结核分枝杆菌Rv2626c蛋白对RAW264.7细胞凋亡的影响

试验旨在研究结核分枝杆菌Rv2626c蛋白对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞凋亡的影响。根据GenBank数据库中结核分枝杆菌Rv2626c基因序列设计引物,并以结核分枝杆菌国际标准株H37Rv cDNA为模板,PCR扩增Rv2626c基因并克隆至慢病毒表达载体pLEX-EGFP中,包装慢病毒并感染RAW264.7细胞,使用Western blotting和流式细胞仪技术检测Rv2626c蛋白表达水平和RAW264.7细胞凋亡率变化。结果显示,成功构建慢病毒表达载体pLEX-EGFP-Rv2626c;成功包装慢病毒并感染RAW264.7细胞;Rv2626c蛋白在RAW264.7细胞中高水平表达显著促进了细胞凋亡。本试验结果表明,在RAW264.7细胞中过表达结核分枝杆菌Rv2626c蛋白能显著性增加其凋亡水平。     

结核分枝杆菌rv3802c基因双顺反子真核表达质粒的构建及鉴定

为了构建结核分枝杆菌rv3802c基因双顺反子真核表达质粒,本研究利用重叠延伸PCR技术扩增出rv3802c-HisFlag基因片段,将其克隆到真核表达载体pCDNA3.1(+)上,测序验证后,将基因合成的内部核糖体进入位点和增强型红色荧光蛋白基因片段(IRES-DsRed2)定向插入到这个重组质粒上,经酶切鉴定获得双顺反子表达质粒pC3.1-3LHF-Red。将质粒pC3.1-3LHF-Red转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,通过荧光显微镜观察到增强型红色荧光蛋白成功表达;经Western blot分析表明Rv3802c-HisFlag融合蛋白在CHO细胞中获得了表达。结果表明,本研究成功构建了共表达增强型红色荧光蛋白和Rv3802c-HisFlag融合蛋白的双顺反子表达质粒pC3.1-3LHF-Red,为进一步研究结核分枝杆菌Rv3802c蛋白在分枝杆菌感染细胞过程中的作用奠定基础。     

结核分枝杆菌Rv2626c蛋白对RAW264.7细胞凋亡的影响

试验旨在研究结核分枝杆菌Rv2626c蛋白对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞凋亡的影响。根据GenBank数据库中结核分枝杆菌Rv2626c基因序列设计引物,并以结核分枝杆菌国际标准株H37Rv cDNA为模板,PCR扩增Rv2626c基因并克隆至慢病毒表达载体pLEX-EGFP中,包装慢病毒并感染RAW264.7细胞,使用Western blotting和流式细胞仪技术检测Rv2626c蛋白表达水平和RAW264.7细胞凋亡率变化。结果显示,成功构建慢病毒表达载体pLEX-EGFP-Rv2626c;成功包装慢病毒并感染RAW264.7细胞;Rv2626c蛋白在RAW264.7细胞中高水平表达显著促进了细胞凋亡。本试验结果表明,在RAW264.7细胞中过表达结核分枝杆菌Rv2626c蛋白能显著性增加其凋亡水平。     

福氏志贺菌外输调节蛋白基因marA的原核表达载体构建及其鉴定

目的构建志贺菌外输调节蛋白基因marA的原核表达载体并对其表达的蛋白进行鉴定。方法采用PCR从志贺菌基因组DNA中扩增得到志贺菌外输调节蛋白基因marA,并将其定向克隆到原核表达载体pET-30a,构建原核表达重组质粒pET-30a-marA,重组子经限制性内切酶分析、PCR及测序鉴定后,转化宿主菌BL21,IPTG诱导表达,产物进行SDS-PAGE电泳、免疫印迹分析鉴定。结果经鉴定证实原核表达载体pET-30a-marA构建成功,且在大肠杆菌BL21中获得了MarA与His的融合表达,且表达蛋白产物的分子质量大小与预期值一致,并可被特异性抗体所识别。结论MarA在大肠杆菌中获得了高效的表达,为进一步研究其免疫学特性和功能奠定了基础。     

猪链球菌2型分解代谢控制蛋白A的克隆和原核表达

原核表达猪链球菌2型分解代谢控制蛋白A(catabolite control protein A,ccpA)并进行纯化,通过免疫印迹反应初步鉴定重组蛋白的抗原性和特异性。采用PCR方法,扩增ccpA基因序列,克隆至原核表达载体pET-28a中,转入大肠杆菌BL21中进行诱导、表达和亲和层析纯化;经Western blotting初步评价ccpA的抗原性。重组原核表达质粒pET-28a-ccpA经双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约38000,能被相关抗体所识别。因此,能成功在大肠杆菌中表达猪链球菌2型ccpA,为猪链球菌2型相关调节蛋白的免疫学研究奠定基础。     

