猪圆环病毒2型抗体胶体金免疫层析检测方法的建立

为建立便捷、快速检测猪圆环病毒2型(PCV2)抗体的免疫层析方法,本研究利用G蛋白标记胶体金制备金标垫,以PCV2病毒样颗粒(VLPs)和兔Ig G分别作为检测线与质控线组装胶体金试纸条。检测结果显示,该试纸条与A型塞内卡病毒(SVA)、猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)等猪其它病毒抗体阳性血清无交叉反应,仅对PCV2抗体阳性血清具有高度的特异性;对PCV 2阳性血清最低检测限为1∶6 400稀释度,敏感性较高;批内、批间变异系数CV均小于5%,重复性较好。试纸条在4℃保存6个月,其特异性和敏感性无明显变化。对采集的100份临床血清样品进行检测,该方法与标准ELISA的总符合率为98%。表明本研究建立的PCV2抗体的胶体金免疫层析检测方法具有敏感、特异、稳定等特点,可以做为评价PCV2疫苗免疫效果及其感染筛查的检测方法。     

检测猪圆环病毒2型抗体SPA胶体金免疫层析方法的建立

采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,并将其标记SPA,将金标SPA包被至玻璃纤维膜上,将猪圆环病毒2型（PCV-2） Cap蛋白、抗SPA抗体分别包被至硝酸纤维素膜的检测线与质控线上,建立了一种检测PCV-2抗体的胶体金免疫层析方法。检测阳性样品时,在检测线和质控线处均出现红色条带;检测阴性样品时,仅在质控线处出现红色条带。该方法与ELISA相比,其灵敏度为89.19%,特异性为100%,并且与PCV-1、猪瘟病毒（HCV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪细小病毒（PPV）阳性血清无交叉反应。     

猪伪狂犬病病毒gE抗体胶体金免疫层析检测方法的建立及应用

以纯化的抗人红细胞单链抗体(ScFv)-猪伪狂犬病病毒(PRV)gE蛋白双功能融合蛋白为诊断抗原和胶体金标记物,以羊抗猪IgG包被硝酸纤维膜作为质控带,制作检测猪伪狂犬病毒gE抗体的双抗原胶体金试纸条。利用方阵滴定试验筛选出金标抗原最佳工作浓度为17.6μg,检测线诊断抗原最佳标记量为1.76μg,血清最佳稀释度为1∶10,作用时间15 min,与猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪布鲁菌(Brucella)阳性血清和PRVgE缺失疫苗接种的猪免疫血清检测线均不出现红色条带,与PRV标准阳性血清反应检测线出现红色条带。试纸条操作简单,肉眼于15 min内可判定结果;试纸条在室温保存6个月,其特异性和敏感性没有明显变化;与美国IDEXX和法国LSI gE-ELISA抗体检测诊断试剂盒检测结果比较,1 164份猪血清的符合率均为90.55%。制备的胶体金试纸条具有操作简便、敏感性和特异性较高的特点,可用于PRV野毒感染的快速筛查。     

猪圆环病毒2型抗体胶体金免疫层析检测方法的建立及应用

为快速灵敏地检测血清中猪圆环病毒2型(PCV2)的抗体水平,本研究以PCV2-YW株基因组为模板扩增PCV2-dCap基因,原核表达去除N端41个氨基酸的PCV2重组衣壳蛋白(dCap).将dCap标记胶体金颗粒制备金标垫,将重组Protein A和兔抗dCap多克隆抗体喷涂于硝酸纤维素膜(NC膜)作为检测线(T线)和...     

