中国北方番茄细菌性溃疡病菌的rep-PCR基因指纹图谱分析

对来自全国若干省市的番茄细菌性溃疡病菌(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis)的33个菌株进行rep-PCR分析。结果表明,用引物BOX分别扩增出6～15条多态性条带,条带大多数集中在500～2800bp之间;用引物ERIC扩增的条带不清晰,可能是反应条件不适合,也可能是其不适合对番茄细菌性溃疡病菌进行多态性分析;BOX-PCR表明番茄细菌性溃疡病菌菌株具有丰富的遗传多态性和较大的遗传变异,对产生的指纹图谱进行分析:在遗传距离为0.18时,测试的33个菌株可划分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ等7个遗传相似组群,其中Ⅵ组群包含的菌株最多。研究还表明番茄细菌性溃疡病菌的遗传分群与菌株的地理来源关系密切,但与该病的发病年份上没有必然联系,这也从另一侧面说明了该病害是土壤带菌引起的。     

番茄细菌性溃疡病菌的实时荧光PCR检测

 由Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis(Cmm)引起的番茄细菌性溃疡病是一种严重危害番茄生产的种传细菌性病害。根据ITS序列多态性设计引物及TaqMan探针进行实时荧光PCR检测的结果表明,这组引物一探针能检测出所有供试的Cmm菌,对照菌均未检测到荧光信号。用接种但未显示症状的番茄苗叶片及人工处理的带菌种子提取的核酸作为模板,均能检测到病菌,其检测灵敏度比常规PCR高约100倍。实验中不需病原菌的分离培养及PCR的后续处理。该方法快速、简便、安全、准确,适用于出入境检验检疫及种子、种苗健康检测领域。     

中国4省猕猴桃细菌性溃疡病菌的生物型检测和遗传多样性分析

由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa)侵染引起的猕猴桃细菌性溃疡病(kiwifruit bacterial canker)是全球猕猴桃生产上最具毁灭性的细菌病害。为探明福建、安徽、四川和陕西4省Psa菌株的生物型和遗传多样性,用5对PCR特异性引物PsaJ-F/-R、PsaK-F/-R、Tac-F/-R、Con002-F/-R和avrRps4-F1/-R2检测Psa菌株的生物型;用4对PCR引物27F/1492R、PsaF1/PsaR2、gapA-Fps/Rps和rpoD+364s/-1222ps分别扩增16S rRNA、ITS、gapA和rpoD基因,进行多基因联合分析Psa菌株的遗传多样性。结果表明,特异性引物Tac-F/-R从47株Psa菌株中均能扩增出一条545 bp的特异条带,其他4对引物未扩增出任何条带,说明供试Psa菌株的生物型均为biovar 3。多基因联合分析表明,4省Psa存在丰富的遗传多样性,4个群体共检测出27个单倍型,单倍型多样性为0.955。安徽、福建、四川和陕西群体的单倍型数差异较大,分别为1、8、12个和12个。4个群体的多态性位点数、核苷酸多样性和平均核苷酸差异数差异极显著(P<0.01),其中福建群体的多态性最丰富,而安徽群体的多态性最低。AMOVA分析表明,3.6%的遗传变异来源于种群间,而96.4%的遗传变异来源于种群内,说明种群内变异是遗传变异的主要来源。遗传分化分析表明,安徽省Psa群体与其他3个群体间的遗传分化极高(Fst>0.175),福建、四川和陕西群体间的遗传分化水平较低(Fst<0.017)。研究结果有利于了解福建省Psa的来源,为阻断Psa的传播和猕猴桃细菌性溃疡病的长期可持续控制提供了理论参考。     

水稻白叶枯病菌双组分调控系统应答调节子基因gacAxoo的功能鉴定

为了阐明水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae,Xoo)双组分系统(TCS)的调控作用,本研究通过基因克隆、序列分析、缺失突变和互补、表型测定,对TCS应答调节子基因gacAxoo的功能进行了鉴定。克隆的gacAxoo基因编码蛋白GacAxoo与其它病原黄单胞菌的同源序列高度保守。GacAxoo是LuxR蛋白家族成员之一,具有磷酸受体结构域(REC)和DNA结合保守结构域(HTH)。用基因标记交换法,构建了△gacAxoo基因缺失突变体。与PXO99A相比,△gac-Axoo的致病性、致敏性、胞外降解酶类活性和嗜铁素产生能力无显著变化,但运动性明显减弱,基因互补可以使之恢复。因此,gacAxoo基因可能参与了Xoo运动性的调控。     

