利用双亲灭活原生质体融合技术选育高效苏云金芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌融合菌株

苏云金芽胞杆菌B7发酵液在药后96 h对小菜蛾2龄幼虫致死率高达85.06%;枯草芽胞杆菌TL2对黄瓜枯萎病和辣椒疫霉病有显著拮抗活性(对峙培养5 d对病原菌的平均抑制率在60%以上)。本文对菌株B7和TL2的原生质体形成、完全灭活及融合的最佳条件分别进行了筛选,研究结果表明菌株B7在溶菌酶1.0 mg/m L、酶解70 min的条件下,原生质体形成率和再生率最佳,分别为85.0%和29.41%;菌株TL2在溶菌酶1.25 mg/m L、酶解50 min的条件下,原生质体形成率和再生率最佳,分别为80.00%和25.00%。菌株TL2原生质体完全灭活的最佳条件为60℃水浴35 min,菌株B7原生质体完全灭活的最佳条件为紫外照射25 min。灭活后的两亲本融合最佳条件为30℃水浴融合20 min后涂布再生培养基,用影印法连续传代10次以上,最后筛选出17株稳定的融合子,经过杀虫防病检测最后筛选到一株兼具两亲本特性的高效融合子TLB15。TLB15发酵液在药后96 h对小菜蛾2龄幼虫校正死亡率为93.44%,TLB15发酵液对黄瓜枯萎病和辣椒疫霉病(对峙培养5 d)的平均抑制率分别为60.00%和62.79%。     

十字花科根肿病生防菌副地衣芽胞杆菌ZF480的鉴定及其防效

为有效防控十字花科蔬菜生产中的毁灭性病害——根肿病,以尖孢镰孢菌Fusarium oxysporum和辣椒疫霉Phytophthora capsici为指示菌,利用平板对峙法对分离自土壤的1 198株细菌进行筛选,进通过盆栽试验筛选对十字花科根肿病具有良好防效的生防菌株,并基于形态学特征、生理生化特性及16S rDNA、gyrB和atpD多基因系统发育分析对生防菌株进行鉴定,同时测定其抑菌谱和田间防效。结果表明,通过对峙培养筛选获得115株有抑菌效果的生防菌株,采用盆栽试验获得1株对根肿病菌具有拮抗效果的菌株,命名为ZF480。结合形态学特征和系统发育分析结果将该菌株鉴定为副地衣芽胞杆菌Bacillus paralicheniformis。菌株ZF480对野油菜黄单胞野油菜变种Xanthomonas campestris pv. campestris等10种病原菌具有拮抗效果,抑菌谱较宽,对白菜根肿病的盆栽防效和田间防效分别达到72.82%和64.08%。表明副地衣芽胞杆菌菌株ZF480对十字花科根肿病具有显著的防效,可作为生防菌进一步开发利用。     

苏云金芽胞杆菌分离过程中无晶体芽胞杆菌的分析

本研究选择了在苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis(Bt)分离过程中发现的与Bt芽胞相似、没有伴胞晶体的8株芽胞杆菌,对其种属、质粒等生物学特性和杀虫活性进行了初步研究.对分离菌株所产芽胞进行形态观察及质粒图谱分析,发现其与Bt相似;但肽指纹图谱分析和16S rDNA聚类研究表明所分离菌株与蜡样芽胞杆菌B.cereus(Bc)匹配最高;杀虫活性测定表明这8株菌对猿叶甲Colaphellus bowringi幼虫均无毒杀作用,而15-3、W23-1和W25-3 3个菌株及其培养上清液对小菜蛾Plutella xylostella幼虫有一定的杀虫活性,说明它们能产生活性物质.这些结果说明在Bt菌株的分离过程中要对无晶体菌株加以重视,其含有的活性物质具有潜在的研究和利用价值.     

小菜蛾对苏云金芽胞杆菌抗性研究进展

自１９９０年Ｔａｂａｓｈｎｉｋ首次报道小菜蛾田间种群对苏云金芽胞杆菌产生抗药性以来,国内外学者在小菜蛾对苏云金芽胞杆菌的抗性监测和抗性筛选、交互抗性、抗性遗传以及抗性机制等方面作了大量,深入的研究。本文对这些方面的研究进展作一综述。     

苏云金芽胞杆菌晶体毒素的多样性

苏云金芽胞杆菌是生物防治中应用最为广泛的一种杀虫剂,它对多种昆虫和其他一些无脊椎动物具有特异的毒杀活性。苏云金芽胞杆菌的杀虫活性主要来自于菌体在形成芽胞期间生成的伴胞晶体毒素,这些晶体毒素在结构和生物学功能方面表现高度的多样性。本文介绍了苏云金芽胞杆菌晶体毒素的分类、命名方法,深入讨论了晶体毒素的氨基酸序列、三维结构、靶标生物和杀虫机理的多样性。评价了各种分类方法的特点,并展望了晶体毒素作用机制研究和未来晶体毒素新基因的发掘。     