利用多肽抗原建立同时检测 CSFV 和PRRSV 抗体的胶体金免疫层析方法

利用合成多肽作为抗原,建立一种同时检测猪瘟病毒（CSFV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）抗体的胶体金免疫层析方法。用人工筛选合成的 CSFV 多肽和 PRRSV 多肽葡聚糖偶联物作为包被抗原,以多肽-Biotin-链霉亲和素作为胶体金标记物,羊抗猪 IgG 包被硝酸纤维膜作为质控带,建立了同时检测CSFV 和 PRRSV 抗体的胶体金免疫层析方法（GICA）。结果表明,多肽与葡聚糖和生物素的偶联效率较高,分别为84．65％和91．37％;链霉亲和素与胶体金结合最佳 pH 和最佳标记量分别为8．2μg／mL 和30μg／mL。试纸卡灵敏度试验表明,血清1∶80稀释仍可检出,与 Idexx ELISA 试剂盒检出结果基本一致,特异性良好,不与伪狂犬病病毒、口蹄疫病毒、猪圆环病毒和细小病毒的阳性血清发生交叉反应。与 Idexx ELISA 试剂盒平行检测结果表明,CSFV 抗体总体符合率为86．36％;PRRSV 抗体总体符合率为83．33％。说明利用偶联多肽制备的试纸卡灵敏度高,特异性好,能够同时检测两种病毒抗体,适于基层养殖场使用。     

检测猪瘟病毒野毒株胶体金免疫层析方法的建立

为建立快速、简便检测猪瘟病毒(CSFV)野毒的胶体金免疫层析方法(GICA),本研究采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记纯化的抗CSFVE2蛋白的单克隆抗体(MAb)6E10作为捕捉抗体,将纯化的抗CSFVE2蛋白的MAbHQ06和兔抗鼠IgG抗体包被在硝酸纤维素膜上,分别作为检测线和质控线,优化反应条件,组装成胶体金免疫层析试纸条。结果表明,所制备的试纸条用于检测CSFV野毒感染的PK-15细胞培养物,在检测线和质控线处均呈现红色条带,健康PK-15细胞培养物对照仅在质控线呈现红色条带;试纸条检出病毒培养物的最低限为103.5 TCID50;用不同批次的试纸条重复检测,结果无差异;该试纸条不与猪瘟兔化弱毒(HCLV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(PRV)、伪狂犬病病毒(PrV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)反应。所制备的试纸条具有良好的特异性、敏感性和重复性,初步达到了区分检测CSFV野毒株和弱毒株的目的。     

柱状黄杆菌胶体金免疫层析快速检测方法的建立

为建立一种通过胶体金免疫层析技术快速检测柱状黄杆菌的方法,试验采用柠檬酸三钠还原法制备粒径为20 nm的胶体金颗粒,将其标记纯化的抗柱状黄杆菌单克隆抗体(McAb)制备出金标抗体结合垫。纯化的兔抗柱状黄杆菌多克隆抗体(PcAb)和羊抗鼠IgG分别包被在硝酸纤维素膜的检测线(T)与质控线(C)上,制备出胶体金免疫层析试纸条,并对试纸条的灵敏度、特异性及稳定性进行测定。结果显示,该试纸条检测灵敏度为1×10³ CFU,检测时间为3.5 min,制备的试纸条与迟钝爱德华氏菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌均无交叉反应,且稳定性好。本研究首次成功建立了柱状黄杆菌胶体金快速检测方法,所制备的试纸条具有灵敏、特异、稳定、快速等优点,可用于柱状黄杆菌的检测。     

胶体金免疫层析检测牛结核γ干扰素方法的建立

牛结核病是一种重要的人畜共患病,尽管许多国家已经实施了牛群净化,但其仍然威胁人类的公共卫生健康。本研究利用抗牛γ干扰素特异性单克隆抗体,通过免疫金标记技术,建立了胶体金免疫层析试纸条检测牛γ干扰素的方法。研充结果证明,该方法对牛γ干扰素具有高度特异性,与其它动物干扰素没有交叉反应,检测牛γ干扰素的灵敏度与进口ELISA试剂盒相当。试纸条在室温保存6个月、4℃保存12个月,其特异性及灵敏度没有明显变化。对田间送检的23份全血经结核特异性刺激后进行检测,结果与进口结核ELISA试剂盒符合率为91．3％。研究表明,本研究建立的牛γ干扰素免疫层析检测方法具有特异、敏感、稳定、操作简单快捷等特点,适合用于牛结核的快速特异检测。     

猪瘟病毒胶体金免疫层析检测方法的建立及应用

为建立一种猪瘟病毒的快速检测方法，采用柠檬酸三钠还原氯金酸制备胶体金，选择15nm胶体金标记兔抗猪瘟病毒抗体，对胶体金标记抗体采用低温超速离心法进行纯化，组装免疫层析试纸条。用试纸条对猪瘟可疑病料进行检测，同时用直接荧光抗体试验和RT—PCR做平行试验。结果显示，用试纸条检测猪瘟病毒，10min左右即可显示结果，试纸条、直接猪瘟荧光抗体试验和RT—PCR的阳性检出率依次为36．36％（4／11）、45．45％（5／11）和72．72％（8／11）。表明，用胶体金免疫层析试纸条检测猪瘟病毒操作简便，需时短，可以用于猪瘟的流行病学调查。     

猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的制备及胶体金免疫层析检测方法的建立

为了建立快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的胶体金免疫层析方法(GICA),本研究用PEDV免疫BALB/c小鼠,制备杂交瘤细胞。分别采用间接ELISA和表面荧光吸附法(CSFIA)筛选,共得到33株能够稳定分泌抗PEDV单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株。通过制备小鼠腹水并纯化后测得其中21株细胞分泌的MAb的ELISA效价在1∶1.6×10~4以上,且均仅与PEDV反应,不与TGEV和PRV反应,特异性较强。采用双抗体夹心ELISA法筛选出能够配对检测PEDV的MAb有5株,以其中的4H7为检测抗体、5A9为俘获抗体初步建立了检测PEDV的GICA。该GICA特异性试验结果显示,除了PEDV检测结果为阳性外,该方法对伪狂犬病病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和传染性胃肠炎病毒的检测结果均为阴性,特异性较强;该方法针对PEDV的最低检测限为7.8×10~3TCID_(50)/mL,敏感性较高;批内和批间重复性检测样品结果无明显差异,具有较好的重复性;将该方法和RT-PCR方法同时检测115份临床样品,该方法与RT-PCR阳性符合率为93%。本实验制备的PEDV MAb,以及基于该AMbs初步建立的检测PEDV的GICA为开发快速检测PEDV的胶体金免疫层析试纸条奠定了基础。     

检测莱克多巴胺胶体金免疫层析试验的建立

采用混合酸酐法制备莱克多巴胺-OVA偶联抗原,胶体金标记莱克多巴胺单克隆抗体,建立了检测莱克多巴胺的胶体金免疫层析试验。该试验具有较好的敏感性和特异性,最低可检测10ng/mL的莱克多巴胺,而与克伦特罗和沙丁醇胺无交叉反应。胶体金免疫层析试验对尿液和饲料样品中莱克多巴胺的最低检测量分别为10ng/mL和0.01mg/kg。     

胶体金免疫层析试纸条与ELISA检测猪蓝耳病抗体的比对试验

胶体金免疫层析试纸条检测猪蓝耳病抗体的结果中强阳性、中阳性、弱阳性、阴性分别为48.67%、18.58%、31.86%、0.88%,检测猪蓝耳病抗体合格率99.12%;ELISA检测猪蓝耳病抗体合格率95.58%,符合率为96.43%。胶体金免疫层析试纸条能够评价猪蓝耳病疫苗临床免疫状况,可进行猪蓝耳病抗体的定性检测。     

犬细小病毒血凝抑制抗体效价胶体金免疫层析检测方法的建立及应用

试验旨在利用胶体金免疫层析技术建立快速检测犬血清中犬细小病毒（canine parvo virus, CPV）血凝抑制（haemagglutination inhibition, HI）抗体效价的方法,用于CPV疫苗免疫效果评价。采用双抗体夹心法,以抗CPV血凝相关抗原的单克隆抗体制备CPV抗原检测试纸条;将犬血清进行不同比例系列稀释后,分别与定量CPV抗原充分反应,滴入CPV胶体金试纸条,根据试纸条检测线（test line,T线）消失时的血清最高稀释倍数判断血清中CPV抗体的HI效价;用此方法检测86份犬血清样品,并与传统血凝抑制试验方法进行分析比较。结果显示,成功制备CPV抗原检测试纸条,确定了试纸条检测犬血清CPV-HI效价的反应条件和结果判定标准。结果表明,在检测不同稀释倍数犬血清反应后的CPV抗原时,能使试纸条T线消失时的血清最高稀释倍数与HI效价具有正相关性,犬血清最高稀释倍数乘以4即为HI效价;两种方法的符合率达90.7%。本试验初步建立了胶体金试纸条检测CPV血凝抑制效价的方法,为检测CPV-HI效价提供了一种操作简单、快速的试验方法,可用于CPV疫苗免疫效果评价。     

