转cry1Ab/cry2Aj、cry1Ab/vip3DA玉米对棉铃虫、甜菜夜蛾和斜纹夜蛾的抗虫性评价

为评估转cry1Ab/cry2Aj、cry1Ab/vip3DA玉米对棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)、甜菜夜蛾Spodoptera exigua(Hübner)和斜纹夜蛾Prodenia litura(Fabricius)的抗虫性,在室内测定了3个转cry1Ab/cry2Aj玉米品系和1个转cry1Ab/vip3DA玉米品系对3种害虫幼虫存活和生长发育的影响,研究了该系列Bt玉米不同组织器官对害虫的杀虫活性和控制效果。结果显示,棉铃虫初孵幼虫取食各品系Bt玉米叶片96h后死亡率为87.50%~90.00%,取食花丝和雌穗的幼虫96h后几乎全部死亡;甜菜夜蛾初孵幼虫取食各品系Bt玉米叶片、花丝和雌穗168h后死亡率为22.50%~68.33%,幼虫的生长发育受到明显抑制,体重抑制率达85.00%~95.00%;斜纹夜蛾初孵幼虫取食各品系Bt玉米叶片、花丝和雌穗96 h后死亡率显著高于非转基因亲本对照,168h后幼虫死亡率达90.00%以上。研究表明,转cry1Ab/cry2Aj和cry1Ab/vip3DA玉米品系对棉铃虫和斜纹夜蛾的初孵幼虫表现出较好的抗性,可以作为转多基因抗虫玉米育种的备选材料。     

不同条件下转cry1Ab基因玉米植株残体中杀虫蛋白降解动态

为明确转cry1Ab基因玉米植株残体中Cry1Ab杀虫蛋白在不同条件下的降解动态,选取转cry1Ab基因玉米MON810和Bt11,采用ELISA方法测定4种条件下秸秆中Cry1Ab杀虫蛋白的残留量。结果表明,在不同条件、不同取样时间,2种玉米秸秆中Cry1Ab杀虫蛋白的残留量差异显著;整株秸秆中的Cry1Ab杀虫蛋白降解速度比粉碎后的慢;秸秆粉碎埋入土壤后播种冬小麦,玉米秸秆中Cry1Ab杀虫蛋白降解速度最快,且可完全降解;在不同条件下,MON810玉米秸秆中Cry1Ab杀虫蛋白的降解速度比Bt11玉米慢,MON810和Bt11玉米秸秆中Cry1Ab杀虫蛋白的DT50分别为10.2~207.8、13.6~124.0 d,DT90分别为185.1~368.3、45.2~224.0 d。研究表明,在不同条件下MON810和Bt11玉米秸秆中Cry1Ab杀虫蛋白的降解速度不同,依次为秸秆粉碎后埋在土壤后种植冬小麦秸秆粉碎埋在玉米田土壤中秸秆粉碎后放在地表整株秸秆放在地表。     

转Cry1Ab-ma基因玉米CM8101对草地贪夜蛾1龄和2龄幼虫的抗性

为明确转Bt基因玉米对草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda的抗性,采用室内玉米离体组织生测法测定取食转Cry1Ab-ma基因抗虫玉米CM8101心叶、花丝和籽粒后草地贪夜蛾1龄和2龄幼虫存活数量、存活幼虫的体重、蛹重、化蛹和羽化等参数,分析转Cry1Ab-ma基因抗虫玉米CM8101三种组织对草地贪夜蛾1龄和2龄幼虫的抗性。结果显示,转Cry1Ab-ma基因玉米CM8101心叶可完全杀死草地贪夜蛾1龄幼虫,2龄幼虫有存活,存活率为10.0%,但不能化蛹与羽化;花丝可杀死大部分草地贪夜蛾1龄幼虫,存活率为3.3%,并阻断其生活史,但对2龄幼虫杀伤力弱,存活率为73.3%,存活幼虫化蛹率和羽化率分别为20.0%和13.3%;籽粒可完全杀死草地贪夜蛾1龄幼虫,2龄幼虫有存活,存活率为13.3%,有少量可化蛹,化蛹率为3.3%、有少量羽化,羽化率为3.3%。表明转Cry1Ab-ma基因玉米CM8101在短期内对草地贪夜蛾1龄和2龄幼虫有良好的控制作用。     

