猪瘟病毒和猪细小病毒检测基因芯片的构建

本试验克隆猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)和猪细小病毒(Porcine parvovirus,PV)各自病毒基因保守序列,提取质粒中的模板、扩增纯化作为探针,应用微量点样技术将探针固定在硝酸纤维素膜上,制备诊断基因芯片;同时对制备的基因芯片进行有效性监控和特异性、重复性的质量控制;然后提取样品核酸,PCR扩增并用生物素标记,并将所获得的扩增产物与诊断基因芯片进行特异性的逆向点杂交,最后通过芯片扫描来实现对病原的高效检测和分析判断。试验结果表明病料中抽提的核酸与芯片杂交的信号为阳性且较明显,说明制备的猪瘟病毒和猪细小病毒检测基因芯片有效性监控正常且两种病原的特异性和重复性均良好。     

伪狂犬病病毒、猪细小病毒和流行性乙型脑炎病毒检测基因芯片的制备

对伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）和流行性乙型脑炎病毒（JEV）检测基因芯片的制备及该芯片的检测技术进行了研究。选定靶基因最佳点样质量浓度为200 mg/L,用基因芯片点样仪将其点制在氨基化基片上,经干燥、水合、紫外线交联和洗涤后,成功制备了PRV-PPV-JEV检测基因芯片。以CY3荧光素标记的dCTP经PCR扩增制备探针,对芯片的质量进行了评价。结果表明,制备的芯片质量好,探针最佳使用质量浓度为3 000μg/L,芯片系统检测灵敏度可达3μg/L。该芯片可同时检测PRV、PPV和JEV,其灵敏度高、特异性强,芯片可重复使用,室温下至少可保存4个月。     

猪传染性胃肠炎病毒检测基因芯片的构建

采用PCR扩增制备TGEV的靶基因并进行纯化,对基因芯片的最佳靶基因点样质量浓度、探针质量浓度、杂交温度、杂交时间进行筛选,选择构建检测芯片的最适靶基因,进行基因芯片探针最佳标记方法试验.结果表明,质粒PCR扩增和采用异丙醇沉淀纯化的靶基因质量好,基因芯片最佳靶基因点样质量浓度为200mg/L,最佳探针质量浓度为3 000 μg/L,预杂交时间为1 h,杂交时间为3～6 h,杂交温度为48℃,以S、S3、sM、M、N、ORF7、POL等7个靶基因为构建TGEV检测芯片的最适靶基因,确定了多重PCR扩增标记TGEV探钟的最佳体系,Cy3-dCTP标记浓度为2.5 μmol/L,构建的TGEV检测芯片与标记的混合探针杂交效果好.     

猪细小病毒检测技术研究进展

近年来,随着猪细小病毒分子生物学的研究进一步深入,各种新型疫苗的成功研制,为猪细小病毒病的防制带来希望。但目前为止猪细小病毒的检测技术以传统方法为主,大量研究发现猪细小病毒常与其他病原微生物混合感染,为了根除本病,必须提高诊断和防疫水平。文章就该病诊断方法的研究进展做一综述。     

猪细小病毒感染

1987年以来,在我国一些大中城市先后陆续建成一批现代化或集体养猪场,养猪业得到一定发展,随之而来的某些疫病也有发生,其中猪的细小病毒感染,引起母猪繁殖障碍,造成相当大的损失。为了促进养猪生     

猪细小病毒单克隆抗体的研制及应用研究

用猪细小病毒免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠，融合其脾细胞和ＳＰ２／Ｏ骨髓瘤细胞，筛选出５株分泌抗猪细小病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞系，用交叉ＨＩ法对２株ＭｃＡｂ作特异性分析，该ＭｃＡｂ只特异地与ＰＰＶ发生反应，而不与日本乙型脑炎，犬细病毒发生反应，用以建立检测猪小病毒本的ＥＬＺＳＡ，与ＨＩ比较，其敏感性及特异性无很高。     

猪细小病毒检测方法的研究进展

猪细小病毒（PPV）是以引起胚胎和胎儿感染及死亡而母体本身不显症状的一种猪繁殖障碍性传染病。临床主要表现为胎儿感染死亡，产出死胎、畸形胎、木乃伊胎及不孕等症状，还可致皮炎和腹泻。PPV与2型圆环病毒（Porcine circovirus type2，PCV2）协同感染是导致断奶仔猪多系统衰竭综合症（Porcine postweaing mulisystemic wasting syndrome，PMWS）的主要原因之一。     

PCR一步法检测猪RYR1基因

在传统的PCR加酶切检测猪的RYR1基因基础上，设计能特异地扩增突变和正常序列的4条引物，根据扩增片段大小和条带多少可直接鉴别不同的RYR1基因型，从而建立了简单、廉价、准确地PCR一步检测猪应激综合征的新方法。     

非洲马瘟病毒、西尼罗病毒和马冠状病毒的基因芯片检测技术研究

为探索建立马病病毒基因芯片检测方法,采用人工拼接的方式拼接了非洲马瘟病毒(ASHV)核酸序列,通过分子克隆技术获得西尼罗病毒(WNV)和马冠状病毒(ECV)的特异基因片段。用芯片点样仪逐点分配到处理过的玻片上,制备成检测芯片。以拼接、克隆的核酸序列为模板通过多重不对称RT-PCR进行特异性扩增和荧光标记后滴加到芯片上进行杂交,对杂交结果进行扫描检测和计算机软件分析。结果显示,制备的基因芯片可同时检测和鉴别上述3种病毒,ECV质粒样品、WNV质粒样品检测灵敏度为10²拷贝;AHSV质粒样品检测灵敏度为10⁴拷贝。其他病毒材料未出现荧光信号,验证了本方法的特异性。证明基因芯片技术可快速、准确和灵敏地同时进行多种病毒的检测。     

