牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿辅助蛋白AP1、BP、AP2三基因的串联表达及其免疫原性研究

为探究无乳链球菌菌毛岛屿3个亚基AP1、AP2、BP融合蛋白的抗原性,本研究根据该3个亚基基因的主要抗原结构域序列设计并合成引物,通过重叠延伸PCR技术获得上述3个亚基的串联核苷酸片段,并插入pET-30a(+)载体,转化至BL21(DE3)感受态细胞后诱导表达,表达蛋白经亲和层析纯化后进行western blot鉴定和小鼠免疫实验。结果表明,AP1-AP2-BP融合抗原具有良好的反应原性和免疫原性。本研究为进一步研究无乳链球菌基于AP1-BP-AP2融合蛋白的致病机制、检测制剂及亚单位疫苗研制提供了实验依据。     

猪细小病毒VP2的原核表达与多克隆抗体制备

克隆猪细小病毒(PPV)VP2基因全长1 740bp,构建其原核表达载体后进行蛋白的表达与纯化,接种家兔制备多克隆抗体。用PCR方法扩增PPV VP2全长基因,扩增产物克隆至表达载体pET-32a并转化至E.coli BL21(DE3)感受态中。分别用不同诱导时间、IPTG浓度、温度诱导表达VP2重组蛋白,经SDS-PAGE电泳切胶回收纯化目的蛋白。对家兔进行3次免疫后,采集血清制备抗体。PCR扩增得到1 740bp的VP2基因片段;构建原核表达载体pET-32a-VP2,经37℃,IPTG浓度1.0mmol/L诱导表达4h可得分子质量大小约为82ku目的蛋白;间接ELISA检测抗体效价可达1∶12 800;Western blot证明所制备的抗体能够有效的应用于PPV VP2抗原的检测。本研究成功构建了表达PPV VP2基因的原核载体,获得了VP2蛋白,制备了兔抗多克隆抗体,为建立检测PPV VP2蛋白ELISA方法奠定了基础。     

鸡毒支原体黏附因子MGC2的克隆及原核表达

为表达鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)黏附基因MGC2蛋白,探索其作为诊断抗原的可能性,参考Gen Bank登录的鸡毒支原体F株MGC2基因序列,利用Primer 5.0软件设计合成引物,通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)对鸡毒支原体MGC2基因的1个位点进行定点突变,将此突变基因克隆到表达载体p ET-30a(+)中,具有正确阅读框架的重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后采用SDS-PAGE和Western blot检测。结果表明,PCR扩增的目的基因大小约为918 bp;SDS-PAGE检测重组蛋白相对分子质量约为39.6 ku;Western blot检测表明重组蛋白具有鸡毒支原体反应原性。该研究结果为鸡毒支原体抗体ELISA检测方法的建立奠定基础。     

禽白血病病毒衣壳蛋白p27基因的原核表达及多克隆抗体的制备

从J亚群禽白血病病毒(ALV-J)HB09JY03株感染的DF-1细胞的冻融裂解液中提取DNA,通过PCR方法扩增出约720bp的gag-p27基因片段,克隆至pMD18-T载体。鉴定正确后,将该片段克隆至pET-30a(+)原核表达载体,经IPTG诱导表达。表达产物经His Trap TMHP纯化后,测蛋白浓度达到9mg/mL。用兔抗自然p27蛋白阳性血清进行Western blot检测,表明重组p27蛋白有抗原反应活性。免疫新西兰大白兔后,产生的抗体与禽白血病全病毒抗原可以发生特异性反应。所制备的重组p27蛋白和多克隆抗体将在ALV的抗原分析、血清学诊断等方面有着重要的应用价值。     

猪瘟病毒E2蛋白抗原表位的表达与免疫活性研究

以猪瘟病毒全长基因组质粒为模板,PCR扩增出E2囊膜糖蛋白上A/D抗原区B细胞表位878aa～938aa;PCR扩增片段连接到pET-32a( )载体构建pET-AD原核表达质粒,将阳性质粒转化到BL21大肠埃希菌中诱导表达,以Ni-NTA亲和柱纯化,纯化后的蛋白进行Western blot鉴定。结果表明,重组质粒pET-AD在BL21大肠埃希菌中可以高效表达,表达的蛋白质经纯化后仍然有反应原性。     

非洲猪瘟病毒VP73结构蛋白表达及鉴定

根据GenBank登录的非洲猪瘟病毒(ASFV) VP73基因序列,人工合成VP73主要抗原表位区基因片段,克隆至pUC57载体中.设计1对引物,PCR扩增获得429 bp的VP73基因片段;将VP73基因片段使用EcoRI和SalI酶切后亚克隆至表达载体pGEX-KG,经PCR、酶切、测序鉴定挑选阳性克隆,转化至表达菌株BL21 (DM3)中,进行体外诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析蛋白表达及其活性.结果显示,成功构建表达重组载体pGEX-KG-VP73,对该重组载体进行诱导,有效表达了41 ku重组蛋白,表达量约占菌体总蛋白的17％,Western blot分析证实该蛋白具有良好反应原性.     

