无乳链球菌表面蛋白Rib基因克隆与重组表达

无乳链球菌是引起奶牛乳房炎的常见病原微生物之一,其表面蛋白作为一种高免疫原性的生物大分子,具有较高的种内特异性,是理想的候选疫苗与免疫检测靶标。本研究通过对无乳链球菌高免疫原性表面蛋白Rib的重组表达与抗体制备,为后期无乳链球菌的疫苗研制与检测奠定了良好的基础。首先提取了无乳链球菌基因组DNA,从中成功扩增出长度为452bp的编码表面蛋白Rib N端的基因片段。将这一片段连入重组表达载体pET-26b,转化受体菌株BL21(DE3)后利用IPTG进行诱导,结果表达了分子质量约为18ku的外源蛋白。在低温表达条件下,对IPTG诱导浓度进行优化,结果表明,IPTG的最适诱导浓度为0.05mmol/L。将诱导后的菌体进行超声波破碎并进行SDS-PAGE检测,结果显示重组蛋白以包涵体形式存在,对其进行变性、复性处理,利用亲和凝胶纯化后获得了纯度较高的重组蛋白。将重组蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,经检测抗体效价达到1∶480 000。     

柳州地区罗非鱼无乳链球菌与海豚链球菌分离株药敏性分析

为了解柳州地区罗非鱼链球菌的耐药性情况,本研究对从柳州地区分离得到无乳链球菌和海豚链球菌分离株进行药敏试验。结果显示,无乳链球菌与海豚链球菌之间的药敏结果有较大差异,而同一种细菌的不同菌株对药物的敏感性却较为一致。总体来说,两种菌对青霉素、头孢类药物均具有很高的敏感性,对喹诺酮类药物敏感性不高;无乳链球菌对多粘菌素B、复方新诺明、卡那霉素、磺胺异噁唑4种药物完全耐药,但海豚链球菌却对这些药物呈现不同程度的敏感性。     

牛源、兔源及人源无乳链球菌分子分型特征分析

为了解人源、牛源及兔源无乳链球菌(S.agalactiae)的基因型差异及分子分型的总体结构特征,本实验对30株2012年~2015年分离于人、牛及兔的S.agalactiae在cfb基因鉴定的基础上,通过荚膜多糖分子血清分型(CPS)、多位点序列分型(MLST)和脉冲场凝胶电泳(PFGE)进行基因型的确定和分子特征差异性比较。CPS结果显示,牛源和兔源S.agalactiae均为Ia血清型,而人源无乳链球菌包括Ia和III型两种血清型,以Ia血清型为主要血清类型;MLST分型获得8个STs序列型(ST7、ST10、ST19、ST61、ST103、ST199、ST486、ST651)和6个克隆群(CC7、CC10、CC19、CC23、CC61、CC103),其中人源S.agalactiae拥有最多的STs和克隆群分型;PFGE聚类分析可以将其分为18个PFGE带型,且不同动物源性S.agalactiae之间基因分型差异性较大。血清分型、STs序列型、PFGE带型与宿主的来源之间无明显的相关性。不同来源菌株可以同属于血清型Ia,且所有Ia血清型菌株可以分布于不同的STs序列型和PFGE带型中。但分型为Ia/ST651的人源S.agalactiae在MLST的克隆分群中是分型为Ia/ST103牛源S.agalactiae的克隆衍生物,同属克隆群CC103,Ia/ST651只是Ia/ST103单一位点变化的产物,从分子水平的相似性推测二者存在交叉感染的可能性。本研究为奶牛乳房炎的有效预防和治疗提供依据。     