猪细小病毒研究进展

猪细小病毒 (PPV)是引起母猪繁殖障碍的主要病原体之一。 PPV最早是从培养细胞中发现并分离得到的一种小 DNA病毒。PPV按照其致病性与组织嗜性大致可以分为 4个类型。研究表明 ,PPV不仅是引起母猪繁殖障碍的主要病原体之一 ,而且能够引起多种猪病。PPV基因组为单股负链 DNA,大小约为 50 0 0 bp,基因组有两个主要的开放阅读框架 ,基因组共编码 3种结构蛋白和两种非结构蛋白 ,即 VP1、VP2、VP3和 NS1、NS2。VP2蛋白是主要的免疫原性蛋白 ,可以诱导机体产生强烈的免疫反应 ,NS1蛋白是 PPV基因组本身编码的反式激活蛋白 ,对PPV早期和晚期的转录发挥着重要作用 ,另外有研究表明 ,NS1蛋白是具有多种功能的锚定蛋白 ,在 PPV体外感染过程中具有重要功能。随着对猪细小病毒研究的不断深入 ,目前已经在猪细小病毒病原学、诊断与防制以及分子生物学方面取得了进展。     

猪SP-A基因荧光定量PCR检测方法的建立

SP-A(surfactant protein-A)mRNA的表达对肺的发育、成熟均起关键作用,并且与肺部疾病的发生相关。为了建立荧光定量PCR技术检测猪SP-A表达量的方法,根据猪SP-A基因的mRNA序列(EU622632)设计引物,从纯化模板、PCR程序设计等方面进行了优化,建立了基于SYBR Green I染料技术的Power SYBR(Green荧光定量PCR方法。结果表明,所建立的Power SYBR(Green荧光定量PCR方法检测猪SP-A基因具有特异性好、简便、可靠等特点,为猪SP-A基因定量分析奠定了基础。     

猪细小病毒2型、3型、6型多重PCR检测方法的建立及初步应用

为建立同时快速检测猪细小病毒2型(PPV2)、猪细小病毒3型(PPV3)、猪细小病毒6型(PPV6)的方法,本研究根据PPV2、PPV3、PPV6各自的NS基因序列设计3对特异性引物,建立了一种能同时检测上述病原的多重PCR方法。结果显示,建立的多重PCR方法对PPV2、PPV3、PPV6的基因组DNA均能有效扩增,对猪圆环病毒2型(PCV2)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、副猪嗜血杆菌(HPS)、猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)、日本乙型脑炎病毒(JEV)的核酸均无特异性扩增,特异性较强;对PPV2、PPV3、PPV6的重组质粒最低检测限分别为4.32×10^3拷贝/μL、9.62×10^3拷贝/μL、4.25×10^3拷贝/μL,与其他研究者已建立的单一PCR检测结果一致,敏感性较高。利用本研究建立的多重PCR方法对25份可疑临床样品检测,同时利用文献报道的单一PCR方法检测,二者结果一致。本研究建立的多重PCR方法为检测PPV,及该病的流行病学调查提供了技术支持。     

猪抵抗素（resistin）ELISA检测方法的建立

用纯化的可溶性重组resistin蛋白免疫健康家兔，制备抗血清，优化ELISA各反应条件（如工作浓度、温育时间、特异性试验），初步建立了检测猪resistin蛋白的间接ELISA方法。结果表明抗原、抗体最佳工作浓度为1∶200和1∶400，resistin最低检出限量为193.75 ng/ml；抗原和一抗、一抗和二抗的最适温育时间均为60 min。本试验建立的ELISA方法，具有灵敏度较高，特异性较好的特点，可作为猪组织和血清中resistin蛋白的检测方法。     

检测猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒的二重PCR方法的建立

作者建立了一种同时检测猪细小病毒(PPV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)的二重PCR方法。根据GenBank上发表的PPV和PRV基因序列,针对各自保守区各设1对特异性引物,用这2对引物对同一样品中的PPV和PRV进行检测,结果同时扩增出942 bp(PPV)和485 bp(PRV)2条特异性片段。特异性试验表明,对其他几种病原的PCR扩增结果均为阴性。敏感性试验结果表明,该二重PCR能检出PPV 和PRV最低浓度分别为22、11.7 pg/L。该方法的建立对临床上进行这2种疾病的鉴别诊断和混合感染的检测都具有重要意义。     

猪细小病毒感染诊断方法研究进展

猪细小病毒感染是由猪细小病毒引起的一种病毒性传染病。其疾病的传播是由易感母猪通过胎盘传染给胎儿 ,导致母猪流产 ,产出死胎、木乃伊胎或弱子 ,给养猪业造成巨大的经济损失。为了减少该病的发生 ,广大兽医工作者建立了许多用于检测和诊断该病的方法 ,如病毒分离培养、对流免疫电泳试验、血清中和试验、酶联免疫吸附试验、银加强胶体金技术及聚合酶链反应等。文章对其研究进展作了较全面地综述