尖镰孢菌EST-SSR遗传多样性分析及通用性评价

为了解38株尖镰孢菌的遗传多样性并开发可在近缘镰孢菌种中通用的尖镰孢菌EST-SSR标记,利用设计和筛选的18对多态性EST-SSR引物对38株尖镰孢菌和5种近缘镰孢菌进行SSRPCR扩增,经6%非变性聚丙烯酰胺凝胶分离扩增产物,并用NTSYS软件分析供试尖镰孢菌的PCR扩增结果。结果表明,18对EST-SSR标记引物在38株尖镰孢菌中检测到75条多态性条带,多态性比率达92.6%,平均每对引物可扩增4.2条;各菌株间的遗传相似系数介于0.565~0.946之间,平均为0.721;来源于同科寄主植物群体的菌株间的平均遗传相似系数以葫芦科最大,锦葵科最小,依次为葫芦科兰科豆科亚麻科茄科锦葵科。在相似系数为0.756时,供试38株菌有35株按照不同科寄主植物聚为不同的类群,说明尖镰孢菌SSR类群的划分与其寄主来源具有一定的相关性。18对EST-SSR引物在近缘镰孢菌种中均能有效扩增的引物数及通用性比率为10对和55.6%,均显示多态性的引物有2对,占供试引物总数的11.1%。表明尖镰孢菌ESTSSR区域遗传多样性丰富,基于尖镰孢菌EST序列开发镰孢菌通用SSR标记是可行的。     

糖苷水解酶基因FvGH16-2参与拟轮枝镰孢菌生长发育及致病性

为明确糖苷水解酶16（glycoside hydrolase,GH16）家族基因在拟轮枝镰孢菌Fusarium verticillioides生长发育和致病过程中的作用,利用生物信息学分析软件对其GH16家族成员进行鉴定,采用转录组分析及实时荧光定量PCR技术对GH16家族成员在不同培养温度下的表达水平进行检测,并通过遗传转化法对家族成员FvGH16-2基因进行敲除及回补,分析其在拟轮枝镰孢菌生长发育及致病过程中的作用。结果显示,在拟轮枝镰孢菌基因组中共鉴定到23个GH16家族基因,其中FvCH16-2、FvCH16-4和FvCH16-12等多个上调表达基因与病菌的生长和抗逆性相关。敲除FvGH16-2基因导致拟轮枝镰孢菌的生长速率及产孢能力降低,细胞壁完整性受损,对H2O2更加敏感,同时对玉米籽粒和茎秆的致病力减弱。表明FvGH16-2基因在拟轮枝镰孢菌生长发育和致病过程中发挥着重要作用,是拟轮枝镰孢菌细胞壁完整性和致病性所必需的。     

一种用玉米拟轮枝镰孢穗腐病病粒制备接种体的简易方法

制备接种体是玉米穗腐病抗性鉴定中的一个重要环节, 本研究提出了一种用玉米拟轮枝镰孢穗腐病病粒制备接种体的简易方法, 即将上年的拟轮枝镰孢穗腐病带菌病粒按一定重量加入无菌水洗脱制成接种体。田间接种试验结果表明, 采用本方法简易制备的接种体接种后可获得与常规制备接种体相当的接种效果, 且在-18℃冻存15 d仍可达到新鲜的常规制备接种体接种后的水平。使用简易制备接种体对33个玉米品种进行了田间穗腐病抗性鉴定, 21个品种表现为感病或高感。与实验室常规培养制备接种体的方法相比, 本制备方法简便易操作, 用时短, 成本低, 无需专业仪器设备, 能够一次制备大量接种体, 可广泛用于玉米种质材料和新品种的拟轮枝镰孢穗腐病田间抗性鉴定及抗性材料筛选等。     

甘肃玉米穗腐病样品中轮枝镰孢菌的分离鉴定及生物学特性

 为了明确甘肃玉米穗腐病的病原种类, 于2009年9月在甘肃省四大生态区采集玉米穗腐病样品, 以组织分离法进行病原物的分离培养, 对分离得到的镰孢菌菌落进行纯化和单孢分离后, 以形态学为基础, 参照Leisle分类系统进行鉴定。结果表明:共分离到271株镰孢菌菌株, 其中以轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides)和黄色镰孢菌(F. culmorum)出现频率高, 属优势种。按照柯赫氏法则对沈单16和金穗96832进行致病性测定, 证实了轮枝镰孢菌对玉米果穗的致病性。选取2株轮枝镰孢菌菌株进行EF-1α(tef) 基因序列分析, 将PCR产物回收测序后在GenBank上比对, 菌株GSLT4-3-2与GenBank中登记的轮枝镰孢菌FN179339、FN179345和FN179338;GSTS24-2-1与轮枝镰孢菌FN179343、FN179346、FN179340、FN179344和 FN252384亲缘关系最近, 序列同源性达100%。轮枝镰孢菌GSYC17-2-1的生长温度范围为15～35℃, 最适温度为28℃, pH 值为8;菌落在pH值为4～10的培养基上能够迅速扩展, pH值为7时产孢量最大;碳源对轮枝镰孢菌菌丝生长影响相对稳定, 而氮源对其营养生长影响的变幅较大;完全黑暗条件下, 菌丝扩展最快, 12 h光暗交替对产孢量有明显的促进作用;病原菌菌丝致死温度为70℃, 10 min。     