苏云金芽胞杆菌安全性的研究进展

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）是目前应用最为广泛的一类微生物农药。本文分析比较了我国及美国Bt产品登记和安全评价等情况,并对Bt制剂的风险评价进行了分析。Bt菌株不是人或其他哺乳动物的已知病原体,对哺乳动物无毒性、感染性和致病性;其种群数量在环境中呈逐渐减少趋势,无残留风险;对非靶标昆虫的生存和繁殖及土壤微生物群落结构无显著影响。     

生防芽胞杆菌脂肽抗生素研究进展

本文对生防芽胞杆菌脂肽抗生素的类群、特性,脂肽抗生素合成相关基因的基因工程研究以及脂肽抗生素的分离纯化、鉴定进行了概述。最后对该类抗生素的研究前景进行了展望。     

PhoR/PhoP双组分系统对枯草芽胞杆菌NCD-2菌落形态和芽胞形成的影响

 双组分PhoR/PhoP是枯草芽胞杆菌中普遍存在的以低磷为信号的调控系统。前期研究发现,PhoR/PhoP双组分系统正调控枯草芽胞杆菌NCD-2菌株脂肽类抗生素fengycin的合成,本研究分析了PhoR/PhoP双组分系统对NCD-2菌株菌落形态和芽胞形成的影响。在有机磷培养基上,NCD-2野生型菌株可以降解有机磷并且形成表面褶皱、立体结构较强的菌落形态,而phoR或phoP基因突变子丧失了降解有机磷的能力,菌落表面光滑、平坦。phoR和phoP基因突变子的互补菌株恢复到了与野生型相似的解磷能力和菌落形态。在低磷和高磷培养基中比较了NCD-2野生型及其衍生菌株的生长及芽胞形成情况,结果表明,在高磷培养基中,NCD-2野生型及其衍生菌株的生长速率没有差异,但在低磷培养基中,phoR和phoP基因突变子的菌体生长速率显著降低。芽胞形成能力测定结果表明,在低磷培养基中,NCD-2野生型菌株的芽胞形成率较高,而phoR和phoP基因突变子的芽胞形成率显著降低;在高磷培养基中,NCD-2野生型及其衍生菌株芽胞形成率普遍较低并且无显著差异。RT-PCR分析显示, phoR和phoP的突变均显著降低了芽胞形成相关基因spo II GA的表达,相比感应激酶PhoR,调控因子PhoP对spo II GA基因的影响更显著。     

短短芽胞杆菌B011基因组中芽胞形成调控基因spo0E的鉴定与表达分析

短短芽胞杆菌B011是一株具有广谱抗菌活性的植物内生菌,发酵后期形成芽胞。据报道,芽胞形成调控基因Spo0E的编码产物能对Spo0A～P蛋白因子去磷酸化,从而实现芽胞形成的负调控。为了能够进一步验证B011基因组中Spo0E基因的功能和表达情况,为B011菌株的遗传改造提供候选基因,本研究基于B011全基因组序列,通过生物信息学工具预测得到了9个spo0E类似基因,并与其他已公布全基因组序列的101个短芽胞杆菌Brevibacillus菌株进行比较,结果表明短短芽胞杆菌spo0E家族基因在物种分化前就已经存在。转录组测序结果表明,FO446＿19435和FO446＿04050两个spo0E家族基因在B011中高表达,表达模式表现为先升高,在发酵18 h达到最高,此后下降,这两个基因均存在SQELD基序,推测这两个基因为B011中的两个主效spo0E基因。研究结果可为短短芽胞杆菌B011的进一步开发和利用提供一定的基础。     

