荔枝霜疫霉自噬相关基因的鉴定与表达分析

 细胞自噬(Autophagy)是一种真核生物中高度保守的胞内物质降解和循环再利用的生理过程,其调控细胞动态平衡、压力适应和细胞程序性死亡,与植物病原真菌生长发育、孢子形成、侵染等一系列过程密切相关。荔枝霜疫霉(Peronophythora litchii)侵染引起的荔枝霜疫病严重危害荔枝生产及采后贮藏。本研究利用模式物种中已知的自噬相关蛋白,采用同源比对的方法在荔枝霜疫霉基因组数据库中鉴定到19个同源蛋白,分属16种蛋白类型。分析基因结构和蛋白保守功能域,发现荔枝霜疫霉自噬相关基因均具有内含子,且数目差异明显;所鉴定候选蛋白都具有相应分组的保守功能域,而PlATG1a在C端具有2个额外的ATG11功能域,PlATG11则在其N端包含1个APG17功能域。进一步对具有核心功能且多成员的自噬相关蛋白ATG1、ATG6、ATG8和ATG18进行系统进化和序列模块分析发现,这些蛋白在不同物种之间十分保守,但是其同源蛋白间存在分化。通过转录组数据分析和qRT-PCR验证结果显示,荔枝霜疫霉中自噬相关基因在生长发育和侵染阶段均有表达,与菌丝阶段相比,PlATG1a、 PlATG2、PlATG3、PlATG6a、PlATG8、PlATG18a基因在游动孢子阶段特异上调表达,其中PlATG8最为显著;PlVPS34在孢子囊阶段特异诱导表达,PlATG1b、PlATG12、PlATG17在孢子囊与游动孢子阶段上调表达但是在侵染阶段下调表达;PlATG6b、PlATG9、PlATG10、PlATG13、PlATG14及PlVPS15基因在生长发育和侵染阶段均表现出不同程度的上调表达,PlATG7、PlATG11、PlATG18b 则在侵染阶段显著下调表达。结果表明,细胞自噬可能参与调控荔枝霜疫霉的生长发育及致病过程。     

荔枝霜疫霉中双组分信号转导系统的鉴定与表达分析

荔枝霜疫霉(Peronophythora litchii)隶属于茸鞭生物界卵菌门疫霉属,由其引起的荔枝霜疫病是目前荔枝生产上一种最重要的病害,严重影响荔枝产量和鲜果品质。双组分信号途径在微生物中参与多种生命活动,但是在卵菌中尚未有相关研究。本研究通过生物信息学分析在荔枝霜疫霉中鉴定到2个杂合型组氨酸激酶(PlHK1、PlHK2)和1个响应调控蛋白(PlRR1)。其在卵菌中是保守存在的,并且与真菌在进化上相对独立。功能域分析表明,PlHK1和PlHK2的C端额外的融合了1个磷酸转移功能域(Hpt),这与真菌和植物的存在显著差异。转录分析表明3个基因在荔枝霜疫霉侵染阶段上调表达,并且响应渗透胁迫和氧化胁迫。以上结果揭示了双组分信号系统可能在疫霉致病过程中发挥重要作用。     

大雄疫霉与大豆疫病

前言大雄疫霉为藻菌纲、霜霉目、腐霉科、疫霉属真菌的一个种。在近代分类史上,真菌学家们虽根据其孢子形态和致病性等对此菌进行了多次分类与修订,在种内又区分出几种形态和致病性不同的类型,而大豆疫病菌仅是其中的一种。伴随着大雄疫霉菌的分类进展,致使大豆疫病菌的命名也发生了相应的变化:由Phvtophthora megasperma 发展为 P.     

荔枝霜疫霉中双组分信号转导系统的鉴定与表达分析

 荔枝霜疫霉(Peronophythora litchii)隶属于茸鞭生物界卵菌门疫霉属,由其引起的荔枝霜疫病是目前荔枝生产上一种最重要的病害,严重影响荔枝产量和鲜果品质。双组分信号途径在微生物中参与多种生命活动,但是在卵菌中尚未有相关研究。本研究通过生物信息学分析在荔枝霜疫霉中鉴定到2个杂合型组氨酸激酶(PlHK1、PlHK2)和1个响应调控蛋白(PlRR1)。其在卵菌中是保守存在的,并且与真菌在进化上相对独立。功能域分析表明,PlHK1和PlHK2的C端额外的融合了1个磷酸转移功能域(Hpt),这与真菌和植物的存在显著差异。转录分析表明3个基因在荔枝霜疫霉侵染阶段上调表达,并且响应渗透胁迫和氧化胁迫。以上结果揭示了双组分信号系统可能在疫霉致病过程中发挥重要作用。     

