供试菌株ET₅₀≥24℃。不同省（市）的病菌群体对温度的敏感性存在一定差异,且病菌群体对温度的敏感性差异与经纬度存在显著或极显著的负相关关系。研究结果获得了温度对此病害的终止阈值平均为26.65℃,且对温度相对不敏感菌株在较高温度下的潜育期较短、病害的严重度较高。不同敏感性菌株的频率分布结果表明,自然环境中病菌群体已受到温度的选择压力。     

小麦白粉病菌对氟唑菌酰羟胺的敏感基线建立

氟唑菌酰羟胺是一种新型琥珀酸脱氢酶抑制剂(succinate dehydrogenase inhibitor, SDHI)类杀菌剂,2019年在我国登记在小麦上防治赤霉病,为明确其对小麦白粉病的潜在防治效果,以及为监测小麦白粉病菌群体对其是否产生抗药性,本文采用离体叶段法测定了2000年前和2019年采自我国河南、山东等9省市的110株小麦白粉病菌菌株对氟唑菌酰羟胺的敏感性。结果表明,采自2019年的88株菌株,其EC50范围为0.010 2~0.766 8 μg/mL,平均EC50为(0.224 3±0.179 6)μg/mL;采自2000年前的22株菌株,其EC50范围为0.052 1~0.882 4 μg/mL,平均EC50为(0.356 3±0.279 6)μg/mL;两组菌株群体间的敏感性无显著差异。氟唑菌酰羟胺对110株菌株的EC50范围为0.010 2~0.882 4 μg/mL,平均EC50为(0.250 7±0.210 3)μg/mL,敏感性频率分布呈单峰曲线,可作为小麦白粉病菌对氟唑菌酰羟胺的敏感基线。本研究结果可为氟唑菌酰羟胺防治小麦白粉病以及未来监测该病原菌对药剂的抗性提供参考依据。     

小麦白粉病菌对甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂敏感性及其交互抗性

 20世纪70年代后期以来,小麦白粉病在我国小麦产区上升为主要病害,严重制约小麦生产。沿海北部及淮北地区,小麦白粉病常年发生4级左右。目前麦类白粉病的防治药剂主要有三唑类、嘧啶类、苯并咪唑类、甲氧基丙烯酸酯类及硫代氨基甲酸盐类等。但小麦白粉病菌变异快,繁殖迅速,以及药剂长期单一使用,造成小麦白粉病菌易产生抗药性。1995年我国小麦白粉菌对三唑酮的平均抗性水平在16.8倍以上。因而,急需寻找和开发替代三唑酮防治小麦白粉病的新型药剂。甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂继三唑类杀菌剂后出现, 是一类内吸保护型杀菌剂,主要作用于真菌的线粒体呼吸链中细胞色素bc1复合物,阻止电子传递,抑制真菌生长。此类药剂于1996年投入德国市场,尚未在我国小麦白粉病防治上大量使用。     

2008年我国部分麦区小麦白粉病菌群体对温度的敏感性

 The sensitivity of 113 isolates of wheat powdery mildew (Blumeria graminis f. sp. tritici) sampled from 6 provinces or cities in 2008 to temperature was tested by detached leaf segment method with setting up 5 different temperatures indoor. The results showed the mean ET₅₀ (which represents the temperature that is required to obtain 50% of the maximum effect) of all isolates tested was 23.02℃. ET₅₀ values of 17.70% isolates were more than 24℃. The highest and the lowest ET₅₀ of isolates were 25.22℃ and 19.42℃, respectively. There were a certain differences for isolates sensitivity to temperature among different provinces or cites. It was also found that when temperature increased during 22-26℃, the latent period of isolates prolonged, and the latent period of different isolates was different at the same temperature, too. These results will provide a reference for the oversummering division of wheat powdery mildew, as well as the effect of climate to the disease.     

2007年我国部分麦区小麦白粉菌对三唑酮的抗药性监测

采用拌种离体叶段法测定了我国9个省（市）的112个小麦白粉菌株对三唑酮的抗性。结果表明,供试菌株的平均EC50为57.25mg/L,平均抗性水平为27.39倍,其中86.61%供试菌株已经产生抗性,抗药性比敏感菌株高出10~40倍的菌株占47.32%,四川、山东、甘肃和贵州等地菌株的抗性高于其他地区。此结果可为三唑类杀菌剂在我国的推广应用和制定合理的抗药性治理措施提供依据。     

湖北麦区小麦白粉病菌毒性结构分析

对湖北省不同年度（2001、2003年和 2007年）、同一年度（2007年）不同生态区间的小麦白粉病菌毒性基因频率进行了比较。结果表明,毒性基因 V2、V4b、V13、V20、V21、V2+MLD、V2+6、V4+8和V4b+Mli在测定的 3个年度中毒性频率均低于25%,而V1、V3b、V3c、V3d、V3e、V5、V8、V17和V193个年度的毒性频率均高于50%;白粉病菌毒性结构年度之间和生态区之间均基本相似,但个别毒性基因年度及生态区间存在一定的差异; V2、V3a、V3b、V3c、V3e、V5、V6、V7、V8和V20在十堰以及武昌 2 个生态区毒性频率年度间均有明显的上升趋势,而V4b、V5（MLi）、V13、V21、V5+6则表现为下降的趋势;2007年仅在十堰生态区检测到V2+Mld和V2+6菌株。