Cry1Ac杀虫蛋白对甜菜夜蛾飞行能力的影响

转Bt基因作物上害虫取食Bt杀虫蛋白后存活并羽化的成虫飞行能力对于其飞离Bt作物,寻找庇护所中敏感个体进行交配、产卵,从而稀释抗性基因频率,实现“高剂量/庇护所”抗性治理策略具有重要意义。本文对取食含不同浓度Cry1Ac杀虫蛋白人工饲料的初羽化（未取食补充营养）甜菜夜蛾飞行能力进行了测试,结果表明,幼虫取食含25、50、100 μg/g和200 μg/g Cry1Ac杀虫蛋白人工饲料存活并羽化的成虫飞行距离、飞行速度和飞行时间均差异显著（p<0.05）。取食含较低浓度Cry1Ac杀虫蛋白（25 μg/g和50 μg/g）的人工饲料有促进成虫飞行的倾向,尽管与取食不含Cry1Ac杀虫蛋白的对照相比,成虫飞行距离、飞行速度和飞行时间均未达到显著增加的水平,但强飞行个体比例明显增加。随着饲料中Cry1Ac杀虫蛋白浓度的升高,羽化的成虫飞行能力显著下降。雄蛾飞行能力下降的程度比雌蛾更加明显。这些数据为转Bt基因作物上迁飞性害虫的种群动态规律及其潜在的抗性治理策略提供了科学依据。     

转Cry1Ab/Ac基因水稻对稻田底栖动物群落的生态安全性

为探究转Bt基因抗虫水稻对稻田水生生物的安全性,以转Cry1Ab/Ac基因抗虫水稻华恢1号(HH1)为材料,其非转基因水稻亲本明恢63(MH63)为对照,以底栖动物群落为指示生物,运用群落学方法研究了湖南湘潭转Bt水稻对稻田底栖动物群落的影响。结果显示,2012年在HH1与MH63稻田中,分别采集到底栖动物37种和38种,二者共有物种31种,群落物种相似度为0.8267,优势种相似度为0.8235;2013年在HH1与MH63稻田中分别采集到底栖动物40种和41种,二者共有物种33种,群落物种相似度为0.8148,优势种相似度为0.9231;2012与2013年在HH1与MH63稻田生境中,物种丰富度、个体数量、群落多样性指数、均匀性指数与优势集中性指数的时间动态趋势一致,且均无显著差异。研究表明,连续2年稻田种植转Cry1Ab/Ac基因抗虫水稻HH1,在群落水平上对湖南湘潭地区稻田底栖动物无显著影响。     

转sck/cry1Ac基因稻谷对米蛾幼虫解毒酶系的影响

采用酶活力测定及酯酶同工酶电泳方法研究米蛾(Corcyra cephalonica)幼虫取食表达SCK/Cry1Ac毒蛋白的转基因稻谷后体内重要解毒酶活力的变化,明确其代谢毒蛋白的主要酶类。结果表明:取食转Bt基因稻谷米蛾幼虫体内的α-乙酸萘酯酶、碱性磷酸酯酶的活力在24～72h显著低于对照;酸性磷酸酯酶活力在12、48h和72h时也显著低于对照;而α-乙酸萘酯羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶的活力显著高于对照。谷胱甘肽-S-转移酶的活性除饲喂24h的处理外,其他处理与对照无显著差异。此外处理72h后米蛾幼虫体内酯酶同工酶谱有4条酯酶酶带,4种酯酶Est1、Est2、Est3、Est4的活性均受到不同程度的抑制,酯酶Est4的抑制效果最明显。这些解毒酶和酯酶同工酶直接参与Bt毒蛋白的代谢作用。     