大豆疫霉根腐病

 大豆疫霉根腐病是毁灭性病害之一,在我国近年有加重发展趋势。美国、澳大利亚和加拿大对Phytophthora sojae及大豆抗性研究较多,目前已建立了完善的生理小种体系,分离了30多个生理小种,最新定名小种为38和39号。RFLP研究表明,P.sojae的多数变异都可在小种1,7,17和19号中表现出来,因而推测其它小种可能是从这4个小种杂交派生而来,澳大利亚的P.sojae由美国传入。抗、耐病筛选方法有田间筛选法、接种体薄层法、斜板法、下胚轴接种法和豆荚接种法等。选出不少抗病材料,通过遗传研究定名了抗性基因Rps1、Rps-b、Rps-c、Rps1-d、Rps1-k、Rps2、Rps3、Rps3-b、Rps3-c、Rps4、Rps5、Rps6和Rps7等。Rps1-k是目前应用较广的抗性基因,它能抗20多个生理小种。抗性基因Rps1和Rps1-c从被利用到丧失抗性大约是8~10年的时间,按此推算几年之内Rps1-k基因也将丧失抗性,因此主张抗病基因和耐病基因结合使用,不同抗性基因结合使用。     

大豆品种(系)抗疫霉根腐病基因的连锁SSR标记分析

 大豆疫霉根腐病是大豆破坏性病害之一。利用抗病品种是防治该病的唯一有效的方法。迄今,已经鉴定了15个抗大豆疫霉根腐病基因(Rps基因),而且大豆部分基因都获得了不同类型的分子标记。本研究根据以前抗病基因推导结果选择26个可能含有Rps1基因座位等位基因或(和)Rps4基因的大豆品种(系),利用分别与Rps1a和Rps4紧密连锁的SSR标记进行抗病基因的分子检测,通过比较含有已知抗病基因对照大豆品种(系)分子标记检测结果并综合以往基因推导结果推断检测品种(系)的Rps基因。在选择的26个品种(系)中,长农14号被证明含有Rps1a,周豆13和铁95068-5含有Rps1a与Rps4基因组合,品系50794、科8924-3和合豆1号含有Rps4;有11个品种(系)存在含有Rps1a的证据、品系50052被推断含有Rps1c与Rps3b基因组合,但不排除这些品种(系)在Rps1座位含有一个新等位基因的可能性。另外,有7个品种(系)的所含抗病基因不能确定,它们可能含有新的Rps基因。     

安徽省大豆疫霉根腐病菌的鉴定及rDNA-ITS序列分析

为明确安徽省夏大豆疫霉根腐病的病原菌种类,对采集自涡阳、怀远、固镇3个县的夏大豆病株及土样分离纯化后获得28株菌株,选取6株代表性菌株,通过形态学观察及核糖体DNA-ITS序列分析对其进行鉴定,并测定了其致病型。结果表明,6株菌株在利马豆培养基上菌落白色,质地均匀;菌丝无隔,致密,具近直角分枝;在10%V8C培养液中,游动孢子囊顶生,不脱落,卵形至椭圆形,无明显乳突,有内层出现象,长宽比大于1.6∶1;同宗配合,在利马豆培养基上单株培养产生大量卵孢子,藏卵器球形,雄器大多侧生;接种合丰35大豆品种后出现典型的大豆疫霉根腐病症状。r DNA-ITS序列分析表明,6株菌株与Gen Bank中大豆疫霉Phytophthora sojae的ITS序列同源性高达100%;菌株GY4、GY8、HY11、HY16、GZ10、GZ21的毒力公式分别为1b,2,3a,3b,4,5,6,7;1b,1d,3a,3b;1d,3a,3b,3c,4,5,6,7;2,3c,4,5,6,7;1b,3a,3c,5,8;3a,3b,5,6,7,8;属于6个不同的致病型。研究表明,这6株菌株均为大豆疫霉。     

大豆疫霉根腐病菌生理小种鉴定及毒性分析

对采自黑龙江省、吉林省的42株大豆疫霉根腐病茵进行生理小种鉴定，其中11株可被分别鉴定为1号、3号和8号生理小种。1号小种为优势小种，3号、8号小种为国内首次报道。其余31株在鉴别寄主上出现中间类型反应无法鉴定小种，但可以划分为12个毒性类型，病原茵群体具有很高的毒性多态性，其中有些菌株毒性较强。     

大豆疫霉和大豆疫病

大豆疫霉和大豆疫病彭金火谭红赵改萍（大连动植物检疫局大连１１６００１）（国家动植物检疫局北京）由疫霉引起的大豆（ＧｌｙｃｉｎｅｍａｘＬ．）根腐和茎腐病（大豆疫病）于１９４８年最先见于美国的印第安纳州,公开报道则在１９５５年。Ｋａｕｆｍａｎｎ＆Ｇｅｒｄ...     