十字花科黑腐病菌应急反应相关基因spoT_(Xcc)对T3SS基因调控作用的分析

通过反向遗传学方法和半定量RT-PCR方法,研究了十字花科黑腐病菌中被注释的应急反应相关基因spoT_(Xcc)与Ⅲ型分泌系统(T3SS)基因的调控关系。基于自杀质粒pK18mob同源整合方法构建了十字花科黑腐病菌spoT_(Xcc)基因(XC_0956)的非极性整合突变体,检测了突变体的多种表型,发现spoT_(Xcc)突变体延迟了在非寄主植物辣椒ECW-10R上引发的过敏反应(HR)。利用GUS(β-葡糖苷酸酶)活性检测、原位组织染色和半定量RT-PCR的方法,发现T3SS相关基因在spoT_(Xcc)基因的非极性整合突变体中表达量降低,表明十字花科黑腐病菌中被注释的应急反应相关基因spoT_(Xcc)显著正调控T3SS相关基因的表达。     

薰衣草基因转化直接分化受体系统的建立

以法国孟士德薰衣草(Lavandula angustifolia cv. Munstead)的下胚轴和子叶为研究材料,通过高频再生系统的建立和抗生素敏感性实验,建立了薰衣草基因转化的直接分化受体系统.结果表明:下胚轴的不定芽分化能力比子叶更强,在IAA 0.1 mg·L-1 6-BA 1.0 mg·L-1条件下,10 d苗龄的下胚轴的出愈率和不定芽分化率分别为96.7%和36.7%;所得组培苗在1/2 MS基本培养基上生根率可达95%以上;确定了下胚轴适宜的抗生素筛选浓度,潮霉素的筛选浓度为10 mg·L-1,头孢霉素浓度为200 mg·L-1时即可有效抑制农杆菌的生长,同时又不会对薰衣草不定芽分化产生明显的伤害作用.     

H2O2对水稻白叶枯病菌过氧化氢酶相关基因crg表达的诱导作用

 为了阐明H₂O₂对水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae,Xoo)过氧化氢酶(CAT)相关基因(crg)表达的诱导作用,本研究定量分析了在水稻细胞-Xoo互作体系及其加入H₂O₂清除剂CAT后H₂O₂产量和crg表达;外源添加H₂O₂后的病菌生长和crg表达。结果表明:在互作条件下,H₂O₂含量稳定增加,10 h可达到峰值;在互作6 h时crg显著地被诱导表达;加入CAT显著地降低了H₂O₂含量和crg表达;在外源H₂O₂胁迫条件下,H₂O₂以浓度效应的方式影响病菌增殖,显著地诱导了catB和srpA表达。因此,Xoo-水稻互作导致了H₂O₂的发生。无论是互作产生的还是外源的H₂O₂均显著地诱导了Xoocrg表达,从而活化了H₂O₂降解途径。     

欧美杨细菌性溃疡病菌双组分系统lqp0812-lqp0813基因功能研究

  Lonsdalea quercina subsp. populi引起的欧美杨溃疡病是严重威胁欧美杨人工林生产的细菌性病害。双组分系统是细菌最重要的信号转导通路之一,在细菌的生长繁殖、环境适应、胁迫耐受性以及致病过程中发挥重要作用。为探索L. quercina 中双组分系统编码基因的功能,本研究利用同源重组对双组分系统编码基因lqp0812和lqp0813进行缺失突变,并研究其生物学功能。表型分析显示,与野生型菌株N-5-1相比,Δlqp0812和Δlqp0813突变体在生长速率、金属离子胁迫、盐胁迫、渗透胁迫及致病性方面没有显著差异;但Δlqp0812突变体在游动性上与野生型N-5-1相比显著减弱;Δlqp0812和Δlqp0813突变体生物被膜的形成能力,对过氧化氢、抗生素的耐受性都显著增强。qRT-PCR结果显示,在Δlqp0812和Δlqp0813突变体中,外排泵基因acrA、mdtB、aaeB的表达量与野生型相比显著升高。研究结果表明,lqp0812参与病原菌的游动性,lqp0812与lqp0813共同负调控菌株生物膜的形成和对氧化胁迫、抗生素胁迫的耐受性。     

柑橘溃疡病菌gpd1基因在致病性中的功能分析

 甘油作为微生物重要的能量来源及抗逆因子,对其生存具有重要作用。gpd1基因编码甘油-3-磷酸脱氢酶(glycerol-3-phosphate dehydrogenase, G3PDH),是甘油合成代谢途径中关键的限速酶。本研究分析了gpd1基因在柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp. citri, Xcc)致病性中的功能。对Xcc强毒菌株Xcc021和弱毒菌株Xcc049E分别进行了gpd1的缺失突变,发现gpd1缺失仅影响强毒菌株Xcc021在感病柑橘寄主上的毒性以及gpd1缺失影响Xcc在营养贫乏培养基中的生长能力,功能互补子能够恢复毒性和生长能力至野生型水平。其他毒性相关表型显示:与野生型Xcc021相比,gpd1突变体菌体的沉降能力增加,游动性降低,生物膜形成能力增强,功能互补子能够恢复这些表型至野生型水平。这表明gpd1基因在强毒菌株中是重要的毒性因子,其涉及的甘油代谢途径可能在强弱毒菌株对于寄主柑橘的毒性具有不同的作用。     

