猪流行性腹泻病毒纤突蛋白S1抗原表位的串联表达及免疫原性分析

为了获得猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)纤突蛋白S1抗原表位的串联重组蛋白并评价其免疫原性,试验将S1蛋白的抗原表位COE和S1D连接起来组成串联表位S1CD,合成相应的基因片段后克隆至转移载体pFastBac1上,然后转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,通过蓝白斑和PCR扩增筛选重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-S1CD,再转染Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒,采用间接免疫荧光试验和Western-blot检测方法鉴定重组蛋白S1CD的表达情况。将小鼠随机均分为S1CD蛋白组、PEDV灭活疫苗组和PBS组,分别经背部皮下多点注射重组蛋白S1CD、PEDV HeN170821灭活病毒和PBS与弗氏佐剂等体积混合制成的抗原,检测特异性IgG抗体水平及白细胞介素-4(IL-4)和γ干扰素(IFN-γ)含量以评价重组蛋白S1CD的免疫原性。结果表明：重组蛋白S1CD成功在Sf9昆虫细胞中表达,并能与鼠抗His单克隆抗体和PEDV阳性血清发生特异性反应;首次免疫后第28天,S1CD蛋白组的特异性IgG抗体水平极显著高于PBS组(...     

猪流行性腹泻病毒S蛋白抗原表位区基因克隆、分析及原核表达

从患流行性腹泻的病猪小肠中分离猪流行性腹泻病毒(PEDV),设计一对引物用于扩增PEDV S蛋白的抗原表位区,将扩增产物克隆到原核表达载体pET-32a,构建了重组表达质粒pET32a-PEDV-S1;在IPTG的诱导下表达,经SDS-PAGE分析,Western blotting鉴定,结果表明该抗原表位区蛋白得到了重组表达.该研究可为PEDV抗原表位区的相关研究提供参考.     

猪流行性腹泻病毒 COE 抗原表位的原核表达及鉴定

为更好地了解近年来仔猪流行性腹泻疫情,收集上海地区猪流行性腹泻病猪的临床样品,扩增猪流行性腹泻病毒保护性抗原基因（COE 基因）,构建原核表达载体 pColdⅡ-COE,转化至大肠埃希菌 pG-Tf2／BL21,IPTG 诱导表达,SDS-PAGE 结果显示,表达的 COE 蛋白大小为16 ku,Western blot 分析表明,该蛋白与临床上猪流行性腹泻病毒阳性猪的血清有特异性反应,说明所表达的 COE 蛋白具有反应原性,为进一步研制猪流行性腹泻疫苗和 ELISA 检测方法奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒S蛋白多表位抗原免疫原性分析

在猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)经典毒株CV777毒株S基因基础上,选取S抗原优势表位EP(499～638 aa、748～755 aa、764～771 aa和1368～1374 aa)和超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因,优化后通过编码柔性连接肽(G...     

猪传染性胃肠炎病毒纤突蛋白抗原表位区的表达及其免疫原性分析

为研究猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)纤突蛋白(S)上主要抗原位点的免疫原性,本研究将S基因上A、B、C、D四个位点进行RT-PCR扩增,构建重组质粒pET30a-S,诱导表达后Western-blot检测,表明目的蛋白具有良好的抗原性。将纯化的目的蛋白免疫小鼠3次,在初次免疫后第0,14,28,42天采血,并用间接ELISA方法监测血清抗体动态水平变化。结果表明,获得的重组蛋白能诱导免疫小鼠产生特异性的体液免疫,说明该蛋白具有发展成TGEV亚单位疫苗的潜力。     

猪流行性腹泻病毒流行毒株S1蛋白的原核表达与鉴定

为了获得具有良好活性的猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)流行毒株重组蛋白,试验采用PCR扩增、克隆、诱导表达、Western-blot检测、间接ELISA等方法对PEDV流行毒株S1蛋白的主要抗原区域进行了原核表达、鉴定与初步应用研究。结果表明:经PCR扩增得到大小为1 095 bp的S1蛋白主要抗原区域基因;将目的片段定向克隆至pET-30a原核表达载体中,经IPTG诱导获得大小为48. 0 ku的重组蛋白; Western-blot检测显示,重组蛋白可与PEDV阳性血清发生特异性反应;用以重组蛋白为包被抗原初步建立的PEDV抗体间接ELISA方法检测PEDV感染猪场,其阳性感染率达98. 52%,无PEDV免疫史和感染史猪场的阳性感染率为0。说明试验获得了具有良好生物学活性的PEDV流行毒株重组蛋白。     