结核分枝杆菌rv3036c基因的原核表达及其多克隆抗体的制备

为制备结核分枝杆菌(Mtb) rv3036c基因的多克隆抗体,本研究以Mtb强毒株H37Rv基因组DNA为模板,扩增rv3036c基因,克隆至表达载体pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-rv3036c,并转化大肠杆菌BL21(DE3),经1 mmol/L IPTG诱导表达组氨酸标签融合蛋白Rv3036c,采用Ni-NTA His-Bind Resin纯化目的蛋白,经western blot验证纯化蛋白.将Rv3036c蛋白纯化产物免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体.SDS-PAGE和western blot分析结果表明,Rv3036c以可溶形式表达,蛋白分子量大小为28 ku,并且具有良好的免疫原性.以上结果为进一步研究rv3036c基因在Mtb的致病性作用奠定了基础.     

贵州地区羊口疮病毒B2L基因克隆及原核表达载体构建

用H2L基因特异性引物对羊口疮临床疑似病料进行鉴定,采用PCR扩增出阳性样品羊口疮病毒结构蛋白B2L基因,回收纯化PCR产物,克隆至pMD18-T,测序结果表明插入的片段为目的基因,全长1137 bp。将目的基因定向克隆至pET-32a构建了B2L基因原核表达载体pET-32a-B2L,经PCR鉴定、酶切及进一步测序证明表达载体构建成功,为下一步的表达及基因工程疫苗的研究奠定了良好基础。     

结核分支杆菌Mtb8.4真核、原核表达质粒的构建与表达

低分子质量蛋白抗原Mtb8.4是一种非常重要的结核分支杆菌抗原,为了研制结核病核酸疫苗和进行结核病的诊断,分别将其构建到原核和真核载体中进行表达。以结核分支杆菌标准菌株H37Rv基因组DNA为模板,PCR扩增目的基因Mtb8.4,扩增产物酶切后分别克隆到真核表达载体pJW4303和原核表达载体pGEX-4T-1中,构成重组真核表达载体pJW-Mtb8.4和重组原核表达载体pGEX-Mtb8.4,用限制性内切酶消化,PCR扩增及DNA序列分析等多种方法鉴定;并将正确构建的原核表达载体转入E.coliBL21(DE3)plysS中,IPTG诱导表达。结果表明,重组真核表达载体pJW-Mtb8.4和重组原核表达载体pGEX-Mtb8.4构建成功。构建的真核重组质粒pJW-Mtb8.4即可作为结核病DNA疫苗。原核表达载体pGEX-Mtb8.4在BL21(DE3)plysS中成功表达,将表达蛋白进行纯化,作为保护性结核分支杆菌抗原以便检测DNA疫苗的免疫效果。     

小鼠SMC1A基因原核表达系统的构建及其生物信息学探讨

为了探讨SMC1A基因特点及其蛋白的结构和功能,通过PCR扩增SMC1A基因,将其构建至pET-28a(+)原核表达载体上,经PCR鉴定及测序鉴定后,对SMC1A基因的相关生物信息学特性进行初步探讨.结果 显示:克隆获得的小鼠SMC1A基因可编码1233个氨基酸,同源性分析发现,其与大鼠源、恒河猴源和人源的SMC1A基...     

烟台黑猪SLA-2-YTH原核表达载体的构建及表达

为构建烟台黑猪SLA-2-YTH基因原核表达载体,本研究设计引物PCR扩增SLA-2-YTH胞外区,将其克隆至pMD 19-T Simple 载体,筛选阳性克隆。阳性克隆经酶切后,进一步与表达载体pET-28a(+)连接,转化BL21（Rosseta）感受态细胞并进行诱导表达,SDS-PAGE检测蛋白表达情况。结果显示,SLA-2-YTH胞外区亚克隆大小为834 bp,酶切鉴定证实其成功插入pET-28a（+）表达载体。SDS-PAGE结果显示,SLA-2-YTH基因导入宿主菌后成功表达,蛋白大小约31.0 ku,与预期结果相符,优化后蛋白相对表达量达25%以上。本研究成功构建了烟台黑猪SLA-2-YTH原核表达载体,获得了表达蛋白,为今后进一步的结构和功能研究奠定基础。     