应用iTRAQ技术对滩羊裘皮差异表达蛋白的研究

为了研究与滩羊羊毛纤维粗细及弯曲度和特定花穗构成相关的差异蛋白,试验应用同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）蛋白质组学方法,联合多维液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）技术对滩羊、内蒙古苏尼特羊、中卫山羊和新吉细毛羊的羊皮肤蛋白进行鉴定和筛选,并应用Proteome Discoverer 1.4软件进行定量分析,结合数据库搜索,鉴定出差异蛋白;最后应用生物信息学技术对差异蛋白进行GO分析和Pathway分析。4种羊皮肤中共鉴定到1 161个蛋白,其中内蒙古苏尼特羊与滩羊比对发现30个差异蛋白,中卫山羊与滩羊比对发现112个差异蛋白,新吉细毛羊与滩羊比对发现107个差异蛋白,对各比对组的皮肤差异蛋白进行分析,发现14-3-3蛋白σ亚型、KRT25、KRT34、KRT85、TCHH、KAP6和KAP11.1可能与滩羊羊毛纤维粗细及弯曲度和特定花穗形状的形成有关。本研究可为滩羊优质二毛裘皮选育研究提供科学依据。     

罗非鱼无乳链球菌EsxA基因克隆与原核表达

Ⅶ型分泌系统(T7SS)是近年来发现的分泌系统,分泌两种胞外蛋白,EsxA基因编码的ESAT6蛋白和EsxB基因编码的CFP-10蛋白。分泌蛋白具有良好的免疫原性,促进细菌从巨噬细胞吞噬体逃逸、影响巨噬细胞凋亡及裂解细胞等生物学功能,与致病性密切相关。以罗非鱼源无乳链球菌为模板,克隆到294bp的EsxA基因,将目的序列克隆到pMD18-T载体,经测序,目的序列与无乳链球菌EsxA基因同源率在99%以上。EsxA基因克隆到pET32a载体中,重组载体在28℃、0.5mmol/L IPTG诱导条件下表达量最大,可溶性表达。将纯化的ESAT6蛋白免疫Balb/c鼠,成功制备ESAT6蛋白鼠多克隆抗体,经Western blot,ESAT6蛋白具有良好的反应原性。研究结果为进一步进行无乳链球菌ESAT6蛋白的免疫学功能研究奠定了基础。     

两株不同血清型鱼源无乳链球菌生物学特性的比较研究

为分析裂腹鱼源无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)血清型Ia型和Ⅲ型的生物学特性的差异,本研究对该菌Ia型(S07)与Ⅲ型(S03)两株菌的生长曲线、耐药性、粘附和侵入能力、致病性,以及环境因子(pH、温度和盐度)对两株菌生长的影响等特性进行比较研究。结果显示,Ⅲ型S03株生长速度显著快于Ia型S07株。S03株生长受pH、温度和盐度的影响比S07株小。S03株和S07株在蔗糖、亮氨酸芳胺酶、β-溶血和VP试验等40种生化反应中结果一致,但S03株在葡萄糖、麦芽糖、α-葡萄糖苷酶和磷酸盐等11种生化反应中均呈阳性,而S07株呈阴性。S03株的耐药性明显强于S07株,且S03株表现出7重耐药,而S07株对所测抗生素均敏感或中度敏感。S07株黏附能力显著强于S03株。S07株对齐口裂腹鱼和斑马鱼的毒力(LD_(50)分别为8.9×10~3 cfu/mL和1.88×10~3cfu/mL)显著强于S03株(LD_(50)分别为5.27×10~8 cfu/mL和7.09×10~7 cfu/mL)。研究表明裂腹鱼源Ia型和Ⅲ型无乳链球菌在多种生物学特性上存在明显差异。本研究为阐明不同血清型无乳链球菌的致病机理及该菌引起的疾病的防治提供了实验依据。     

耐氨苄西林牛无乳链球菌的分离、鉴定与耐药性分析

为了研究牛乳房炎的预防措施,试验从天津某奶牛场乳房炎牛乳中分离出1株细菌,并进行了细菌的培养、菌落形态观察、生化试验及分子生物学诊断和耐药性分析。结果表明:该病原菌是牛无乳链球菌;该菌对青霉素耐药,对万古霉素、红霉素、阿奇霉素、阿莫西林、环丙沙星和头孢类抗生素等敏感。     