柑橘溃疡病菌gpd1基因在致病性中的功能分析

 甘油作为微生物重要的能量来源及抗逆因子,对其生存具有重要作用。gpd1基因编码甘油-3-磷酸脱氢酶(glycerol-3-phosphate dehydrogenase, G3PDH),是甘油合成代谢途径中关键的限速酶。本研究分析了gpd1基因在柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp. citri, Xcc)致病性中的功能。对Xcc强毒菌株Xcc021和弱毒菌株Xcc049E分别进行了gpd1的缺失突变,发现gpd1缺失仅影响强毒菌株Xcc021在感病柑橘寄主上的毒性以及gpd1缺失影响Xcc在营养贫乏培养基中的生长能力,功能互补子能够恢复毒性和生长能力至野生型水平。其他毒性相关表型显示:与野生型Xcc021相比,gpd1突变体菌体的沉降能力增加,游动性降低,生物膜形成能力增强,功能互补子能够恢复这些表型至野生型水平。这表明gpd1基因在强毒菌株中是重要的毒性因子,其涉及的甘油代谢途径可能在强弱毒菌株对于寄主柑橘的毒性具有不同的作用。     

胶孢炭疽菌致病相关基因Plv2功能分析

胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起的橡胶树炭疽病是橡胶树三大叶部病害之一,严重威胁着橡胶树的生长。本研究从构建的胶孢炭疽菌RC178 T-DNA突变体库中筛选获得一株致病力明显减弱的突变菌株T1103,其T-DNA为单拷贝。采用TAIL-PCR克隆了该突变体T-DNA插入位点的侧翼序列,通过比对胶孢炭疽菌全基因组序列,发现该TDNA插入位点所在的序列包含一个5 400 bp的基因,将其命名为Plv2。Plv2基因包含3个外显子,编码一个假定的甾醇C-24甲基转移酶。敲除野生型菌株RC178中的Plv2,发现敲除突变体与T1103的致病力表现基本一致,由此推测Plv2基因为致病相关基因。     

禾谷镰刀菌中磷脂酰肌醇转运蛋白功能分析

磷脂酰肌醇转运蛋白(phosphatidylinositol transfer protein,PITP)保守存在于真核生物中,负责膜系统中磷脂酰肌醇和磷脂酰胆碱的转运,参与胞内的脂类信号调控过程。由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)引起的小麦赤霉病严重威胁粮食产量和食品安全,而在禾谷镰刀菌的研究中发现磷脂信号网络中的关键元件参与病原菌致病过程的调控。我们利用基因敲除的方法对禾谷镰刀菌中PITP家族的功能进行分析,在禾谷镰刀菌中鉴定了7个PITP蛋白的编码基因,并成功获得了其单敲除突变体。通过表型分析发现,这7个基因的单敲除突变体在营养生长、无性及有性生殖和致病性方面与野生型菌株并无明显差异。研究结果表明:1)禾谷镰刀菌中的PITP基因并不是看家基因;2)不同PITP基因之间可能存在功能冗余;3)丝状真菌中PITP的生理功能与酵母中的PITP存在显著差异。     

水稻条斑病菌hrpD5基因在致病性中的功能分析

水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)成功侵染水稻主要依靠其III型分泌系统(Type III secretion system,T3SS)分泌的效应蛋白。T3SS由hrp-hrc-hpa基因编码,其中主要的hrp和hrc基因突变,病原菌将丧失在寄主水稻上的致病性和非寄主烟草上的过敏性反应(hypersensitive response,HR)。hrpD5基因位于hrp基因簇hrpD操纵单元的第5个基因,在致病性中的功能未知。本研究构建了Xoc的hrpD5缺失突变体RΔhrpD5。植物接种试验显示,RΔhrpD5丧失了对寄主水稻的致病性和在非寄主烟草上激发HR反应的能力;功能互补子虽然能够恢复这2种表型,但是,与野生型菌株相比,其在感病水稻上的毒性显著降低,在非寄主烟草上形成延迟的HR反应;荧光定量PCR结果显示:hrpD5缺失影响其下游hrpD操纵单元基因hrpD6、hrpE和hpaB以及HrpX操纵单元基因hrpF和hrpB1的表达;同时,hrpD5缺失降低了hrpX的mRNA水平,但是不影响hrpX的启动子活性;酵母双杂交结果显示,HrpD5蛋白能够与HrpF蛋白的N端互作。这些结果暗示在Xoc中hrpD5不仅为主要的致病相关基因,而且调控主要的hrp调节基因hrpX的表达。HrpD5新功能的鉴定将为解析T3SS在致病性中的功能提供线索。     