羊痘病毒063载体构建及蛋白纯化

为研究羊痘病毒宿主范围因子063基因的特征及其生物学功能,采用PCR方法扩增063基因,通过双酶切和基因同源重组的方法与PGEX-KG载体连接构建成融合表达GST标签的原核表达载体,经酶切和测序鉴定正确的克隆转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导表达063蛋白,产物经SDS-PAGE电泳检测和Western Blot鉴定,大量诱导表达063蛋白,通过谷胱苷肽琼脂糖亲合层析法,得到063纯化蛋白。     

猪日本脑炎病毒NS3蛋白的基因克隆、原核表达及纯化

提取猪日本脑炎病毒(JEV)上海分离株的基因组RNA,反转录合成cDNA,RT-PCR扩增JEV的NS3基因片段,亚克隆到原核表达载体pET-28(a)上,酶切鉴定和PCR鉴定重组原核表达质粒pET-28(a)-JEV-NS3,转化大肠埃希菌BL21(DE3)菌株,IPTG诱导表达重组His-JEV-NS3蛋白,SDS-PAGE分析重组蛋白的表达,his-band试剂盒纯化重组蛋白。获得了1.8kb NS3基因片段,成功构建重组原核表达质粒pET-28(a)-JEV-NS3。IPTG诱导获得分子质量为64ku的His-JEV-NS3蛋白,该蛋白主要以包涵体形式表达,表达量占总菌体蛋白的30%以上,纯化后获得高纯度重组蛋白,其占总蛋白比例达70%以上。     

结核分支杆菌MPT83在真核、原核表达载体中的克隆、表达与鉴定

为了克隆、鉴定和表达结核分支杆菌抗原蛋白 MPT83 ,为结核病的诊断以及亚单位疫苗、核酸疫苗的制备和应用奠定基础。以结核分支杆菌标准菌株 H3 7RV基因组 DNA为模板 ,PCR扩增目的基因 mpt83 ,扩增产物酶切后分别克隆到真核、原核表达载体 p JW43 0 3和p ET2 2 b( )中 ,构成重组真、原核表达载体 83eu和 MPT83。经酶切和序列鉴定为正确的重组真核表达载体 83 eu和重组原核表达载体MPT83 ,分别转染 COS7细胞和转化 BL2 1( DE3 ) plys S。结果表明 ,经 SDS-PAGE、Westernblotting检测显示 ,IPTG诱导的原核表达载体MPT83在 2 .6万处有正确而特异的蛋白条带 ;转染 COS7细胞的真核表达载体 83 eu,Westernblotting检测表明也有与结核分支杆菌抗血清特异反应的蛋白条带     

犬布氏杆菌外膜蛋白Omp31基因的原核表达

克隆了犬布氏杆菌外膜蛋白Omp31基因并构建原核表达系统,并对表达产物进行了初步的血清学鉴定。利用PCR技术扩增犬布氏杆菌RM6/66参考株Omp31基因,然后将其克隆到pGEMT-easy载体上进行测序。测序正确后,将该基因插入到pET-32a载体中构建原核表达载体,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,诱导表达融合蛋白,Western blot分析融合蛋白的免疫反应性。结果构建了犬布氏杆菌Omp31基因的原核表达载体pET-Omp31,并且在大肠杆菌中成功表达融合蛋白,经Western Blot鉴定该蛋白能被犬布氏杆菌阳性血清所识别。犬布氏杆菌外膜蛋白Omp31的表达成功,为犬布氏杆菌病血清学诊断方法的建立提供了基础资料。     

鹿结核分枝杆菌MPB70蛋白的表达与免疫原性鉴定

本研究以分离的鹿结核分枝杆菌DNA为模板扩增免疫原性蛋白MPB70基因,获得约590 bp片段,并将其克隆,构建原核表达载体pET-30a-MPB70,将重组质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导后纯化和SDS-PAGE分析,在20 ku处可见特异性蛋白条带。利用鹿结核阳性血清进行Western blotting鉴定,原核表达的融合蛋白可与鹿结核阳性血清抗体结合,并出现特异的免疫反应。该蛋白可作为特异性抗原进行鹿结核病的检测,从而为鹿结核病诊断方法的研究奠定基础。     

结核分支杆菌MTB41 DNA疫苗的构建及原核表达

为了构建结核分支杆菌MTB41 DNA疫苗,同时将其克隆到原核表达载体中进行表达。用结核分支杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,用PCR法对基因MTB41进行扩增,克隆到真核表达载体pJW4303中,构建MTB41重组真核质粒(DNA疫苗),进行了酶切鉴定和序列分析;克隆到原核表达载体pET22b中,酶切和测序鉴定正确后转入E．coli BL21(DE3)PLysS宿主菌株内中,诱导表达,进行SDS-PAGE电泳分析。电泳发现转化了重组质粒的菌株有蛋白表达,所表达的蛋白质相对分子质量为41ku,MTB41 DNA疫苗酶切鉴定和序列分析完全正确,确定含有正确的读码框,疫苗制备成功。DNA疫苗的成功构建,重组蛋白MTB41的成功表达,为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测以及抗原、抗体的大规模制备打下了基础。     