流行性乙型脑炎病毒E蛋白主要抗原表位的原核表达

为了克隆乙型脑炎病毒E蛋白主要抗原片段基因的原核表达系统,试验采用RT-PCR方法扩增乙型脑炎病毒E蛋白上2个重要抗原域73~88 aa和292~402 aa,并将其定向连接至原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-EAB,再将重组质粒转入大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞,用IPTG进行诱导表达,应用SDS-PAGE和Western-blot技术对表达产物进行检测与鉴定。结果表明:经SDS-PAGE分析,表达出的目的蛋白主要以包涵体形式存在;再使用Western-blot技术对纯化复性后的包涵体进行检测,证实其具有免疫活性。     

猪流行性腹泻病毒N蛋白的原核表达及生物学活性鉴定

为研究猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）的N蛋白特性及在诊断中的应用,本研究采用RT-PCR方法从猪流行性腹泻病毒FJ-11A株中扩增其N蛋白基因片段,并将其克隆到原核表达载体pET-32a上,构建原核表达重组质粒pET32a-PEDV-N,进行条件优化诱导表达、SDS-PAGE、Western blot和ELISA试验。结果表明,该重组目的蛋白（约60 kDa）得到表达,且具有良好的免疫学活性,该研究为开发猪流行性腹泻病毒诊断方法和研究N蛋白功能奠定基础。     

猪流行性腹泻病毒S1蛋白B细胞表位原核表达及间接ELISA方法的建立

应用DNAStar软件在猪流行性腹泻病毒S1蛋白70～280位氨基酸序列间预测出1个优势B细胞抗原表位,氨基酸序列为IARLRICQFP,命名为PEP3。借助基因工程技术成功对PEP3进行融合表达,经动物试验、Western blot和间接免疫荧光试验均表明,PEP3蛋白具有良好的抗原性。基于PEP3蛋白建立的ELISA检测方法,与用N蛋白建立的检测方法的符合率为95.94%;该方法具有较高的敏感性和良好的特异性,批内和批间变异系数分别为1.68%～4.65%和4.21%～9.32%。研究表明,本试验建立的基于PEP3蛋白的ELISA检测方法特异性强、敏感性好、重复性高,可以用于临床样本的检测,丰富了现有的猪流行性腹泻病的诊断防控技术。     

1株抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

为鉴定猪流行性腹泻病毒(PEDV)核衣壳(N)蛋白的抗原表位,本研究通过原核表达N蛋白,纯化后免疫BALB/c小鼠,利用细胞融合和亚克隆技术,筛选出1株稳定分泌抗PEDV N蛋白抗体的杂交瘤细胞9B4。经鉴定单克隆抗体9B4的亚型为IgG1型,轻链为Kappa链。腹水抗体ELISA效价为10~6以上。ELISA、Western blot和免疫荧光鉴定结果显示该单克隆抗体反应原性和特异性良好。利用噬菌体展示技术对单克隆抗体9B4进行抗原表位鉴定,获得4个N蛋白的模拟抗原表位(C11、C12、C14和C26)。随后分别以噬菌体阳性克隆为模拟抗原,对临床PEDV血清样品进行检测,发现其均能与猪PEDV阳性血清发生特异性结合,而与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)阳性血清、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)阳性血清不反应,说明本研究获得的N蛋白模拟表位可用于PEDV抗体的检测,有助于PED流行病学调查和PEDV疫苗免疫效果的评价。     

猪流行性腹泻病毒N蛋白的原核表达与鉴定

为了制备猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）N蛋白,通过PCR扩增获得PEDV的N基因片段与载体pET-32a（+）相连构建原核表达载体pET-32a（+）-PEDV-N。将构建成功的质粒转化到BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG（1 mmol/mL）37℃诱导表达后,采用SDS-PAGE检测重组蛋白的表达情况,对影响重组蛋白表达的诱导时间进行分析。利用Western blot方法分别检测重组蛋白的免疫原性。结果表明：PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳检测发现条带位置正确,重组质粒pET-32a（+）-PEDV-N测序正确,含有重组质粒pET-32a（+）-PEDV-N的表达菌株BL21（DE3）在诱导表达后,经SDS-PAGE检测证明有重组蛋白表达,利用Western blot结果表明该重组蛋白与PEDV多克隆抗体发生特异性反应,说明成功制备了PEDV-N重组蛋白。     

携带猪流行性腹泻病毒S1抗原表位的乙肝核心抗原病毒样颗粒的构建与鉴定

旨在构建以乙肝核心抗原(HBcAg)为载体呈现猪流行性腹泻病毒(PEDV)S1抗原表位的病毒样颗粒.将PEDV S1蛋白中含B细胞表位的270 bp片段插入到HBcAg主要免疫显性区域(MIR),构建重组质粒pET-32a(+)-HBcAg-PEDV S1,转化到感受态细胞BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,SD...     