PhoR/PhoP双组分系统对枯草芽胞杆菌NCD-2菌落形态和芽胞形成的影响

 双组分PhoR/PhoP是枯草芽胞杆菌中普遍存在的以低磷为信号的调控系统。前期研究发现,PhoR/PhoP双组分系统正调控枯草芽胞杆菌NCD-2菌株脂肽类抗生素fengycin的合成,本研究分析了PhoR/PhoP双组分系统对NCD-2菌株菌落形态和芽胞形成的影响。在有机磷培养基上,NCD-2野生型菌株可以降解有机磷并且形成表面褶皱、立体结构较强的菌落形态,而phoR或phoP基因突变子丧失了降解有机磷的能力,菌落表面光滑、平坦。phoR和phoP基因突变子的互补菌株恢复到了与野生型相似的解磷能力和菌落形态。在低磷和高磷培养基中比较了NCD-2野生型及其衍生菌株的生长及芽胞形成情况,结果表明,在高磷培养基中,NCD-2野生型及其衍生菌株的生长速率没有差异,但在低磷培养基中,phoR和phoP基因突变子的菌体生长速率显著降低。芽胞形成能力测定结果表明,在低磷培养基中,NCD-2野生型菌株的芽胞形成率较高,而phoR和phoP基因突变子的芽胞形成率显著降低;在高磷培养基中,NCD-2野生型及其衍生菌株芽胞形成率普遍较低并且无显著差异。RT-PCR分析显示, phoR和phoP的突变均显著降低了芽胞形成相关基因spo II GA的表达,相比感应激酶PhoR,调控因子PhoP对spo II GA基因的影响更显著。     

地衣芽孢杆菌WIO发酵产生抗茵蛋白的研究

地衣芽孢杆菌BacilluslicheniformisW10是1株生防细菌,其能产生抗菌蛋白,对多种植物病原菌有较好的抑制效果。本试验研究了菌株W10产生抗菌蛋白的发酵条件,为工厂化生产工艺提供技术支持。试验结果表明,接种菌龄12h,2％接种量,发酵液pH7．0,发酵培养60h是菌株W10产生抗菌蛋白的适宜发酵条件。控制发酵温度有利于抗菌蛋白积累,第一段温度为30℃培养20h,第二段温度为28℃至发酵结束。最佳溶氧量为20％。2次补料发酵效果要高于分批发酵,补料为500mL含10g．L-1葡萄糖和5g·L-1蛋白胨的培养基;选用200mg·L-1聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚（GPE消泡剂,泡敌）为消泡剂。利用优化的控制条件发酵培养菌株W10,与优化前相比,对目标病菌的抑菌率增加了34．6％。     

地衣芽孢杆菌W10抗菌蛋白的分离纯化及其理化性质研究

 地衣芽孢杆菌W10是一株对多种植物病原菌有拮抗作用的生防细菌,其产生的抗菌物质主要是抗菌蛋白。细菌培养滤液用30%硫酸铵盐析,透析后再经SephadexG-75层析柱纯化得到一种具有抑菌活性的蛋白。该抗菌蛋白的分子量为46049.2Da;等电点为6.71;含有糖基,含糖量为6.83%;含有脯氨酸或羟脯氨酸;不含脂基。这种蛋白在pH6~12范围内均具有抑菌作用,pH6时活性最大;对热稳定,100℃以下水浴20min,抑菌活性与对照相比均在对照的80%以上,121℃蒸汽处理20min,活性虽有所下降,但仍达对照的65.7%;对胰蛋白酶和蛋白酶K不敏感,酶处理后蛋白的抑菌活性分别为对照的98.7%和98.3%;对氯仿和紫外线也不敏感,处理后活性仍达对照的91.0%和98.6%。     

芽孢杆菌对黄瓜霜霉病的防治效果研究

经黄瓜霜霉病孢子囊萌发抑制试验明确,芽孢杆菌菌株Z-X-3、Z-X-10对黄瓜霜霉病菌有较强拮抗作用。离体叶片法和温室防病试验表明,两菌株对黄瓜霜霉病有较好的防治效果,相对保护效果分别达46.42％、41.55％;治疗效果分别达46.30％、44.44％,高于农药克霜氰的31.81％、37.03％。     

基于原生质体转化的甘蔗梢腐病菌YN41基因敲除体系的构建

基因敲除技术日益成为基因功能研究的重要手段,为了深入研究甘蔗梢腐病菌致病基因的功能,构建了梢腐病菌YN41菌株的基因敲除体系。本研究构建了基于线性DNA的同源重组基因敲除技术,融合PCR构建敲除盒即带有潮霉素基因标记的线性DNA融合片段,配置0.05 g·mL^-1溶壁酶+0.01 g·mL^-1崩溃酶的复合酶液28℃酶解3 h获得了高产量的原生质体,利用聚乙二醇(PEG)介导的原生质体的转化,PCR鉴定技术和酶切鉴定技术对转化子进行鉴定,荧光定量PCR分析和Southern Blot方法进一步对基因缺失突变体进行验证,生物学表型(菌落形态、生长速率、产孢量、生物量和致病力)验证了PK基因敲除体系的成功构建。28℃酶解3 h获得了2×10⁷个·mL^-1原生质体;对编码丙酮酸激酶的PK基因进行了基因敲除验证,获得了纯合敲除突变体;荧光定量PCR检测转录水平无表达;Southern Blot结果显示使用PK基因探针杂交,基因缺失突变体无条带,野生型杂交到目的条带;生物学表型验证了PK基因敲除突变体对比野生型...     

