牦牛源巴氏杆菌对氟喹诺酮类药物的耐药表型及耐药基因检测

从西藏不同地区规模化养殖场和兽防站(局)采集的疑似呼吸系统疾病症状的病死牦牛肺组织样品220份,通过细菌培养特性、染色镜检、微生物鉴定系统分离出44株巴氏杆菌。采用微量肉汤稀释法,测定了氟喹诺酮类6种抗菌药物和黏菌素药物对44株细菌的抗菌活性。采用PCR技术,进行氟喹诺酮类耐药基因的检测。结果表明,氟喹诺酮类6个药物的最小抑菌浓度(MIC)范围多在0.125~128μg/mL之间,黏菌素药物的MIC范围为0.016~8μg/mL。环丙沙星和加替沙星对临床分离的巴氏杆菌的耐药率分别为52.27%和54.55%,黏菌素对巴氏杆菌的耐药率为4.55%,粘菌素对大多数巴氏杆菌菌株的MIC值2μg/mL。PCR结果显示,氟喹诺酮类qnrA、qnrB、qnrS、aac(6′)-Ib-cr基因的阳性检出率分别为29.55%、18.18%、22.73%和18.18%,但qnrC、qnrD、qepA基因未检出。研究结果提示,大多数菌株对氟喹诺酮类药物存在交叉耐药现象,故临床应加强耐药性及耐药基因的检测。     

北京地区食源性沙门菌消毒剂抗性基因和耐药基因分布及相关性分析

为了解北京地区消毒剂抗性基因分布、携带情况及其与耐药基因之间的关系,本试验采集北京市6个行政区共计39家超市及农贸市场的猪肉和鸡肉样品,分离培养沙门菌并进行鉴定,随后结合Seqsero2、Staramr和Diamond等生物信息学软件对沙门菌的消毒剂抗性基因和耐药基因进行筛选与分析。结果显示,从28家超市和11家农贸市场的148份猪源和147份鸡源样品中共分离得到79株(26.78%)沙门菌。所有分离菌株共预测得到17种血清型,其中71株鉴定得到16种序列型(ST),大部分分离菌株的血清型与ST型一一对应,其中优势菌株为肠炎沙门菌ST11(n=24)。共检出32个消毒剂抗性基因,其中非共同携带的抗性基因有5个,包括外膜孔道蛋白基因opmD/npmC(携带率72.15%)、有机汞调控蛋白基因merR2(携带率37.97%)、季铵盐类消毒剂抗性基因qacEΔ1(携带率21.52%)和qacF(携带率12.66%)、外排泵基因oqxAB(携带率1.27%)。共检测出50个耐药基因,覆盖氨基糖苷类、大环内酯类和四环素类等共10类抗菌药物,其中氨基糖苷类占比最高(36.00%)。相关性分析结果显...     

木犀草素联合庆大霉素对耐药化脓隐秘杆菌抑制作用的研究

为探究木犀草素联合庆大霉素对耐药化脓隐秘杆菌的抑制作用,采用微量肉汤稀释法分别测定木犀草素和庆大霉素对34株化脓隐秘杆菌的最小抑菌浓度(MIC)。选取对庆大霉素耐药的化脓隐秘杆菌,通过棋盘法测定两种药物联合抑菌效果。经亚抑菌浓度木犀草素作用耐药菌株,比较木犀草素作用前后化脓隐秘杆菌对庆大霉素的耐药性变化情况。结果表明,木犀草素对化脓隐秘杆菌的MIC值为39~156μg/m L,与庆大霉素联合的作用为不相关;耐药菌经亚抑菌浓度木犀草素(1/4MIC)作用36 h后,庆大霉素对耐药菌的MIC值下降2~32倍,且原菌株耐药水平越高,MIC下降倍数越高。提示木犀草素具有良好抗菌活性,且能够逆转化脓隐秘杆菌耐药性。     