转基因棉花对草间小黑蛛生长发育及其相关酶活性的影响

为评估转基因抗虫棉花对天敌的安全性,用取食常规棉(中棉所49)、单价棉(中棉所45)和双价棉(2009002)的棉铃虫幼虫饲喂草间小黑蛛,采用酶联免疫和分光光度计法研究转基因抗虫棉对草间小黑蛛生长发育及其相关酶活性的影响。结果显示,与常规棉花相比,单价棉花使草间小黑蛛4～5龄幼虫发育历期显著延长,对其余龄期影响不显著;双价棉花对草间小黑蛛1～3龄幼虫发育历期影响不显著,4～5龄幼虫发育历期显著延长,6龄后大量死亡。2种转基因棉对草间小黑蛛体重及其体内外源蛋白含量的影响均不显著,除谷胱甘肽-转移酶和单价棉处理的过氧化物酶外,对其它相关酶活性亦无显著影响。     

取食转Bt基因棉等植物对甜菜夜蛾生长发育和药剂敏感性的影响

以转Bt基因棉(Bt棉)等6种寄主植物为材料,研究了对甜菜夜蛾Spodoptera exigua Hübner生长发育和药剂敏感性的影响,并对它们的后代体内乙酰胆碱酯酶和羧酸酯酶比活力进行了初步测定。结果表明,在25±1℃恒温、光照L:D=12:12条件下,甜菜夜蛾取食Bt棉与取食普通棉相比,幼虫历期延长了9.7d,龄数由5龄增加到7龄,单雌产卵力降低,幼虫存活率、蛹重、化蛹率、成虫羽化率和寿命略有降低。取食不同寄主植物间幼虫的存活率、蛹重和单雌产卵力较取食Bt棉和普通棉花间的差异更大。取食Bt棉的幼虫对顺式氯氰菊酯、灭多威、丙溴磷和氟啶脲的敏感性,较取食普通棉花的降低1～1.6倍,也较取食其它植物的敏感性明显降低。但该幼虫体内乙酰胆碱酯酶和羧酸酯酶的比活力却比取食普通棉花及其它植物的明显高。     

转CpTI+Bt基因棉和转Bt基因棉对甜菜夜蛾种群增长和行为的影响

利用室内饲喂法,以泗棉3号为对照,研究转双价(Bt CpTI)基因棉SGK321和转单价(Bt)基因杂交棉科棉3号对甜菜夜蛾室内种群生长发育和趋性的影响。结果表明:SGK321、科棉3号饲喂的甜菜夜蛾幼虫死亡率、成蛹下降率和幼虫成蛾下降率显著高于对照,且SGK321饲喂的化蛹下降率显著高于科棉3号。SGK321、科棉3号饲喂的甜菜夜蛾幼虫期显著长于泗棉3号,其蛹重显著轻于泗棉3号;SGK321饲喂的幼虫期长于科棉3号,其蛹期和蛹重接近于科棉3号;三种棉花饲喂的甜菜夜蛾的产卵前期、产卵期、产卵量均表现为SGK321<科棉3号<泗棉3号,其中SGK321饲喂的产卵期显著短于泗棉3号;SGK321、科棉3号饲喂的雌成虫寿命相近,但明显短于泗棉3号。三种棉花饲喂的甜菜夜蛾净增长率(R0)、内禀增长率(rm)、周限增长率(λ)和种群增长指数(I)均表现为SGK321<科棉3号<泗棉3号;世代平均周期(T)和种群加倍时间(DT)均表现为SGK321>科棉3号>泗棉3号。甜菜夜蛾2～5龄幼虫对棉花的趋性强弱顺序为泗棉3号>科棉3号>SGK321。     

Cry1Ac和Cry2Ab蛋白对大草蛉生长发育及酶活力的影响

为明确转Cry1Ac和Cry2Ab基因棉花对大草蛉的影响,运用Bt蛋白与人工饲料混合的方法,以大于转基因棉花叶片中蛋白含量20倍的剂量饲喂大草蛉初孵幼虫,初步研究了Cry1Ac和Cry2Ab对大草蛉生物学参数和消化酶、解毒酶活性的影响。结果表明：取食含Bt蛋白饲料的大草蛉幼虫的发育历期、体重、蛹重、成虫体重、羽化率等生物学参数与对照相比均没有显著差异;在大草蛉幼虫体内可以检测到含量较高的Cry1Ac和Cry2Ab蛋白,分别为974.92~1 282.39 ng/g鲜重和5 592.62~6 082.92 ng/g鲜重,而在大草蛉成虫体内检测到的Cry1Ac和Cry2Ab蛋白含量非常低,分别为0.29~0.39 ng/g鲜重和50.34~56.71 ng/g鲜重;取食含Bt蛋白的饲料对大草蛉幼虫的类胰蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶、氨肽酶和谷胱甘肽-S-转移酶活性有一定的影响,但对大草蛉成虫影响与对照差异不显著。表明大草蛉取食含Bt蛋白的人工饲料后,虽然体内可以检测到一定含量的Bt蛋白,但对大草蛉的生长发育并没有显著的直接不利影响。     