江苏口岸截获大豆疫霉菌的鉴定

采用叶碟诱捕法从江苏口岸进境的大豆所携带的土壤中,共分离了疫霉12株,选取6个菌株,对病原菌进行了形态特征、致病性、寄主范围鉴定。结果表明,形态观察为疫霉属真菌,接种大豆后可出现典型的大豆疫病症状,且人工接种只侵染大豆、豇豆和菜豆等少数豆科植物。采用大豆疫霉的特异性引物检测表明,所有12个菌株均能扩增出分子量为330bp的特异性条带。结合形态和致病性测定,这些病原菌鉴定为大豆疫霉(Phytophthorasojae)。     

大豆中疫霉诱导性GmDRRP基因启动子的克隆与功能分析

本研究根据大豆与疫霉互作的基因芯片数据,筛选了一个受疫霉诱导表达的大豆抗病相关基因(Gm DRRP,glycine max disease resistance response protein),并对其启动子响应疫霉侵染的功能进行了研究。序列分析表明该基因编码一个大豆抗病相关蛋白。分别用SA、Me JA、ABA、ETH和GA3五种激素处理后,发现该基因的表达受激素的抑制。克隆其转录起始位点上游1 590 bp的启动子区,生物信息学分析发现该区域包含多个已知与逆境响应相关的顺式元件。进一步将启动子构建在融合Gus报告基因的植物表达载体上,分别瞬时转化烟草和稳定转化大豆根毛,并检测了Gus报告基因的表达情况。结果表明,Gm DRRP启动子均能在两种体系中不同程度的受疫霉诱导,其表达模式为接种后0.5 h被快速诱导,并在2 h时显著提高。根据生物信息学对顺式元件的预测结果,对启动子进行了分段分析,获得了一个222 bp的小片段,其疫霉诱导表达能力是全长启动子的34%。以上结果表明大豆的Gm DRRP启动子能被疫霉快速诱导。     

土壤环境对大豆疫霉Phytophthora sojae卵孢子萌动的影响

为明确土壤环境对大豆疫霉Phytophthora sojae卵孢子萌动的影响,将增强型绿色荧光蛋白标记的大豆疫霉卵孢子以2 500个卵孢子/g干土的比例接种于无菌黑土中,荧光显微镜下计数卵孢子的萌动率以明确其最适宜的土壤温度和含水量;在此基础上,从5种类型土壤和5种轮作体系土壤中筛选适宜卵孢子萌动的土壤环境。结果表明,25℃土壤温度和30%土壤含水量最适合大豆疫霉卵孢子萌动,萌动率为95.78%;黑土和盐碱土分别是最适合和最不适合卵孢子萌动的土壤类型,萌动率分别为94.94%和14.67%;卵孢子萌动率与土壤有机质含量、p H值和Ca2+含量间无明显相关性。大豆连作田和玉米连作田土壤适合卵孢子萌动,萌动率为96.33%和95.00%,小麦连作田土壤不适合卵孢子萌动,萌动率仅为39.33%。     

非寄主和寄主种子分泌物对大豆疫霉活性的影响

为探寻非寄主和寄主种子分泌物中抗病信号分子,通过显微观察,采用菌丝生长速率法和离体接种法对不同种子分泌物处理后大豆疫霉Phytophthora sojae的游动孢子数、孢子囊数、游动孢子释放后残留的空囊数、成囊和未成囊的游动孢子数、萌发和未萌发的胞囊数、菌落直径、卵孢子数进行测量,并计算抑制率,明确非寄主菜豆和寄主大豆抗病品种、感病品种种子分泌物对大豆疫霉游动孢子趋化性、生长发育和侵袭力的影响。结果显示,非寄主菜豆种子分泌物不吸引大豆疫霉游动孢子,显著抑制大豆疫霉孢子囊形成、胞囊萌发和卵孢子产生,抑制率依次为97.3%、73.0%和17.5%,然后溶解胞囊,最终导致游动孢子对下胚轴侵袭力降低,抑制率为67.1%。寄主大豆种子分泌物能吸引大豆疫霉游动孢子,感病品种种子分泌物吸引力高于抗病品种。感病品种种子分泌物对大豆疫霉生长发育无显著影响,但促进大豆疫霉游动孢子侵袭力;抗病品种种子分泌物显著抑制大豆疫霉孢子囊形成、胞囊萌发和卵孢子产生,抑制率依次为86.6%、34.3%和12.8%,然后溶解胞囊,但作用强度小于非寄主菜豆种子分泌物,最终导致游动孢子对下胚轴的侵袭力降低,抑制率为24.2%。表明非寄主菜豆和寄主大豆抗病品种的种子分泌物对大豆疫霉有抑菌活性,大豆疫霉的非寄主和寄主抗病性与种子分泌物有关。     