盐酸多西环素与土霉素对胸膜肺炎放线杆菌的体外抑菌效果研究

为研究盐酸多西环素、土霉素对胸膜肺炎放线杆菌的抗菌活性,本试验采用微量肉汤稀释法,对胸膜肺炎放线杆菌进行了体外药敏试验。结果显示,盐酸多西环素对胸膜肺炎放线杆菌的MIC范围为0.125~1.0μg/mL,土霉素对胸膜肺炎放线杆菌的MIC范围为0.125~1.0μg/mL,两种药物对胸膜肺炎放线杆菌的体外抗菌活性相当。结果表明,盐酸多西环素和土霉素对胸膜肺炎放线杆菌具有良好体外抑菌作用。     

EDTA对气载大肠杆菌消毒剂抗性的影响

为了降低大肠杆菌对消毒剂的抗性,采用微量肉汤稀释法,测定乙二胺四乙酸(EDTA)与聚维酮碘、癸甲溴铵、过氧乙酸、戊二醛、戊二醛癸甲溴铵、二氯异氰尿酸钠、新洁尔灭7种环境消毒药联用对36株气载大肠杆菌最小抑菌浓度(MIC)以及二者联用对大肠杆菌生物膜形成的影响。结果表明:大肠杆菌对化学消毒药存在多重耐药现象,但未发现过氧乙酸耐药菌株;EDTA与聚维酮碘联用,大肠杆菌MIC升高,生物膜形成未受影响;EDTA与其他6种消毒药联用,大肠杆菌MIC均有不同程度的降低,生物膜形成也受到抑制。说明聚维酮碘与EDTA具有拮抗作用,EDTA和另外6种消毒药联用可以逆转大肠杆菌的消毒剂抗性,对控制环境中细菌污染有一定的应用价值。     

内江市猪源大肠埃希菌抗菌药与消毒剂交叉耐药性研究

为了解内江市猪源大肠埃希菌对抗菌药与消毒剂的交叉耐药情况及交叉耐药机制。本试验以大肠埃希菌标准菌株(ATCC 25922)为质控菌,检测从内江市分离的66株猪源大肠埃希菌的耐药性,采用微量肉汤稀释法测定常用抗菌药恩诺沙星、土霉素和消毒剂苯扎溴铵、戊二醛对受试菌株的最小抑菌浓度(MIC),进行耐药性检测,并筛选出对抗菌药和消毒剂均耐药的交叉耐药菌;PCR扩增标准菌株和交叉耐药菌的qacE△1、acrA、acrB和tolC基因,采用琼脂糖凝胶电泳检测基因携带和扩增情况,并对acrA、acrB和tolC基因进行测序,以标准菌株的acrA、acrB和tolC基因为参照,比对交叉耐药菌相应基因突变情况。结果显示,从内江市分离的66株猪源大肠埃希菌对恩诺沙星和土霉素完全耐药,对苯扎溴铵耐药的有3株,而所有菌株均对戊二醛敏感,即对抗菌药和消毒剂均耐药的交叉耐药菌有3株,编号分别为5、6、7号。在检测的3株交叉耐药菌中,仅6号菌检出qacE△1基因;基因序列比对结果显示,与标准菌株相比,交叉耐药菌的acrA、acrB和tolC基因碱基和氨基酸均有突变发生,碱基突变率最高的是7号菌的tolC基因(2.10%),突变率最低的是7号菌的acrA基因(0.97%);氨基酸突变率最高的为7号菌的acrB基因(2.39%),突变率最低的是tolC基因,且3株菌突变率相同(均为0.22%);3个基因有部分碱基或氨基酸有一致突变。所检测的内江市猪源大肠埃希菌对常用抗菌药恩诺沙星和土霉素耐药性严重,已有对抗菌药和消毒剂交叉耐药的菌株,且其交叉耐药的机制与外排泵AcrAB-TolC有相关性。     