荧光增白剂对苏云金芽孢杆菌毒力的增效作用及其缈外防护功效

测试了3种荧光增白剂Tinopal LPW,VBL和JD－3对苏云金杆菌杀虫剂杀棉铃虫初孵幼虫毒力的影响，并检测了荧光增白剂VBL作为佐剂在Bt受紫外线照射的兴保护功效。结果表明，这3种二苯乙烯类光增白剂以10g/kg与Bt复配后的LC50值与不加荧光增白剂的Bt的LC50值相比，其增效比值分别为：1．23、1．49和2．00。说明这3种荧光增白剂对Bt杀铃虫的活性有不同程度的增效作用。而且复混剂（10g/kg荧光增白剂VBL＋Bt）在紫外线处理8h后，其杀虫活性仍保持70％以上，说明了荧光增白剂VBL是Bt一种好的光保护剂，能提高Bt抗紫外线的能力。     

枯草芽胞杆菌QM3防治番茄早疫病和促进幼苗生长的研究

［目的］ 枯草芽胞杆菌QM3是从青海牦牛粪中分离筛选的一株对番茄早疫病菌有显著抑菌效果的高效拮抗菌株,本文旨在进一步明确QM3对番茄早疫病的作用机制和在生物体内的防治效果。 ［方法］ 采用温室盆栽试验测定QM3发酵液对番茄早疫病的防治效果及对不同番茄品种的促生作用,并测定该菌株在番茄根际的定殖能力。［结果］ 不同处理的QM3发酵液均对番茄早疫病有明显的防治效果（p<0.05）,最高可达52.94%,且与化学农药联合使用防效更好,最高可达71.80%;经QM3发酵液处理后,番茄植株叶片数、株高及根部发育等指标有增加;此外,灌根接种QM3菌株后,根际总芽胞杆菌数量明显增加（p<0.01）。［结论］ QM3菌株是一株有益的促生根际细菌（PGPR）,具有应用于番茄早疫病生防的潜力。     

研究苏云金芽孢杆菌毒素作用的新思路

苏云金芽孢杆菌对多种昆虫具有特异毒杀作用,虽然对其作用机理有了一定的了解,但对昆虫随之出现的抗性研究还很不深入。利用秀丽隐杆线虫这种模式动物并结合基因芯片技术和基因组学研究,为详细了解苏云金芽孢杆菌毒素的作用机理、昆虫对毒素的抗性机理和研究更加高效的生物杀虫制剂提供了新的思路。     

解淀粉芽胞杆菌JK10防治蓝莓根癌病的机理研究

本研究旨在揭示解淀粉芽胞杆菌JK10防治蓝莓根癌病的生防机制。利用改良发酵培养基对解淀粉芽胞杆菌JK10菌株进行发酵,用盐酸沉淀、硫酸铵沉淀、乙酸乙酯萃取、大孔树脂吸附四种方法对JK10发酵液中的活性物质进行分离,利用MALDI-TOF-MS对活性最高的粗提物进行分析明确其种类;对JK10进行绿色荧光蛋白标记,明确其在蓝莓根际土及组织内的定殖能力;使用高通量测序技术对蓝莓健康根组织、根癌病根组织及JK10处理的根癌病根组织内生细菌群落结构进行分析。结果表明,四种方法得到的粗提物对根癌土壤杆菌均有良好的拮抗效果,其中大孔树脂吸附法得到的粗提物抑菌活性与产率均最高。JK10发酵液中能检测出bacillomycin D和fengycin两类脂肽类化合物、大环内酯类抗生素Divergolide D和聚酮类化合物Bacillaene;菌株JK10能够稳定定殖于蓝莓根际土、蓝莓根组织细胞间隙和蓝莓叶中,定殖数量在接种35 d后趋于稳定,在蓝莓根际土和蓝莓叶中分别为1×10⁶、4.0×10⁵cfu/g;蓝莓根癌病根组织在施入生防菌JK10菌株后,相比自然条件下蓝莓根癌病根组织内生细菌菌落结构发生改变,物种多样性增加,结构更加趋向于健康蓝莓根组织内生细菌。综上所述,解淀粉芽胞杆菌JK10通过产生对蓝莓根癌病菌有抑制活性的物质,稳定定殖在蓝莓根际土及蓝莓根、叶组织中,改变蓝莓根内生细菌的群落结构而达到防治蓝莓根癌病的目的。