Induced distal defence potentiation against Phytophthora sojae in soybean

Soybean phenylpropanoid defence responses to the wall glucan elicitor (WGE) fromPhytophthora sojae include the accumulation of phenolic polymers and glyceollin in cells immediately proximal to the point of treatment and the accumulation of conjugates of the isoflavones, daidzein and genistein, in distal cells. Since daidzein is a glyceollin precursor and genistein is both toxic to P. sojae and implicated in local potentiation of competency for the glyceollin response, it has been hypothesized that the distal cell response might raise the defence potential of cells distant from the infection court. In this paper, it is demonstrated that the WGE is indeed highly effective in protecting cells distal to the point of treatment from infection by P. sojae. Mycolaminaran, jasmonic acid (JA), methyl jasmonate and the ethylene precursor, 1-amino-cyclopropane carboxylic acid (ACC), are also effective, while salicylic acid (SA) is not. Methyl jasmonate, WGE and mycolaminaran are most effective, resulting in nearly complete protection against the pathogen even in the universally susceptible line, Williams. Dose response data revealed two distinct types of protection shared by all treatments. The first contains the pathogen to the point of inoculation, while the second is lesion limiting. Lesion limiting protection correlates very well with pre-infectional levels of genistein conjugates and accumulation of a specific peroxidase isozyme, P 2-4, and with post-infectional accumulation of glyceollin, suggesting that this type of protection may be the result of a distal potentiation of glyceollin elicitation competency. The mechanism underlying local containment protection is unknown, but it does not correlate well with any of the established phenylpropanoid responses.     

大豆疫霉MAPK基因的鉴定与转录分析

 疫霉菌包括大豆疫霉等重要植物病原物,属于茸鞭生物界卵菌门,在进化上与真菌相差甚远;由于分离培养与遗传转化等相对困难,目前对其生长发育和致病机理的研究相对滞后。本研究综合运用基因组学和转录组学方法,首先对植物病原卵菌与真菌的蛋白激酶特别是MAPK进行了鉴定和比较,然后对大豆疫霉MAPK的基因结构、蛋白功能域以及转录模式等进行深入分析。结果表明,植物病原卵菌比真菌含有更多的蛋白激酶(包括MAPK),且卵菌及其近缘物种硅藻的MAPK与真菌在进化上相对独立;大豆疫霉的14个MAPK中,4个具有非典型的磷酸化唇序列,7个含有PH、C2、WW、PAS等与细胞信号转导相关的其它功能域;转录分析表明,大部分MAPK可能在大豆疫霉生长发育与致病的整个过程或特定过程中发挥重要作用。本文通过对蛋白激酶特别是MAPK的分析揭示了植物病原卵菌(与真菌相比)在细胞信号转导网络与机制上的独特性与复杂性,可为进一步研究疫霉菌MAPK的生物学功能及其信号调控机制提供参考。     

德国鸢尾茎基腐病病原菌鉴定及生物学特性分析

为明确德国鸢尾Iris germanica茎基腐病病原菌及其生物学特性,利用组织分离法对采自云南省的感茎基腐病德国鸢尾样品进行分离和纯化,通过形态学特征和ITS、TUB2、EF-1α多基因序列分析对其进行鉴定,采用室内离体和活体接种法测定其致病性,并研究其生物学特性。结果表明,从25份发病德国鸢尾植株样本中分离得到15株菌株,依据形态学特征和显微观察,发现其中6株菌株形态特征一致,另外9株菌株形态特征一致,从中各选1株代表菌株YWMZ1、YWJB3进行接种后出现叶片萎蔫,茎基部腐烂,发病症状与田间一致。经形态学特征观察、多基因序列分析、致病性测定最终将代表菌株YWMZ1鉴定为木贼镰刀菌Fusarium equiseti,菌株YWJB3鉴定为尖孢镰刀菌F. oxysporum。2株菌株菌丝最适培养温度均为25℃;菌株YWMZ1和YWJB3最适pH分别为5和7;2株菌株在5种碳源和氮源上均可生长,其中菌株YWMZ1最适碳源为可溶性淀粉,YWJB3最适碳源为蔗糖,2株菌株均以硝酸钾为最适氮源;菌株YWMZ1和YWJB3最适光照条件分别为连续光照和12 h明暗交替。     