内江市猪源大肠埃希菌抗菌药与消毒剂交叉耐药性研究

为了解内江市猪源大肠埃希菌对抗菌药与消毒剂的交叉耐药情况及交叉耐药机制。本试验以大肠埃希菌标准菌株(ATCC 25922)为质控菌,检测从内江市分离的66株猪源大肠埃希菌的耐药性,采用微量肉汤稀释法测定常用抗菌药恩诺沙星、土霉素和消毒剂苯扎溴铵、戊二醛对受试菌株的最小抑菌浓度(MIC),进行耐药性检测,并筛选出对抗菌药和消毒剂均耐药的交叉耐药菌;PCR扩增标准菌株和交叉耐药菌的qacE△1、acrA、acrB和tolC基因,采用琼脂糖凝胶电泳检测基因携带和扩增情况,并对acrA、acrB和tolC基因进行测序,以标准菌株的acrA、acrB和tolC基因为参照,比对交叉耐药菌相应基因突变情况。结果显示,从内江市分离的66株猪源大肠埃希菌对恩诺沙星和土霉素完全耐药,对苯扎溴铵耐药的有3株,而所有菌株均对戊二醛敏感,即对抗菌药和消毒剂均耐药的交叉耐药菌有3株,编号分别为5、6、7号。在检测的3株交叉耐药菌中,仅6号菌检出qacE△1基因;基因序列比对结果显示,与标准菌株相比,交叉耐药菌的acrA、acrB和tolC基因碱基和氨基酸均有突变发生,碱基突变率最高的是7号菌的tolC基因(2.10%),突变率最低的是7号菌的acrA基因(0.97%);氨基酸突变率最高的为7号菌的acrB基因(2.39%),突变率最低的是tolC基因,且3株菌突变率相同(均为0.22%);3个基因有部分碱基或氨基酸有一致突变。所检测的内江市猪源大肠埃希菌对常用抗菌药恩诺沙星和土霉素耐药性严重,已有对抗菌药和消毒剂交叉耐药的菌株,且其交叉耐药的机制与外排泵AcrAB-TolC有相关性。     

磺胺间甲氧嘧啶与恩诺沙星联合用药对黄羽肉鸡常见病原菌的药敏试验

采用磺胺间甲氧嘧啶（SMM）与恩诺沙星（EFs）联合用药对黄羽肉鸡常见病原菌大肠杆菌、沙门氏菌和禽多杀性巴氏杆菌进行了体外药物敏感性试验。结果表明,SMM对3种病原菌的MIC值分别为256、1 024、256μg/m L;EFs对3种病原菌的MIC值分别为32、16、2μg/m L。SMM与EFs联合药敏试验结果表明对大肠杆菌和禽多杀性巴氏杆菌呈现协同作用,对沙门氏菌呈现相加作用。     

黄芩等中药及复方制剂对多重耐药鲍曼不动杆菌体外抑菌活性研究

目的:研究黄芩、黄连等中药及其复方制剂对多重耐药鲍曼不动杆菌(MDR-AB)的体外抑菌作用和杀菌作用。方法:采用微量肉汤稀释法进行体外抑菌和杀菌试验,分别测定黄芩、黄连、大黄、五味子、五倍子配方颗粒以及双黄连粉针剂、三黄片、盐酸小檗碱片对MDR-AB的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)。结果:黄芩、黄连、五味子、五倍子配方颗粒以及双黄连粉针剂对MDR-AB的MIC值分别为:4~8、4、16~32、8~16、8~16 mg/m L;MBC值分别为:32、8~16、64~128、32~64、16~32 mg/m L。结论:黄芩、黄连、五味子、五倍子配方颗粒以及双黄连粉针剂对MDR-AB有较好的体外抑菌、杀菌活性。     

中药提取物恢复耐药大肠杆菌对氨基糖苷类药物敏感性的研究

为考察五倍子、黄芩、黄连、艾叶、鱼腥草5种中药提取物恢复耐药大肠杆菌对氨基糖苷类抗生素敏感性的作用,采用1/2 MIC中药提取物对耐药菌株进行耐药性消除,通过影印培养法筛选出耐药性消除菌落,观察耐药消除率和消除子MIC值变化,并检测质粒及耐药基因rmt B的携带情况。结果表明:5种中药提取物对耐药大肠杆菌均有一定的抑制作用,耐药菌经1/2 MIC作用48 h后,五倍子、黄芩、黄连、艾叶、鱼腥草的耐药消除率分别为20.67%、21.33%、17.33%、16.67%、9.33%;消除子对庆大霉素(GEN)、卡那霉素(KAN)、阿米卡量(AMK)、新霉素(NEO)的MIC值均由高度耐药(512μg/m L)降至敏感(2~4μg/m L);5种中药提取物不能使耐药菌质粒丢失,却能导致耐药基因rmt B丢失。5种中药提取物可能是通过使高度耐氨基糖苷类药物的细菌丢失耐药主效基因来恢复对药物敏感性的。     