拟轮枝镰孢对多菌灵的敏感性及抗性菌株生物学性状和交互抗性

为评价玉米穗腐病主要致病菌拟轮枝镰孢Fusarium verticillioides对多菌灵的敏感性,采用菌丝生长速率法测定了采自山东、河北、河南、四川、甘肃、辽宁及宁夏7省(自治区)的168株玉米穗腐病拟轮枝镰孢对多菌灵的敏感性,并对经药剂驯化获得的拟轮枝镰孢抗多菌灵菌株主要生物学性状和交互抗性进行了研究。结果表明:多菌灵抑制拟轮枝镰孢菌丝生长的EC₅₀值在0.013 2~0.774 0 mg/L之间,平均EC₅₀值为(0.220 8 ± 0.143 7) mg/L。敏感性频率分布显示,供试病原菌群体中已出现对多菌灵敏感性下降的亚群体,但其中仍有35.71%的菌株对多菌灵的敏感性频率呈正态分布,因此可将此部分菌株的平均EC₅₀值 (0.081 4 ± 0.028 9) mg/L作为拟轮枝镰孢对多菌灵的相对敏感基线。药剂驯化共获得6株抗性菌株,抗性倍数在5.05~12.22之间。抗性菌株的菌丝生长速率及菌丝干重均低于亲本菌株,表明其抗性菌株的生物适合度有所降低,同时发现其抗药性均不能稳定遗传。室内交互抗性测定结果表明,拟轮枝镰孢对多菌灵的抗性与咪鲜胺、戊唑醇、三唑酮及吡唑醚菌酯之间均不存在交互抗性关系。     

检疫性杂草毒莴苣EST-SSR标记的开发及应用

为明确毒莴苣EST序列中SSR的特点,并开发EST-SSR分子标记用于毒莴苣及其近似种的分类鉴定及遗传多样性分析,以筛选的7 438条毒莴苣EST序列为基础,利用SSRIT软件结合人工搜索查找SSR位点,并采用Primer Premier 5.0软件设计EST-SSR引物,以毒莴苣及其近似种为材料对所合成引物进行多态性检测,应用UPGMA法构建11个毒莴苣及其近似种的系统发育树。结果表明,共搜索到SSR位点1 465个,发现重复基元598种,其中二、三、六核苷酸重复是主要的重复类型。合成的24对引物中有9对表现出多态性,利用这9对EST-SSR引物分析毒莴苣等11份材料的亲缘关系,其相似性系数在0.432~1.000之间;于0.513处可被划分为3大类:Ⅰ类包括翅果菊和北山莴苣,Ⅱ类只有宿根莴苣1种,Ⅲ类包括毒莴苣和莴苣。     

枯斑拟盘多毛孢菌的生物学特性研究

 实验表明引起松赤枯病的桔斑盘多毛孢菌(Pestalotiopsis funerea (Desm.) Stey)菌丝生长的适宜温度为19℃-25℃,最适温度斑22℃。在PDA、CDA加酵母粉及麦芽膏琼胶培养基上生长发育良好。孢子萌发最适温度为22℃,相对湿度低于85%时不萌发。孢子萌发率在自来水中为17%,在寄主表面为8%,在麦芽膏营养液内为73%。95%相对湿度条件下在寄主枝条上产孢数量最多。病菌在光照下方能产生子实体,3600Å波长的光线对产孢具有促进作用。病菌对水培及盆栽的寄主枝叶具侵染作用。多菌灵、代森锌锰、抑菌灵、Prochloraz和lprodione五种药剂均对菌丝生长有抑制作用,其抑菌中量及完全抑菌最低剂量分别为:多菌灵0.0352,0.1075ppm;Prochloraz 0.0071,0.1102ppm;lprodione 3.2917,110.1827ppm;代森锌锰37.5238,98.4069ppm;抑菌灵抑菌中量为11.6580ppm。药剂对孢子萌发的抑菌中量和完全抑菌最低剂量为抑菌灵0.7877,4.4791ppm;Prochloraz2.4434,10.0511ppm;代森锌锰20.1575,120.5289ppm。     