罗非鱼源无乳链球菌ScpB蛋白的表达及IgM抗体间接ELISA方法的建立

为了建立一种具有良好特异性、敏感性、重复性和准确性的,能够检测罗非鱼源无乳链球菌的ELISA方法,试验首先进行了罗非鱼源无乳链球菌ScpB基因的克隆及其蛋白的表达和纯化,然后以重组蛋白作为包被抗原、罗非鱼待测血清作为一抗、抗罗非鱼IgM单克隆抗体2C10作为二抗、羊抗鼠IgG-HRP作为三抗建立间接ELISA方法并对该方法进行条件(抗原包被质量浓度、一抗稀释度、抗原包被条件、封闭液、一抗作用时间、二抗作用时间)优化,最后确定该方法的临界值并进行特异性、敏感性、重复性和符合性试验。结果表明：纯化后的罗非鱼源无乳链球菌ScpB蛋白大小为104.6 ku,与预期大小一致,可被罗非鱼IgM抗体特异性识别;建立的IgM抗体间接ELISA方法的最佳抗原包被质量浓度为0.1μg/mL,最佳一抗稀释度为1∶5,最佳抗原包被条件为4℃、12 h,最佳封闭液为5%脱脂乳,最佳一抗作用时间为2 h,最佳二抗作用时间为0.5 h;临界值上限为0.456,临界值下限为0.377;批内变异系数为3.349%～5.272%,批间变异系数为2.793%～5.902%,均低于10.000%;仅可检测出罗非鱼无乳链球菌阳...     

基于iTRAQ技术的卵巢静止奶牛血清差异蛋白分析

旨在利用iTRAQ技术探究卵巢静止奶牛血清差异蛋白。本试验在奶牛产后60～90 d,根据发情表现、直肠检查和B超检查,按判定标准将试验奶牛分为卵巢静止组(IO)和正常发情对照组(CON),每组50头,采集血清。应用同位素标记绝对定量(iTRAQ)/质谱(MS)联用技术筛选差异蛋白,并应用免疫印迹以及ELISA方法鉴定奶牛卵巢静止血清差异蛋白。结果表明,试验共获得61种血清差异表达蛋白。GO分析表明,生物学过程包括34个注释,分子功能包括15个注释,细胞组成包括13个注释。蛋白质网络互作分析共得到57个节点,68条蛋白互作注释,蛋白质互作富集P<10^-16,得到11个信号代谢通路。经过筛选发现,糖酵解/糖异生、氨基酸的生物合成、胰高血糖素信号通路,维生素的消化与吸收可能与卵巢静止的发生存在相关性。与卵巢静止相关差异表达蛋白共有14种:其中GPX3、SCGB1D和PKM2表达下调,ADIPOQ、AHSG、APOA4、FETUB、ALDOB、SPAM1、LDHB、RBP4、IGFBP2、ITIH3及GLYCAM1表达上调。ADIPOQ、IGFBP2和RBP4通过生殖激素生物过程影响卵泡发育,GPX3通过氧化应激而影响卵泡发育。     

牛乳腺炎无乳链球菌Pgk基因抗原优势区原核表达产物的抗原性分析

为了探索牛乳腺炎无乳链球菌磷酸甘油酸激酶（Phosphoglycerate kinase,Pgk）基因编码蛋白的抗原性,根据GenBank公布的牛源无乳链球菌Pgk基因序列,设计并合成一对引物,通过PCR扩增出Pgk蛋白抗原优势区的编码序列,并对其进行克隆、测序、转化、诱导表达及抗原性鉴定。结果显示克隆的Pgk基因序列含有984 bp,编码328个氨基酸残基。临床分离株与GenBank上公布的B群无乳链球菌菌株Pgk基因（AE009948）核苷酸序列同源性为99.09%,氨基酸序列同源性为99.69%。将扩增的Pgk基因片段克隆至原核表达载体pET30a（＋）中,构建重组表达载体Pgk-pET30a（＋）,再将筛选的阳性重组质粒转化至BL21工程菌,经IPTG诱导获得部分可溶性表达Pgk重组蛋白。经Ni2＋亲和层析柱纯化得到纯度在90%以上的蛋白,经Western blot分析结果表明,重组蛋白具有良好的抗原性,为进一步探索其对奶牛的免疫原性研究奠定了良好的实验基础。     