实时荧光定量PCR检测多重耐药大肠杆菌AcrA基因mRNA表达水平

体外单一药物诱导标准大肠杆菌ATCC25922,获得了耐氯霉素（CHL,MIC≥256 mg/L）、耐环丙沙星（CIP,MIC≥256 mg/L）、耐水杨酸钠（SAL,MIC≥275 mg/L）、耐四环素（T,MIC≥512 mg/L）的菌株。选取ATCC25922株,4株中度耐药菌SAL（175）、CHL（64）、T（64）、CIP（128）,4株高度耐药菌SAL（275）、CHL（256）、T（512）、CIP（256）,和临床分离的3株耐药大肠杆菌H1、H9、H10,通过实时荧光定量RT-PCR方法检测外输泵AcrA基因的mRNA表达水平。系统自动分析软件显示,Ct值与标准质粒浓度的对数之间存在良好的线性关系,回归系数为0.992。检测结果表明：H10、CHL（256）、CIP（256）拷贝数最高,达1015拷贝/μL;T（512）、H9、T（128）、SAL（275）、H1为1014拷贝/μL;CHL（128）、T（64）、CHL（64）为1013拷贝/μL;ATCC25922为1012拷贝/μL。不同程度耐药株AcrA基因的表达量不同,临床分离株和诱导的各高耐药菌株均比ATCC25922株表达量高,且差异极显著（P≤0.01）。这说明不同耐药程度的11株菌cDNA的量存在差异,AcrA基因转录水平与耐药水平成正相关。     

黄芩苷对耐药大肠杆菌marA基因mRNA表达水平的影响

为探究黄芩苷对耐药大肠杆菌主动外排调控基因marA的mRNA表达水平的影响,利用微量肉汤稀释法确定黄芩苷增敏环丙沙星的最佳浓度,然后对8株耐药菌株采取不加任何药物、单独加32mg/L黄芩苷或4 mg/L环丙沙星、32mg/L黄芩苷和4mg/L环丙沙星联合及16mg/L CCCP和4mg/L环丙沙星联合等5种方式培养,抽提总RNA并反转录成cDNA,荧光定量PCR测定主动外排调控基因marA及管家基因gapA的Ct值,并计算不同培养条件下各个耐药大肠杆菌marA基因mRNA相对表达量。结果显示,标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数R~2=1.00,溶解曲线特异,marA基因产物Tm值为81.8~82.1℃;黄芩苷与环丙沙星联合培养的耐药菌外排泵基因marA表达量与环丙沙星单独培养相比明显下降,前者0.71~2.06,后者2.27~7.28;以上结果表明黄芩苷可以通过抑制外排泵调控基因marA发挥作用,提示其也许可作为大肠杆菌的外排泵抑制剂应用于临床。     

鸡源大肠杆菌对氟喹诺酮类药物的耐药性分析及相关耐药突变研究

本试验采用药敏纸片法对2014年从13个不同规模化鸡场分离的135株鸡源大肠杆菌进行常用12种抗菌药物敏感性试验,结果表明,头孢西丁和阿莫西林/棒酸耐药率较低,分别为17.8%、18.5%,而氟喹诺酮类的环丙沙星、诺氟沙星和左氧氟沙星的耐药率较高,分别为68.9%、65.2%和63.7%;进一步对高耐药率的氟喹诺酮类耐药菌株测定环丙沙星MIC值为4~256μg/ml;PCR扩增相关耐药基因(gyr A和par C),并测序分析耐药决定区突变及与MIC对应关系表明,耐药菌株突变主要发生在gyr A基因的Ser83密码子和Asp87密码子,及par C基因的Ser80密码子和Glu84密码子上,不同突变类型分别对应一定MIC值范围,其中73.1%(57/78)突变类型为gyr A基因的C(Ser83)→T(Leu)和G(Asp87)→A(Asn)突变,及par C基因的G(Ser80)→T(Ile)突变,其MIC值在8~256μg/ml之间;本研究提示规模化鸡场在防治大肠杆菌等细菌病时,应根据药敏结果选用药物,少用或不用氟喹诺酮类药物。     