禽传染性支气管炎病毒S1蛋白单克隆抗体制备及其中和抗原表位的鉴定

为鉴定禽传染性支气管炎病毒(IBV)刺突(S1)蛋白的中和抗原表位,本研究通过IBV全病毒免疫BALB/c小鼠,经融合、亚克隆筛选获得了4株稳定分泌抗IBV S1蛋白抗体的杂交瘤细胞株4A11、1B11、5E5和7C9。经鉴定制备的单克隆抗体腹水抗体ELISA效价为10⁶以上,Western blot和间接免疫荧光试验分析显示该单克隆抗体反应性和特异性良好。随后用8种基于S1分型的IBV毒株为试验毒株,同实验室已有的8株IBV S1单抗(1E9、1H1、1E4、3C6、3C7、2F3、2E5、4F9)共12株单抗进行气管环中和活性检测,发现S1蛋白单抗与8种S1亚型的毒株均有不同程度的中和作用。随后,在抗原表位和Western blot分析的基础上,鉴定出单克隆抗体识别的抗原表位区域,获得了6个中和抗原表位,其中除⁴¹⁶IQTRTEP⁴²²表位,其他5个表位仍未有相关报道。本研究成功制备出4株特异性识别S1蛋白且具有中和活性的单克隆抗体,不仅丰富了IBV的单克隆抗体库,为今后研究IBV S1蛋白分子结构提供了关键生物材料...     

表达猪流行性腹泻病毒纤突蛋白的重组水泡性口炎病毒构建和鉴定

为表达猪流行性腹泻病病毒(porcine epidemic diarrhea,PEDV)纤突蛋白,利用Mega7基于PEDV纤突蛋白氨基酸序列进行遗传进化分析,选择新发流行毒株纤突蛋白基因,以重组水泡性口炎病毒(rVSV_MT)为载体,在rVSV_MT基因组G和L间插入目的基因,通过反向遗传学技术拯救VSV_MT-S△19重组病毒,Western blot和RT-PCR鉴定重组病毒是否成功表达PEDV纤突蛋白,采用一步生长曲线鉴定VSV_MT-S△19在Vero细胞中的生长特性,并与弗氏佐剂混合后肌肉注射小鼠探究其在动物体内的免疫效果。遗传进化分析发现,插入rVSV_MT的纤突蛋白基因序列PEDV/CHN/SH-2012-5属于PEDV新发流行毒株GⅡ型; RT-PCR分析重组病毒表达纤突蛋白基因无突变; Western blot鉴定显示出PEDV纤突蛋白和VSV病毒特征条带;一步生长曲线表明重组病毒VSV_MT-S△19体外复制滴度可达108TCID50/m L,与VSV_MT-GFP无显著性差异(P> 0. 05);小鼠动物试验结果表明,重组病毒成功激发PEDV中和抗体产生,与对照PBS接种组差异显著(P<0. 05)。研究表明,利用重组水泡性口炎病毒(rVSV_MT)为载体表达GⅡ型PEDV纤突蛋白能有效激发机体产生高水平中和抗体,为PEDV亚单位疫苗的研制提供了理论和实践依据。     

猪戊型肝炎病毒ORF2蛋白N端主要抗原表位区的原核表达

用原核表达系统表达猪戊型肝炎病毒ORF2蛋白N端的主要抗原表位区。通过对GenBank公布的猪戊型肝炎病毒DQ1株ORF2的氨基酸序列进行分析,确定了其N端抗原性较高的区域,针对此区域设计并合成了1对特异性引物,RT-PCR扩增该区段,并将此片段克隆到原核表达载体pET30a(+)上,命名为pET30a-ORF2N,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,1.0 mmol/LIPTG37℃诱导表达。RT-PCR扩增得到424 bp的片段,重组蛋白大小约为21.8 ku,与预期大小相符。West-ern blotting分析结果表明,该蛋白能与阳性血清发生特异性反应,证明该蛋白具有生物学活性。猪戊型肝炎病毒ORF2蛋白N端主要抗原表位区在大肠杆菌中成功表达,具有一定的反应原性,为进一步用其建立诊断方法奠定基础。     