副结核分枝杆菌hsp65基因在大肠杆菌中的表达

本研究以EcoRV和EcoR I双酶切pGEM-T-hsp65和pET-32a（＋）,并将纯化的hsp65基因亚克隆至pET-32a（＋）中,构建出原核表达载体pET-hsp65。将pET-hsp65转化至感受态E．coli BL21（DE3）中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见一条约76ku的外源蛋白带。Western blot分析表明,该蛋白具有与副结核分枝杆菌多克隆抗体发生反应的特性,为进一步研究有关hsp65的新型疫苗奠定了基础。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白原核表达载体的构建、表达及蛋白纯化

为了表达并纯化猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV-2)Cap蛋白,试验将ORF2基因的密码子改造为大肠杆菌嗜好的密码子,但编码的氨基酸序列不变。合成优化后将ORF2基因全部基因序列,克隆于pET-30a原核表达载体并转化至大肠杆菌BL21中,经PCR和测序鉴定阳性克隆后,采用IPTG诱导表达目的蛋白。优化蛋白表达条件,采用Ni-NTA亲和层析胶纯化目的蛋白。结果表明:基因序列合成正确,无点突变。重组质粒成功转化入大肠杆菌BL21中,经诱导表达出现约37 ku的蛋白条带,与预期分子量大小一致。优化表达条件后,加入终浓度为1.2 mmol/L IPTG诱导6 h,表达产物含量最高。经Western-blot检测,能被PCV-2抗体阳性血清结合。说明成功构建了PCV-2 Cap蛋白的原核表达质粒pET-30a-ORF2,优化了表达条件并纯化出目的蛋白。     

牛分枝杆菌分枝菌酸环丙烷合酶PCAA的表达与鉴定

以牛分枝杆菌Vallee株基因组为模板,利用PCR方法扩增该菌株的环丙烷一分枝茵酸合酶pcaA基因,并克隆到原核表达载体pET-32a（＋）中,通过大肠杆菌BL21（DE3）表达重组融合蛋白,并利用Ni-亲和层析的方法纯化出重组蛋白。通过鉴定其免疫活性。试验结果表明,成功扩增出了牛分枝杆菌中pcaA基因并纯化出了重组的融合蛋白,通过免疫印记发现,重组蛋白可与牛结核阳性血清发生特异性反应,为进一步研究牛分枝杆菌的致病机理奠定基础。     

结核分支杆菌Rv2031c慢病毒载体的构建及其对RAW264.7细胞凋亡的影响

研究结核分支杆菌Rv2031c基因对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞凋亡的影响。根据GenBank数据库中结核分支杆菌Rv2031c的序列设计引物,以结核分支杆菌国际标准株H37Rv株灭活的菌液上清液为模版,扩增Rv2031c基因;克隆至慢病毒表达载体plex-EGFP中,经酶切和测序鉴定后,获得plex-Rv2031c-EGFP重组慢病毒载体;将重组慢病毒质粒分别与辅助质粒共转染至293T细胞中,转染48h后收集慢病毒,并侵染RAW264.7细胞;侵染48h时收集细胞,用流式细胞术检测各试验组巨噬细胞的凋亡率;提取细胞总RNA并反转录成cDNA,PCR检测Rv2031c基因在细胞中的表达情况;同时,使用细胞裂解液提取细胞总蛋白,Western blot检测Rv2031c蛋白表达水平。结果表明,成功构建了Rv2031c的慢病毒表达载体plex-Rv2031c-EGFP;构建了过表达Rv2031c的慢病毒Rv2031c-lv;感染Rv2031c-lv的RAW264.7细胞的凋亡率为41.8%,而对照组EGFP-lv感染的RAW264.7细胞其凋亡率为30.0%;PCR结果表明Rv2031c在Rv2031c-lv侵染的RAW264.7细胞中高表达;Western blot结果显示Rv2031c蛋白在Rv2031c-lv侵染的RAW264.7细胞中高表达。该研究成功构建了结核分支杆菌Rv2031c的慢病毒表达载体并验证了其对RAW264.7细胞凋亡的影响,为结核分支杆菌在机体内潜伏期感染的药物研究奠定了基础。