金黄色葡萄球菌临床分离耐氟喹诺酮类药物株的gyrA和grlA基因突变

对 5株临床分离的耐氟喹诺酮类药物的金黄色葡萄球菌 (MIC值范围 :4～≥ 12 8mg/ L) ,提取各细菌染色体DNA,对 gyr A和 grl A基因进行 PCR扩增 ,产物与 p MD18- T载体连接 ,转化至大肠杆菌 JM10 9感受态细胞 ,筛选阳性克隆 ,测序。序列分析结果表明 ,5株菌均发生了基因突变。突变位点 grl A:Ser80 (TCC)→ Phe(TGC) ,Ser80 (TCC)→ Tyr(TAC) ;gyr A:Ser84 (TCA)→ L eu(TTA )、Ser84 (TCA)→ Ala(GCA)、Glu88(GAA)→ L ys(AAA) ,其中 2株对氟喹诺酮类药物的 MIC值低 (4～ 6 4 m g/ L) ,均发生 grl A单一点突变 ,其余 3株在 gyr A和 grl A上产生多突变位点 ,且对氟喹诺酮类药物的 MIC值较高 (8～≥ 12 8mg/ L )。说明单一的点突变只能引起低水平或中等水平的耐药 ,高水平的耐药需要多位点的突变。 5株耐药菌株均发生 grl A Ser80→ Tyr(Phe)点突变 ,提示环丙沙星、诺氟沙星等氟喹诺酮类药物作用于金黄色葡萄球菌的首要靶酶是拓扑异构酶 Iv     

鸡源大肠杆菌质粒介导的氟喹诺酮类药物耐药基因qnrA的分子检测

对2005年~2007年从豫北地区临床分离的377株鸡源大肠杆菌进行生化鉴定,MIC值测定。被测菌株对氟喹诺酮类（FQs）药物恩诺沙星、环丙沙星和诺氟沙星均呈严重耐药,耐药率分别为94.9%、93.9%、94.9%。选取对恩诺沙星耐药（MIC>32 μg/ml）的235株大肠杆菌进行qnr基因的分子检测,结果显示仅有1株大肠杆菌（MIC=128 μg/ml）呈qnr基因阳性,经测序分析该基因命名为qnrA。     

2型猪链球菌对四环素的耐药机制

采用微量稀释法测定36株2型猪链球菌对四环素的耐药性,应用PCR扩增四环素相关耐药基因tet（M）、tet（O）、tet（K）、tet（L）、tet（Q）、tet（S）、tet（T）和tet（W）,将扩增到的耐药基因克隆、测序,并进行序列分析。结果显示,36株2型猪链球菌对四环素的耐药率为100%,MIC90高于512mg/L;其中29株扩增出tet（M）基因,6株扩增出tet（O）基因,5株同时扩增到tet（M）、tet（L）基因,同时扩增到tet（M）、tet（L）基因的菌株MIC均高于512mg/L;同源性分析结果显示,扩增到的tet（M）基因与GenBank中已公布序列的同源性为95%～100%,tet（O）基因与GenBank中已公布序列的同源性为95%～99%。结果表明,我国大部分地区的2型猪链球菌对四环素均具有很强的耐药性,主要耐药机制是由tet（M）基因介导的核糖体保护作用。     

聚维酮碘对家蚕病原菌的杀灭效果试验

聚维酮碘是一种新型消毒剂。体外抑菌试验结果表明,聚维酮碘消毒液对家蚕病原细菌和真菌的抑制作用较强,最小抑菌浓度范围为0.31~0.62mg/L,最低杀菌浓度范围为1.25~2.5mg/L。生物学试验表明,当有效碘浓度为1.25mg/L时,对家蚕病原细菌和病原真菌的杀灭效果均达到100%,并且该消毒剂对家蚕生长发育、茧质无不良影响。药效稳定性试验表明,常温下聚维酮碘消毒液的有效期可达2年。     