马铃薯羧肽酶抑制剂与Cry1Ac毒素混用对棉铃虫中肠蛋白酶活性及杀虫活性的影响

为研发转多价抗虫棉,利用蛋白酶专性底物测定马铃薯羧肽酶抑制剂（potato carboxypeptidases inhibitor,PCI）和Cry1Ac毒素单用及混用后棉铃虫Helicoverpa armigera幼虫中肠内总蛋白酶、类胰蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶和羧肽酶的活性、羧肽酶A（carboxypeptidase A,CPA）和羧肽酶B（carboxypeptidase B,CPB）基因的相对表达量及对棉铃虫的杀虫活性。结果表明,饲喂20 μg/cm² PCI+1 μg/cm² Cry1Ac、40 μg/cm² PCI+5 μg/cm² Cry1Ac含药饲料后,棉铃虫3龄幼虫中肠内CPA活性分别为0.20 U/mg和0.16 U/mg,显著低于对照;总蛋白酶活性均为0.15 OD·min^-1·mg^-1,与对照差异不显著;类胰蛋白酶活性均为0.45 μmol·min^-1·mg^-1,均显著低于其他处理,CPB基因表达量较对照显著下调。饲喂20 μg/cm² PCI、40 μg/cm² PCI、1 μg/cm² Cry1Ac、5 μg/cm² Cry1Ac、20 μg/cm² PCI+1 μg/cm² Cry1Ac、40 μg/cm² PCI+5 μg/cm² Cry1Ac含药饲料后,CPB活性分别为0.26、0.26、0.24、0.26、0.27和0.26 U/mg,与对照差异不显著;棉铃虫3龄幼虫中肠内类胰凝乳蛋白酶活性分别为0.48、0.39、0.42、0.41、0.40和0.45 μmol·min^-1·mg^-1,6者之间差异不显著,但均显著低于对照;棉铃虫3龄幼虫中肠内CPA基因表达量均较对照显著上调。饲喂20 μg/cm² PCI+0.02 μg/cm² Cry1Ac、40 μg/cm² PCI+0.02 μg/cm² Cry1Ac、20 μg/cm² PCI+0.06 μg/cm² Cry1Ac、40 μg/cm² PCI+0.06 μg/cm² Cry1Ac含药饲料后,棉铃虫初孵幼虫实际校正死亡率分别为66.54%、68.28%、77.74%和85.76%,均高于其预期校正死亡率,表明PCI和Cry1Ac两者对杀虫活性表现为独立作用和增效作用,两者可共同用于棉铃虫幼虫的防治。     

我国棉铃虫对Bt蛋白Cry1Ac抗性现状及分子机制研究进展

棉铃虫Helicoverpa armigera是一种全球性的重要农业害虫,主要为害棉花、玉米和大豆等作物。长期种植单价Bt棉花（表达Cry1Ac蛋白）会使棉铃虫田间种群承受单一、持续的选择压力,必然会导致棉铃虫对Cry1Ac的抗性发生演化。该文概述我国棉铃虫田间种群对Cry1Ac的抗性现状、自然庇护所对棉铃虫Cry1Ac抗性演化的延缓作用以及棉铃虫对Cry1Ac抗性的遗传多样性,并对今后我国关于棉铃虫Bt抗性的治理对策进行了展望。     