绵羊肺炎支原体抗体ELISA检测方法的建立

为了建立特异性好和敏感性高的绵羊肺支原体抗体ELISA检测方法,以绵羊肺炎支原体Y98标准菌株的全菌蛋白作为抗原,进行了反应体系和反应条件的优化筛选。结果显示:最佳蛋白抗原包被浓度为1.52μg/mL,最适封闭液及其稀释浓度为1%BSA,血清样品的稀释度为1/50,兔抗山羊IgG的最适稀释浓度为1/4 000,一抗和二抗的最佳作用时间为37℃60 min,底物显色的最佳时间为10 min;通过与绵羊肺炎支原体抗体间接血凝试验(IHA)检测结果相比,60份羊血清样品中Y98 ELISA检出阳性为33份,阴性为20份,二者的检测符合率可达到88.33%,相对特异性达90.90%。提示:建立的绵羊肺炎支原体血清抗体检测方法具有较高的检测敏感性和特异性,为绵羊肺炎支原体的抗体检测及其感染的流行病学调查提供了一种快速简便的检测工具。     

胶体金免疫层析法检测猪PRV gE抗体方法的建立及应用

利用PCR技术从猪伪狂犬病毒基因组中克隆gE抗原表位基因，并将其插入到载体pET-22b（＋）中，构建成原核表达质粒pET-22b（＋）-gE，使其在E．cobBL21（DE3）中诱导表达，经瘫点杂交证实表达产物具有抗原性。表达产物纯化后作为抗原，结合胶体佥标记技术，运用双抗原夹心法于国内首先建立了猪PRV gE抗体检测的免疫层析试纸务。该方法操作简单灵敏度高、特异性好，适合猪伪狂犬病的临床诊断。     

猪支原体肺炎双抗体夹心ELISA方法的建立

正猪肺炎支原体(MPS)是由猪支原体肺炎(Mhp)引起的猪地方流行性肺炎,该病是一种接触性慢性呼吸道传染病。猪只感染后会降低饲料转化率,影响生长发育,并引起其他病毒及细菌的继发感染。该病流行于世界各地,对养猪产业造成了严重的经济损失。(1)由猪肺炎支原体所引起的猪气喘病普遍存在于养殖业发达的国家,该病一直以来是困扰我国养殖业发展的重要疾病。     

猪支原体肺炎双抗体夹心ELISA方法的建立

猪肺炎支原体（MPS）是由猪支原体肺炎（Mhp）引起的猪地方流行性肺炎,该病是一种接触性慢性呼吸道传染病。猪只感染后会降低饲料转化率,影响生长发育,并引起其他病毒及细菌的继发感染。该病流行于世界各地,对养猪产业造成了严重的经济损失。（1）由猪肺炎支原体所引起的猪气喘病普遍存在于养殖业发达的国家,该病一直以来是困扰我国养殖业发展的重要疾病。     

可视化猪肺炎支原体LAMP检测方法的建立

由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)引起的慢性肺炎是最难净化的疫病之一,它流行广、感染率高,对养猪业危害巨大。为了加强口岸现场查验动物源性产品中猪肺炎支原体的力度,本研究建立了猪肺炎支原体环介导等温核酸扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法。本研究通过在LAMP反应产物中加入显色液,提高了检测结果肉眼判定的准确性,实现了结果判定可视化的目标,有助于出入境口岸货物查验现场及猪场中猪肺炎支原体的检测。     

猪圆环病毒2型胶体金抗体检测方法的建立

为建立检测猪圆环病毒2型(PCV2)胶体金检测方法,本研究对SPA蛋白进行胶体金标记,并喷涂于玻璃纤维上制备金标垫,分别以重组PCV2 ORF2蛋白和猪IgG作为检测线和质控线,制作PCV2抗体检测胶体金免疫层析试纸条。检测结果表明,试纸条操作简单,肉眼于10 min内可以判定结果,对PCV2免疫血清具有高度特异性,与猪其它病毒免疫血清无交叉反应,检测灵敏度与ELISA相近。试纸条在室温保存6个月,其特异性及灵敏度无明显变化。对临床采集的324份血清样品进行检测,结果与ELISA试剂盒总符合率为98.77%。表明本研究建立的PCV2抗体免疫层析检测方法具有特异、敏感、稳定、操作简单快捷等特点,适合于PCV2抗体的现场检测。