马泰勒虫新疆株EMA2基因的克隆及原核表达

裂殖子表面抗原蛋白家族因其高抗原保守性常作为马泰勒虫ELISA检测方法的基质。本研究根据马泰勒虫EMA2基因序列合成引物,以马泰勒虫新疆株DNA为模板,扩增获得目的基因,将其连接至pEASY-E1载体构建重组质粒pEASY-E-TE,并转化至大肠杆菌BL21中,IPTG诱导表达重组EMA2蛋白并鉴定。结果显示:PCR扩增获得了约819bp特异性DNA片段,构建了pEASY-E-TE重组质粒,成功诱导表达了35kDa的可溶性目的蛋白;经SDS-PAGE、Western blot鉴定,重组蛋白rEMA2具有良好的抗原性。本试验克隆表达的重组蛋白rEMA2可为ELISA方法的建立及后期研究提供靶基因材料。     

新城疫病毒F基因在大肠埃希菌中的表达及其抗原性分析

构建新城疫病毒融合蛋白F基因的原核表达载体,并将其在宿主菌BL21(DE3)感受细胞中表达.以含有融合蛋白F基因的重组质粒pMD19T-F为模板,设计特异性引物,应用PCR技术扩增获得F基因的F1片段,定向插入原核表达载体pET-28a,构建重组质粒pET-F1,将构建成功的重组质粒pET-F1转化宿主菌BL21(DE3)感受态细胞经IPTG诱导,将其在宿主菌细胞中表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blot方法检测.结果显示,成功克隆出了新城疫病毒F1基因片段序列852 bp.构建的pET-F1载体经PCR、双酶切、测序鉴定均无误,转化表达宿主菌后经SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,目的基因被成功表达,并具有良好的反应原性.成功构建了新城疫病毒的融合蛋白F基因原核表达载体,转化宿主细胞后成功表达了融合蛋白F1重组蛋白片段.     

马尔堡病毒糖蛋白RBD基因的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

原核表达并纯化马尔堡病毒(Marburg virus,MARV)糖蛋白(glycoprotein,GP)受体结合域(receptor binding domain,RBD)蛋白,并以此为抗原免疫家兔制备抗MARV-GP-RBD多克隆抗体。参照GenBank提供的MARV GP全基因序列,找到主要抗原表位区域,设计特异性引物,采用PCR方法扩增RBD基因,扩增产物经双酶切(EcoRⅠ/XhoⅠ)后定向克隆至原核表达载体pET-30a(+),构建重组表达质粒pET-30a(+)-GP-RBD,转化BL21(DE3)感受态表达宿主菌,在不同条件下(时间、IPTG浓度、温度)诱导表达目的蛋白,并用His-Band N+柱进行亲和层析纯化;以纯化的重组pET-30a(+)-GP-RBD蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体。通过SDS-PAGE、Western blot和IFA鉴定重组蛋白的反应原性及免疫原性。结果显示:PCR扩增到长度为453bp的RBD基因片段;构建的重组质粒pET-30a(+)-GP-RBD经双酶切后得到与目的片段长度相同的特异性条带,测序结果显示没有突变;转化产物在培养7h、终浓度为0.4mmol/L IPTG和37℃条件下能够充分诱导目的蛋白表达,得到相对分子质量为25 000的重组蛋白,主要以包涵体形式存在,BCA试剂盒产量测定,每升诱导的重组菌可纯化约20mg纯度较高的目的蛋白;Western blot检测证实重组pET-30a(+)-GP-RBD蛋白能同时被抗His标签的单抗和兔源多抗识别并发生特异性反应,证明重组蛋白有良好的反应原性;IFA鉴定证实所制备的兔源多抗能够特异性识别表达MARV GP蛋白的重组杆状病毒rBacmid-GP-VP40,证明重组蛋白具有良好的免疫原性。结果表明:成功表达、纯化了MARV GP RBD蛋白,并完成了兔源多抗的制备,为MARV亚单位疫苗的制备和抗原、抗体检测方法的建立奠定基础。     

家兔Ⅰ型肽载体(PepTⅠ)基因的克隆与原核表达

用real-time PCR方法扩增家兔PepTⅠmRNA序列,通过原核表达体外获得家兔PepTⅠ蛋白,旨在制备多克隆抗体。试验通过RT-PCR方法成功扩增出2 001bp的家兔PepTI基因片段,设计特异性引物成功扩增出抗原表位相对集中的1 071bp大小的片段,构建重组表达质粒,获得融合蛋白。结果显示:家兔PepTⅠ基因片段成功的连接到pMD18-T载体上,重组克隆载体双酶切后回收目的片段分别连接到原核表达载体pET-32a、pET-28a,经转化提取质粒测序验证后表明,成功构建原核表达载体pET-32a-P、pET-28a-P,将重组质粒转化至感受态细胞BL21(DE3)后IPTG诱导,成功表达出PepTⅠ融合蛋白,目的蛋白相对分子质量大小约为44 000,与预期试验结果相符。结果表明:本试验成功扩增出家兔PepTⅠmRNA序列,并且通过原核表达获得家兔PepTI融合蛋白。     