棉铃虫四个丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的克隆与表达分析

为明确棉铃虫Helicoverpa armigera丝氨酸蛋白酶抑制剂（serine protease inhibitor,serpin）的种类及其表达特性,利用PCR技术克隆棉铃虫的serpin基因,使用生物信息学软件预测其结构并进行系统进化分析,采用实时荧光定量PCR（real time quantitative PCR,RT-qPCR）技术比较serpin基因在棉铃虫不同发育阶段和组织中的表达量及取食Cry1Ac后其表达量的变化。结果表明,共获得serpin-a、serpin-b、serpin-c、serpin-e四个棉铃虫serpin基因,全长为1 119~1 254 bp,编码373~418个氨基酸,均包含一段具有反应中心环的保守结构域,且与斜纹夜蛾Spodoptera litura、草地贪夜蛾S.frugiperda等鳞翅目昆虫serpin的同源性较高。serpin-a和serpin-e在棉铃虫4龄幼虫期的表达量最高,serpin-b和serpin-c分别在成虫期和蛹期表达量最高。serpin-a在中肠和围食膜中表达量最高,serpin-b在头、中肠和表皮中表达量最高,serpin-c在头部表达量最高,serpin-e在中肠和血淋巴中的表达量显著高于其他组织。棉铃虫取食低浓度Cry1Ac后,中肠的serpin-b和serpin-e的表达量显著增加。推测不同serpin基因在棉铃虫不同发育时期和组织中可能发挥不同的作用,其中serpin-b和serpin-e可能参与棉铃虫对Cry1Ac的解毒过程。     

转Bt基因棉田棉铃虫对气候变暖与集约化种植的不对称响应

为明确全球气候变暖及农业集约化对转Bt基因棉田棉铃虫Helicoverpa armigera种群发生的影响,通过收集1987—2017年我国山东、河南及河北3省的棉花种植面积、棉铃虫发生面积及年平均温度,采用单因素方差分析法及广义线性模型分析比较转Bt基因棉花推广前后棉田棉铃虫种群的发生程度,分析棉铃虫的为害指数。结果显示,转Bt基因棉花推广前,山东、河南和河北3省的棉铃虫在严重发生年份的为害指数较轻微发生年份均显著增加,分别增加了1.01倍、2.03倍和69.33%;温度距平具有同样的趋势,严重发生年份的温度距平较轻微发生年份分别显著增加了1.91倍、2.33倍和2.29倍。转Bt基因棉花推广后,山东、河南和河北3省的棉铃虫在严重发生年份的为害指数较轻微发生年份仍显著增加,分别增加了1.47倍、1.92倍和1.25倍;温度距平表现出相反的趋势,轻微发生年份的温度距平较严重发生年份分别增加了2.00倍、1.94倍和2.01倍;而河南省和河北省在棉铃虫严重发生年份的棉花种植面积较轻微发生年份分别显著增加了75.94%及38.92%。表明转Bt基因棉花种植后显著改变了棉铃虫对全球气候变暖的响应,气候变暖降低了棉铃虫的为害指数,而棉花集约化种植增加了棉铃虫的为害指数。非转基因棉田的棉铃虫受自然因素的影响,转Bt基因棉田的棉铃虫受自然及人为因素的双重影响。     

The effects of diet on the detection of resistance to Cry1Ac toxin in Australian Helicoverpa armigera Hübner (Lepidoptera: Noctuidae)

The effects of raw or heat-denatured soybean flour in an artificial diet on the detection of Cry1Ac resistance in Helicoverpa armigera were examined. Resistant neonate larvae reared on denatured soybean flour diet showed resistance factors of 7980 and 16,901 at the LC₅₀ and LC_99.9 levels, respectively. By comparison, resistance could not be detected in neonate larvae reared on raw flour diet. Third instar larvae reared on denatured flour diet showed resistance factors of 322 and 21,190 at the LC₅₀ and LC_99.9 levels. Resistance was not detected in third instar larvae reared on raw flour diet. There was 68% survival of resistant neonate larvae on Bollgard II cotton leaf feeding assays, compared to 100% mortality in a susceptible strain. We conclude that detection of CRY1Ac resistance in H. armigera from Australia can be masked, if an artificial diet gives chronic exposure to potent, protease inhibitors present in raw soy flour.     