利用香蕉水培系统测定枯萎病病原菌致病力

 为建立一种评价香蕉枯萎病病原菌(Fusarium oxysporum f.sp. cubense)菌株间致病力差异的体系,在改进的香蕉水培系统基础上,对影响香蕉枯萎病菌致病力的接种菌液浓度、类型及处理方式等因素开展分析,同时与不同菌株盆栽测定结果进行比较以验证该方法的可靠性。结果表明:在香蕉水培系统下,将摇培5 d的菌液稀释10倍以上,使孢子初始浓度为1×10⁶ cfu·mL^-1,直接加入该菌液50 mL即可用于致病力评价,且不同菌株用该测定方法与盆栽测定的致病力结果基本一致。该方法的建立为香蕉枯萎病菌致病力的评价提供了快速简便的方法,也为下一步解析尖孢镰刀菌致病相关基因功能和致病机理及抗病品种的选育奠定了基础。     

核盘菌自噬相关基因SsATG5和SsATG8的功能分析

为探究自噬在核盘菌Sclerotinia sclerotiorum致病过程中的作用,利用酵母Saccharomyces自噬相关基因（autophagy-related gene,ATG）编码的蛋白序列比对核盘菌基因组,获得核盘菌假定ATG,并以核盘菌1980菌株为出发菌株,基于同源重组的原理对假定ATG进行敲除和回补,并测定不同突变体的生长表型和致病能力。结果表明,从核盘菌基因组中比对到2个ATG,分别命名为SsATG5和SsATG8,两者在核盘菌致病过程中均上调表达。SsATG5和SsATG8敲除突变体在菌丝生长、产草酸和侵染垫形成方面与野生型菌株无明显差异,但SsATG5敲除突变体在离体拟南芥Arabidopsis thaliana叶片上的致病力显著下降了约40%,在活体拟南芥植株上的致病力显著下降了约80%,同时SsATG5回补突变体恢复了正常的致病力。表明SsATG5参与了核盘菌的致病过程,证实自噬在核盘菌致病过程中发挥着重要作用。     

磷酸甘油转移酶基因在水稻白叶枯病菌致病力中的作用研究

稻黄单胞菌稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)引起的水稻白叶枯病,是水稻上的重要致灾病害之一。前期基因组学分析发现,Xoo菌株PXO99^A的PXO＿04062基因可能编码一个磷酸甘油转移酶,推测与病原菌的致病力有关。本研究采用自杀质粒pK18mobsacB介导的方法,构建了该基因的缺失突变体,并对突变体进行了反式互补。水稻上致病性测定发现,与野生型菌株相比,PXO＿04062基因的缺失突变体DM04062在寄主水稻日本晴上的致病力显著下降,并且其胞外多糖产量、运动性、生物膜形成等均明显降低。进一步采用RNA-seq方法比较突变体转录组的变化,发现突变体中的差异表达基因共有533个,其中包括多个致病相关基因,如胞外多糖合成和细胞运动性等相关基因。与野生型相比,这些基因在突变体中的表达均显著下调。这些结果说明,白叶枯病菌的磷酸甘油转移酶基因是通过影响多种致病力相关因子的合成,来影响病菌在水稻上的致病力。     

苹果炭疽叶枯病菌致病相关基因CgNVF1的功能初步分析

苹果炭疽叶枯病是主要由胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起的一种苹果重要叶部病害,严重威胁着苹果树的生长。本研究从构建的苹果炭疽叶枯病菌T-DNA突变体库中筛选获得一株致病力缺失的突变菌株A3083,采用hiTAIL-PCR方法克隆了该突变体T-DNA插入位点的右翼序列;通过与胶孢炭疽菌基因组序列比对分析,发现T-DNA插入位点位于1个预测的CGGC5_9603基因内,并将该基因命名为CgNVF1。CgNVF1基因全长2252 bp,含有2个内含子,编码709个氨基酸。CgNVF1定位于细胞质,在苹果炭疽叶枯病菌菌丝、分生孢子和附着胞中均有表达。通过构建CgNVF1敲除菌株和CgNVF1互补菌株,并结合表型分析,证实CgNVF1基因在苹果炭疽叶枯病菌附着胞形成及致病中具有重要的作用。