荷兰牛乳房实验性感染无乳链球菌Ig分布

30头初次泌乳的荷兰小母牛,通过右前乳区,间隔25～30d连续进行3～5次无乳链球菌实验性感染.其中12头对无乳链球菌具有全身性高度免疫力.用酶联免疫吸附试验(ELISA)检查了体液免疫反应--乳房和血清中免疫球蛋白(Ig)分布情况.被感染的乳房为双相抗体反应,至少有两种抗参与.第一相主要为IgA,感染后24h达到高峰,然后逐渐下降至感染前水平.72h出现在被感染区,第6d达到高峰,然后慢慢下降.对照乳区未检测出IgA抗体,但在72h后出现抗体IgG.     

奶牛无乳链球菌内蒙古分离株SIP基因的克隆与序列分析

试验根据GenBank 公布的牛源无乳链球菌SIP基因序列设计并合成1对引物,通过PCR 扩增获得SIP基因部分扩增产物.序列分析结果表明:SIP基因扩增产物大小为945 bp,编码315个氨基酸残基.标准菌株(+株)与内蒙古分离株(M株)的基因及氨基酸同源性为100%,这2个菌株与GenBank上公布的B群无乳链球菌菌株(DQ914274)SIP基因及氨基酸同源性达到98.94%及99.68%.     

1株致病性兔无乳链球菌的分离、鉴定与系统发育分析

从患病家兔肝、肺、脑和心血中分离到1株链状革兰阳性球菌P110323,以1×106 CFU/mL菌液灌胃感染健康家兔后,表现出站立不稳、四肢划动、惊厥和呼吸障碍等症状,感染96 h后,死亡率为60％.解剖见肺淤血、出血;肝、脾和肾肿大,坏死;大脑肿胀,脑膜充血,脑回肿胀扁平,脑沟变浅.分离菌在BHI平板上形成湿润、边缘整齐的灰白色菌落;在5％的脱纤维羊血平板上形成透明的β溶血环;V-P试验、水解精氨酸与马脲酸等为阳性;水解七叶苷和利用甘露醇、山梨醇和乳糖产酸为阴性.16S rDNA系统发育分析显示分离菌与Streptococcus difficilis和Streptococcus agalactiae聚在一簇.gyrB基因系统发育分析表明分离菌属于无乳链球菌(S.agalactiae),结合细菌形态特点和生理生化特性鉴定该病原菌为无乳链球菌(S.agalactiae),多重PCR方法确定该菌荚膜多糖类型为Ia型.     

鱼源无乳链球菌透明质酸酶的表达及抗原性分析

透明质酸酶(HylB)是无乳链球菌重要的毒力因子。根据本实验室分离并公布在GenBank上的罗非鱼源无乳链球菌GD201008-001全基因组序列,PCR扩增获得长为2 346 bp,覆盖hylB保守功能区的基因片段。将该片段采用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ消化后亚克隆至表达载体pET28a(+),经双酶切、测序鉴定后转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,进行体外原核表达,获得88.5 ku的目的蛋白。将纯化后的目的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,经ELISA和Western blot鉴定该蛋白具有良好的免疫原性。     

科尔沁牛乳腺炎无乳链球菌cylE基因的克隆及抗原性分析

克隆分析科尔沁牛乳腺炎无乳链球菌溶血素cylE基因片段,为深入研究奶牛乳腺炎无乳链球菌免疫机制及制备新型免疫抗原提供理论依据。根据GenBank已公布牛源无乳链球菌溶血素的基因序列,使用Primer5.0软件设计1对特异性引物,以内蒙古通辽地区乳源性无乳链球菌临床菌株总DNA为模板扩增cylE基因片段,并分析其编码序列及免疫活性。克隆得到的cylE基因序列与Genbnak已公布的牛源无乳链球菌cylE基因序列两者核苷酸序列相似性为99.9%,仅有1个核苷酸发生突变(¹⁷¹²C→A)。cylE蛋白的亲水区较广,抗原指数较高的区域丰富,具有良好的抗原性,证明cylE基因具有高度保守性,cylE蛋白具有良好的抗原性,是防治无乳链球菌的理想抗原候选分子之一。     