猪细小病毒NS1蛋白主要抗原表位区的原核表达及间接ELISA方法的建立

通过分子生物学软件对GenBank中发表的猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)中国株NS1蛋白的氨基酸序列进行分析,确定了主要抗原表位区域,针对此区域设计了1对特异性引物.通过PCR方法扩增出长度为843bp的基因片段,将此片段克隆到原核表达载体pET30a(+)上,构建了原核表达我体pET30a-NS1,实现了PPVNS1蛋白主要抗原表位区在大肠杆菌中的高效表达.重组蛋白相对分子质量约为43 000,与预期相符.Western-blot试验表明获得的表达产物具有良好的反应原性.以纯化的该蛋白作为包被抗原,通过方阵试验确定了包被抗原的最佳包被量为2 mg/L,一抗的最佳稀释倍数为1:100,阳性标准为:待检血清D150≥0.36,且待检血清D450/阴性血清D4502,作为阴阳性临界值,初步建立了检测PPV抗体的间接ELISA方法.用该方法对临床血清样本进行检测,间接ELISA判定为阳性的60份血清,经Western-blot试验只有45份为阳性.随机抽取100份猪血清样品与商品化试剂盒检测结果对比,符合率为96%,表明所建立的间接ELISA方法具有良好的特异性和敏感性,为流行病学调查和疾病的鉴别诊断奠定了基础.     

猪细小病毒结构蛋白VP2主要抗原表位区基因的克隆及原核表达

本文参照GenBank发表的猪细小病毒结构蛋白VP2基因序列,设计一对引物,通过PCR方法扩增出一段包含VP2主要抗原表位编码区的片段,产物克隆到pGEM-T载体上,酶切后插入原核表达载体pET-32(a)的T7启动子下游,构建的重组质粒pET-VP2经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达。SDS-PAGE结果显示,表达产物分子量为39.1KDa,主要以包涵体形式存在。BandScan分析,表达量约占菌体蛋白的65.2%。表达产物用His亲和层析柱纯化。Western blotting结果显示,该种蛋白能与阳性血清发生特异性反应。结果说明,该重组蛋白具有抗原性,可以作为鉴别诊断用抗原。     

猪戊型肝炎病毒ORF2蛋白C端主要抗原表位区的原核表达

利用分子生物学软件分析GenBank公布的猪戊型肝炎病毒DQ1株ORF2的氨基酸序列,确定了其C端抗原性较高的区域,针对此区域设计并合成了一对特异性引物,RT-PCR扩增该区域,并将此片段克隆到原核表达载体pET30a(+)上,命名为pET30a-ORF2C,然后转化大肠埃希菌BL21感受态细胞,1.0 mmol/L IPTG 37℃诱导表达。结果表明,RT-PCR扩增得到301 bp的片段,重组蛋白大小约为18 ku,与预期大小相符。Western blot分析表明,该蛋白与阳性血清发生特异性反应,为进一步利用其建立诊断方法奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒中和表位区S1D的原核表达及免疫原性分析

为了研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)S1蛋白中和表位区S1D的免疫原性,根据PEDV河南株(Gen Bank:YK649107)S1基因序列,设计1对特异性引物,PCR扩增S1D片段,克隆到p ET-28a(+)中,构建原核表达载体,经优化的IPTG浓度诱导后进行SDS-PAGE分析,利用His标签的特性重组蛋白进行纯化及Western blot分析。结果显示:中和表位S1D片段在p ET-28a(+)中高效表达;Western blot证明重组蛋白可以与PEDV阳性血清产生特异性反应;用纯化的蛋白免疫新西兰白兔,抗体水平升高,表明重组蛋白具有良好的免疫原性。     

表面展示猪流行性腹泻病毒纤突蛋白S1的重组杆状病毒及其免疫效果研究

猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)纤突蛋白S1能够介导宿主抵御PEDV感染的中和抗体的产生,是PEDV基因工程疫苗研究的重要靶抗原。将PEDV的S1基因克隆至杆状病毒基因组中,构建包含PEDV S1基因的重组杆状病毒,使S1蛋白表面展示表达。以该重组病毒作为活载体疫苗皮下接种BALB/c小鼠,验证S1蛋白在重组杆状病毒中的表达及其免疫原性。Western blotting分析被重组杆状病毒感染的Sf9细胞中,PEDV S1蛋白能有效表达且呈现大小分别约120 k D和150 k D的2条带,其中前者至少比预期大30 k D左右,推测重组S1蛋白在Sf9细胞中被高度糖基化修饰。重组杆状病毒的胶体金免疫电子显微镜观测结果显示S1蛋白展示于杆状病毒表面;间接ELISA试验结果证明重组杆状病毒可以诱导产生PEDV特异性抗体,抗体效价达到1∶5 000。血清中和试验及淋巴细胞增殖试验结果证明,该重组杆状病毒能够激发有效的体液免疫及细胞免疫反应,S1蛋白在重组杆状病毒表面展示表达并具有免疫原性。