棉铃虫对Cry1Ac抗性的稳定性及其对适合度的影响

为明确棉铃虫Helicoverpa armigera（Hübner）对苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis（Bt）Cry1Ac毒蛋白抗性的稳定性及其适合度变化,利用生物测定的方法研究了Cry1Ac抗性品系棉铃虫转到正常饲料饲养后的抗性衰退及再次筛选后抗性的恢复情况,并比较了敏感、抗性和抗性衰退后各品系间的适合度差异。在失去选择压的情况下,高抗品系棉铃虫对Cry1Ac的抗性迅速衰退,经过4代后抗性水平由最初的3626.67倍下降到1436.67倍;到第12代时抗性水平已低于10倍,随后品系保持较稳定的低抗水平;当重新进行抗性再筛选时,其抗性水平可快速恢复,抗性倍数快速回升,5代后恢复到1123.33倍。与敏感品系相比,高抗棉铃虫品系的适合度明显降低,相对适合度仅为0.33,但转到正常饲料连续饲养14代后,棉铃虫适合度明显上升,相对适合度为0.87,主要表现为卵孵化率和幼虫存活率等显著提高。     

Cry1Ac毒素对小菜蛾幼虫中肠蛋白酶和羧酸酯酶活性的影响

为了明确Cry1Ac毒素对小菜蛾Plutella xylostella幼虫中肠蛋白酶和羧酸酯酶活性的影响,利用蛋白酶专性底物测定其中肠各蛋白酶活性在不同缓冲液中的最适pH,并用不同浓度Cry1Ac毒素饲喂小菜蛾幼虫后测定该毒素的致死中浓度LC_(50),观察中肠蛋白酶和羧酸酯酶活性的变化,分析Cry1Ac毒素与昆虫中肠酶活性间的关系。结果表明,小菜蛾幼虫中肠总蛋白酶在Tris-HCl、KH_2PO_4/NaOH和Glycine/NaOH三种缓冲液中最适pH均为11.0;强碱性胰蛋白酶的最适pH分别为10.0、10.5和10.5;弱碱性胰蛋白酶的最适pH均为8.5;胰凝乳蛋白酶的最适pH分别为8.5、9.0和9.0。Cry1Ac毒素对小菜蛾的致死中浓度LC_(50)为0.343μg/mL。用不同浓度Cry1Ac毒素饲喂小菜蛾幼虫后,其中肠各蛋白酶活性均随时间的变化而变化。弱碱性胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的活性明显升高,且随浓度升高呈上升趋势;在取食36~72 h期间低浓度处理组的羧酸酯酶活性与对照组间无显著差异,而高浓度处理组羧酸酯酶活性显著高于对照组。表明Cry1Ac毒素能够显著影响小菜蛾的中肠蛋白酶和羧酸酯酶活性。     

核型多角体病毒与中红侧沟茧蜂对寄主棉铃虫的联合效应

为明确寄生蜂中红侧沟茧蜂Microplitis mediator与核型多角体病毒（nucleopolyhedrovirus,NPV）对寄主棉铃虫Helicoverpa armigera的联合效应,测量中红侧沟茧蜂和NPV单处理及复合处理后棉铃虫幼虫的形态学指标,并统计棉铃虫幼虫死亡率及寄生蜂中红侧沟茧蜂子代存活率。结果显示,处理3 d和5 d后,中红侧沟茧蜂和NPV单处理及复合处理的棉铃虫幼虫体长、体宽、头壳宽度、体重均显著低于对照,但各处理之间差异不显著。接入浓度为2.5×10⁴ OBs/mL和2.5×10⁶ OBs/mL NPV时,中红侧沟茧蜂和NPV这2种生防因子对棉铃虫均表现为拮抗效应或累加效应。接入浓度为2.5×10⁴ OBs/mL NPV时,先寄生后接毒和先接毒后寄生处理的棉铃虫实际死亡率分别为4.35%和14.26%;接入浓度为2.5×10⁶ OBs/mL NPV时,棉铃虫实际死亡率则分别为31.55%和94.19%,先接毒后寄生处理的棉铃虫实际死亡率均显著高于先寄生后接毒处理的实际死亡率。接入浓度为2.5×10⁶ OBs/mL NPV时,先寄生后接毒和先接毒后寄生处理的寄生蜂子代存活率分别为54.51%和3.71%,前者显著高于后者。表明中红侧沟茧蜂寄生和NPV侵染均能显著抑制棉铃虫的生长发育,但两者联合应用时拮抗效应明显且对寄生蜂子代有影响,同时用于生物防治棉铃虫时应谨慎。