高温胁迫下罗非鱼源无乳链球菌的比较转录组分析

【目的】从分子水平了解高温季节罗非鱼无乳链球菌病容易暴发的原因。【方法】在35和28℃分别培养无乳链球菌,提取总RNA并进行转录组测序;利用华大基因Dr.Tom自主分析平台进行差异表达基因分析,并针对差异基因进行了KEGG通路和GO功能的分类和富集;通过实时荧光定量PCR随机检测10个基因的差异表达,确定转录组数据的可靠性。【结果】共得到35和28℃培养条件下的显著性差异表达基因357个,其中上调基因229个,下调基因128个;GO数据库富集能得到多个具有显著性的功能集,多集中在碳源代谢相关的途径,包括碳水化合物分解代谢过程(carbohydrate catabolic process)、糖原代谢过程(glycogen metabolic process)、细胞葡聚糖代谢过程(cellular glucan metabolic process)等;差异基因中发现了多个与无乳链球菌致病性相关的基因,如烷基过氧化氢还原酶亚基、cAMP因子、C5a肽酶等编码基因;实时荧光定量PCR与转录组数据间皮尔逊相关系数R值为0.979(P<0.001),说明转录组数据可靠有效。【结论】高温能够显...     

牛乳腺炎无乳链球菌表面蛋白pgk抗原优势区的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立

为评价牛乳腺炎无乳链球菌重组表面蛋白(pgk)免疫原性,并通过建立检测抗体的间接ELISA方法对免疫抗体效价进行评价,本研究根据GenBank登录的无乳链球菌pgk基因序列,设计一对引物,以临床分离菌株基因组DNA为模板PCR扩增出pgk蛋白抗原优势区的编码基因序列。将其插入pET-30a(+)中,并在大肠杆菌中表达。Western blot鉴定表明,表达的重组蛋白与阳性血清具有良好的反应原性。采用纯化的表达产物作为包被抗原建立了检测无乳链球菌抗体的间接ELISA方法,确定抗原最佳包被浓度为3.115μg/mL,血清最佳稀释度为1∶160,酶标二抗最适稀释度为1∶4 000。初步应用于检测无乳链球菌、化脓性链球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌小鼠阳性血清的检测。结果表明牛乳腺炎无乳链球菌pgk亚单位抗原具有良好的抗原性,抗体检测灵敏度达到1∶4 000,同时表现良好的特异性。     

罗非鱼源无乳链球菌的分离鉴定及药敏试验

从广东省佛山市2个水产养殖场患病罗非鱼中分离到2株细菌,分别编号为T4SH和G6C,经形态学、培养特性观察、生化鉴定和16S rDNA基因序列分析证实为无乳链球菌。2株分离菌株均为革兰阳性菌,呈β溶血;16S rDNA基因序列与无乳链球菌同源性达99%以上。2株菌均对青霉素类、头孢类、林可胺类、大环内酯类、四环素类、氯霉素类抗生素敏感,对氨基糖苷类不敏感;而对磺胺类、喹诺酮类的敏感性存在差异。     

牛乳房实验性感染无乳链球菌时各种免疫球蛋白的分布

十头初次泌乳的小母牛,通过右前乳区,间隔23～30天连续进行2～3次感染试验。其中4头对无乳链球菌具有全身性高度免疫力。用酶联免疫吸附试验(ELISA)检查了体液免疫反应一乳房和血清中免疫球蛋白(Ig)抗体的情况。被感染的乳房为双相抗体反应,至少有两种Ig抗体参与。第一相主要是IgA,感染后24小时达到高峰,然后逐渐下降到感染前水平。72小时出现在被感染的乳区;第6天达到高峰,然后缓慢下降。对照乳区未出现IgA抗体,但在72小时后出现IgG。