山羊AP1M1基因表达分析与多克隆抗体制备

为深入研究山羊AP1M1(adaptor related protein complex 1 subunit mu 1)在机体生长和繁殖中的作用,采用RT-PCR方法克隆了山羊AP1M1基因,并对其序列和编码蛋白进行分析;构建了pET-30α-AP1M1原核表达载体,免疫实验兔,制备AP1M1基因多克隆抗体;采用qPCR和Western blot检测比较AP1M1在山羊不同组织及睾丸不同发育时期的表达特征。结果显示,山羊AP1M1基因CDS为1 272 bp,编码423个氨基酸,具有1个Clat-adaptor结构域、1个Adap-comp结构域和5个蛋白质-蛋白质结合位点,在哺乳动物中极为保守。间接ELISA和Western blot结果表明,制备的兔抗pET-30α-AP1M1多克隆抗体效价为1∶128 000,可以与重组蛋白特异性结合。表达模式检测结果显示,AP1M1在成年山羊各组织中均有不同程度的表达,其中在肾脏的表达量最高,其次是睾丸,均极显著高于其他组织(P0.01);此外,AP1M1在山羊不同发育时期睾丸组织中均有表达,但在性成熟时显著增加(P0.01),体成熟时达到最高。本试验为进一步探索该基因在山羊睾丸中的功能奠定基础。     

AP1000核电厂氢气控制措施

福岛核事故之后,各国核电监管部门对于核电厂严重事故的预防和缓解措施都提出了更为严格的要求,确保在发生概率极低的严重事故的情况下,也能限制放射性物质向环境的释放。本文以AP1000针对严重事故的氢气控制措施为研究方向,介绍了严重事故情况下氢气的产生位置、反应机理、对安全壳的威胁、氢气点火器和非能动氢气复合器的布置。通过对上述设计和管理措施的介绍,结合其他研究成果,说明了AP1000核电厂对于严重事故情况下的氢气控制是有效的,能够满足国家核安全局的要求,可以确保安全壳的完整性。     

不同染色方法对牛卵泡AP和G-6-P酶染色效果的影响

应用组织化学手段对牛卵巢卵泡中碱性磷酸酶(AP)和葡萄糖—6—磷酸酶(G—6—P酶)进行酶活性反应显示和定位。旨在探讨不同染色方法对酶活性反应显示的影响，以便更好的观察不同发育时期卵泡内酶的定位和酶活性反应的强弱。结果表明：AP检测效果实验Ⅰ组好于实验Ⅱ组和对照组，其卵巢组织结构及卵泡形态非常清晰，切片背景为兰色，酶活性处呈现黑色沉淀，各期卵泡酶的反应显示较好。G—6—P酶检测效果实验Ⅱ组好于实验Ⅰ组和对照组，其卵巢组织结构及卵泡形态比较清晰，切片背景为浅粉色，酶活性反应处呈现棕色沉淀，酶活性反应显示较好。说明不同染色方法对酶活性反应观察效果不同。牛卵巢卵泡不同发育时期、不同的结构部位，酶的活性具有强弱不同的反应性。     

罗酶宝对生长肥育猪饲喂效果的研究

本文研究了通用酶制剂罗酶宝对生长肥育猪饲喂效果的影响。试验选取平均体重为27±0.71kg的健康猪只288头,采用2×2双因子设计。结果表明,罗酶宝可极显著提高27kg-出栏阶段猪饲料转化率(P<0.01),极显著降低腹泻率、发病率(P<0.01),显著提高每头猪平均利润(P<0.05),显著降低每千克增重所需饲料成本(P<0.05)。     

AP1000核电厂事故情况下安全壳的氢气控制

本文介绍了事故后安全壳内氢气产生的原因,以及氢气在安全壳内燃烧引起的危害。分析了AP1000安全壳氢气控制系统的设计特点,以及该系统如何在设计基准事故和严重事故下控制氢气浓度,并与传统二代核电厂的安全壳消氢系统进行对比,分析了AP1000在氢气控制方面的优越性,并对该系统设备的运行提出了建议,可以做为国内新建电厂的设计借鉴。     

通用酶制剂对生长肥育猪日粮养分消化率的影响

本文用4N盐酸不溶灰分内源指示剂法研究了通用酶制剂罗酶宝对生长肥育猪日粮养分消化率的影响。试验选取平均体重为27.47kg的健康猪只288头,公母各半,采用2×2双因子设计,分成4组,每组6个重复。结果表明,罗酶宝可显著提高27kg至出栏阶段猪日粮中营养的消化率及其消化能。