口红吊兰菌核病病原鉴定及其生物学特性分析

为鉴定1株分离自口红吊兰叶部病斑上的疑似核盘菌菌株,利用柯赫氏法则验证其致病性并通过形态观察和ITS序列分析对该病原菌进行分类鉴定,结合温度、酸碱度等生理指标研究其生物学特性,并利用菌丝生长速率法测定了扑海因、多菌灵、苯醚甲环唑、腐霉利4种药剂对该病原菌的抑制作用。结果显示:在PDA平板上该病原菌菌丝为白色,均匀生长;约7 d后开始产生菌核,直径3~5 mm;菌核萌发后可产生1~3个子囊盘,内含8个大小为8.0~12.0μm×4.0~5.5μm的子囊孢子。该菌株ITS序列系统进化分析结果显示,其与核盘菌的同源性高达99%。综上所述,初步确定该菌株为核盘菌Sclerotinia sclerotiorum。该病原菌在PDA培养基上的最适生长温度为20~25℃、最适生长p H为5~7。室内毒力测定发现供试4种药剂中扑海因对该病原菌菌丝生长有较好的抑制效果,且其EC_(50)最小,仅为0.62 mg/L,证明扑海因对核盘菌毒力最强。     

拮抗马铃薯晚疫病菌的高寒草地牧草内生细菌的鉴定及其生物功能测定

为获得对马铃薯晚疫病菌Phytophthora infestans具有拮抗效果的内生细菌,采用平板对峙法对21株分离自东祁连山高寒草地牧草的内生细菌进行抑菌能力测定,并结合形态学特征和16S r DNA基因序列同源性分析对拮抗菌株进行鉴定。结果表明,分离的21株内生细菌对马铃薯晚疫菌均有一定的抑制作用,其中262AY11、262AY6和264AY2抑菌效果最好,抑菌率分别为78.41%、78.03%和75.38%,根据16S r DNA基因序列分析将其分别鉴定为韦氏芽胞杆菌Bacillus weihenstephanensis、解淀粉芽胞杆菌B.amyloliquefaciens和枯草芽胞杆菌B.subtilis,在Gen Bank中的登陆号分别为KC414703、KC441759和HQ202817。262AY11和262AY6具有固氮能力;262AY6具有分泌IAA能力,在不含和含色氨酸的金氏培养基中产IAA的量分别为9.94 mg/L和14.79mg/L,且对马铃薯坏疽病菌Phoma foveata、马铃薯枯萎病菌Fusarium avenaceum和马铃薯炭疽病菌Colletotrichum coccodes的抑菌率分别为70.25%、62.38%和81.75%;264AY2对3种病原菌的抑菌率分别为67.09%、50.75%和75.99%。表明芽胞杆菌262AY11、262AY6和264AY2能有效抑制马铃薯晚疫病菌的生长,具有固氮和产IAA的生物学功能,且对另外3种马铃薯病原真菌也具有一定的生防潜力,可作为生防菌进行开发和利用。     

大豆疫霉RNA结合蛋白PsM90的基因功能研究

 真核生物的基因表达能够在转录与转录后等水平受到调控,以适应不同时空环境中的生长与发育等生物学过程,其中PUF家族RNA结合蛋白是一类具有保守PUM-HD(Pumilio homology domain)功能域的转录后调节因子,通过与靶标mRNA特异性结合控制其稳定性及翻译。本研究利用CRISPR/CAS9介导的疫霉菌基因组编辑技术,对大豆疫霉的PUF家族基因PsM90进行敲除和功能研究。结果表明,PsM90敲除突变体的卵孢子产量减少至野生型的32%,卵孢子壁明显变薄,卵孢子中的细胞器未能正常分化;游动孢子对大豆黄化苗下胚轴的致病力有所下降。此外,PsM90的敲除不影响营养菌丝生长、孢子囊发育、游动孢子释放和休止孢萌发等生物学性状。上述结果揭示了PsM90是大豆疫霉有性发育等过程的重要相关基因,为深入揭示卵菌中卵孢子发育这一独特生物学过程的分子调控机制奠定了基础。