15种中草药对化脓隐秘杆菌的药敏试验及神经氨酸酶活性的影响

为了测定不同中草药对化脓隐秘杆菌分离株的药敏试验及神经氨酸酶活性的影响,试验采用煎煮法提取连翘、金银花、穿心莲、蒲公英、苍术、红花、黄连、虎杖、黄芩、蛇莓、乌梅、大青叶、杜仲、大黄和贯众等15种中草药的有效成分,测定其对化脓隐秘杆菌分离株的最低抑菌浓度(MIC),同时以2’-(4-methylumbelliferyl)-α-D-N-acetylneuraminic acid(MUNANA)为底物测定不同中草药提取液在亚抑菌浓度下对化脓隐秘杆菌神经氨酸酶活性的影响。结果表明:连翘、蒲公英、黄连、黄芩、乌梅、大黄具有良好的抗化脓隐秘杆菌活性,其中黄连作用效果最好,对4株化脓隐秘杆菌的MIC值均为0.25 mg/mL;连翘、蒲公英、黄芩、乌梅和大黄对4株化脓隐秘杆菌的MIC值在1.95~31.25 mg/mL之间;对苯唑西林耐药的化脓隐秘杆菌分离株对上述6种中草药依然敏感;另外,红花和大黄两种中草药以亚抑菌浓度作用化脓隐秘杆菌后,其神经氨酸酶活性集中在30~50个荧光单位之间;连翘、黄连、乌梅和贯众等中草药作用化脓隐秘杆菌后,其神经氨酸酶活性集中在50~100个荧光单位之间。说明连翘、蒲公英、黄连、黄芩、乌梅、大黄对化脓隐秘杆菌分离株具有显著抑制作用。     

金不换水提取物与抗菌药联合对含NDM-1不动杆菌的体外作用研究

本试验旨在探讨金不换水提取物与抗菌药联合对含新德里金属β-内酰胺酶-1 (New Delhi metallo-β-lactamase-1,NDM-1)基因不动杆菌传代的体外抑菌活性,为金不换的综合利用提供参考依据。试验采用二倍微量稀释法体外分别检测金不换水提取物与抗菌药对受试菌的最小抑菌浓度(MIC),并以亚抑菌浓度(即1/2 MIC)的金不换水提取物与抗菌药联合作用对含NDM-1不动杆菌进行传代。结果显示,金不换水提取物的MIC为0.25 g/mL,以0.125 g/mL的金不换水提取物与头孢曲松钠、阿莫西林、头孢噻肟、痢菌净、磺胺间甲氧嘧啶、头孢他啶、头孢噻呋钠、美罗培南8种抗菌药联合作用传代后MIC明显降低。综上所述,金不换水提取物部分联合抗菌药诱导耐药细菌体外抗菌活性明显增强,对含NDM-1的不动杆菌具有一定的抑菌作用。     

穿心莲中药血清联合抗菌药对含fosA3大肠杆菌的作用研究

为了探讨穿心莲中药血清与抗菌药联合体外抗含耐磷霉素基因fos A3(Fosfomycin Resistance Gene)大肠杆菌的效果,对临床分离的细菌进行鉴定,确定细菌所含耐药基因种类,采用二倍微量稀释法分别体外检测穿心莲水提取物,中药血清与抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC),并以1/2 MIC的穿心莲中药血清与抗菌药联合诱导含fos A3大肠杆菌的传代试验。结果显示,分离的菌株为含fos A3大肠杆菌;穿心莲水提物的MIC为1.0 g/m L,中药血清的MIC为1.0 m L/m L,以0.5 m L/m L的穿心莲中药血清与头孢曲松钠、阿莫西林、诺氟沙星、粘杆菌素、痢菌净、磺胺间甲氧嘧啶、阿米卡星、头孢他啶、头孢噻呋钠、氟苯尼考和磷霉素等11种抗菌药联合诱导传代后MIC显著降低。表明穿心莲中药血清联合抗菌药体外诱导含fos A3大肠杆菌,抗菌活性明显增强,并对含fos A3型大肠杆菌具有一定的耐药逆转作用。