进口美国苹果上拟盘多毛孢菌的鉴定

从进口的美国华盛顿州红帅(reddelicious)苹果中分离到一种引起苹果果实腐烂的病原真菌,根据该真菌的菌落及分生孢子的形态特征,以及该真菌DNA的ITS序列,将其鉴定为拟盘多毛孢菌(Pestaloti-opsissp.)。该真菌菌丝生长和孢子萌发的最适温度是25℃。分生孢子长梭形直立或稍弯曲,15·6~22·2(18·8)μm×4·8~7·1(5·7)μm,5个细胞,4个隔膜均为真隔膜,中间3个细胞暗褐色,两端细胞淡色,3个有色细胞中第1、2个有色细胞颜色较深,茶褐色;第3个有色细胞淡褐色;分隔处稍缢缩;孢子顶端有2~3根不分支的附属丝,长7·0~19·5(11·9)μm,基细胞具短柄,长0·4~3·2(1·4)μm。分生孢子梗较长,呈淡色,不分支,无隔膜。用ITS区通用引物PM1/PM4对该真菌DNA进行PCR扩增和测序,获得了525bp的ITS区序列。     

引起玉米穗腐病的两种镰孢菌双重PCR快速检测体系的建立

禾谷镰孢(Fusarium graminearum)和拟轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)是引起玉米穗腐病的两种主要病原菌。为了建立这两种病原菌的快速和定量检测体系,本研究分别设计了针对F.graminearum和F.verticillioides的基因特异性引物,建立了双重PCR反应体系,并从DNA浓度、引物浓度和退火温度3个方面对反应体系进行了优化。结果表明,退火温度为54℃和58℃时扩增效果较好,DNA模版的检测灵敏度可以达到6.25 ng·μL~(-1);F.graminearum和F.verticillioides引物最佳终浓度配比为0.2μmol·L~(-1)/0.4μmol·L~(-1)。本研究建立的双重PCR对同时鉴别引起玉米穗腐病的两种主要镰孢菌提供了准确、快速、灵敏的检验检疫技术。     

海南玉米穗腐病病原菌分离鉴定及优势种的遗传多样性分析

为了阐明海南省玉米穗腐病病原菌的种类,结合形态学和分子生物学方法对83份病样进行了病原菌的分离和鉴定,最终获得12种病原菌,包括拟轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)、层出镰孢(F.proliferatum)、亚粘团镰孢(F.subglutinans)、木贼镰孢(F.equiseti)、新知镰孢(F.andiyazi)、棘孢木霉(Trichoderma asperellum)、拟康宁木霉(T.koningiopsis)、卵孢木霉(T.ovalisporum)、喙刚毛球腔菌(Exserohilum rostratum)、玉蜀黍平脐蠕孢(Bipolaris maydis)、草酸青霉(Penicillium oxalicum)和可可毛色二孢(Lasiodiplodia theobromae)。其中,拟轮枝镰孢分离频率占65.06%,为优势种。以拟轮枝镰孢的EF-1α、histone 3和β-tubulin基因序列为基础进行多基因家系分析,以明确海南省与内陆部分省份不同菌株之间的遗传关系。结果表明,海南省内菌株之间具有丰富的遗传多样性,而且海南省和内陆省份菌株之间存在高频率的基因交流。     

尖孢镰刀菌磷脂脂肪酸的遗传多样性分析

为明确尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum不同专化型菌株的遗传多样性,利用MIDI微生物脂肪酸鉴定系统分析了来源于5个专化型的27株菌株的磷脂脂肪酸种类和含量,并进行了磷脂脂肪酸聚类分析。结果表明,供试尖孢镰刀菌中共检测到9种脂肪酸,在兰氏距离为25.98时分为3个类群,即主要脂肪酸、微量脂肪酸和偶现脂肪酸,其中主要脂肪酸有16:0、18:0、18:1cis9(ω9)和18:2cis9,12/18:0a,含量共占总磷脂脂肪酸的96.41%;微量脂肪酸有14:0、15:0、16:1cis9(ω7)和20:0,偶现脂肪酸仅有17:1(ω11)。不同专化型菌株的主要脂肪酸仅18:2cis9,12/18:0a存在显著差异,微量脂肪酸除15:0外其余3种均有显著差异。聚类分析结果表明,以供试的全部27株菌株聚类时,其磷脂脂肪酸与寄主专化型间无明显相关性,以寄主来源为同科(葫芦科或茄科)的菌株聚类时,其磷脂脂肪酸与寄主专化型间存在着一定的对应关系。     

Development of PCR assays to Tri7 and Tri13 trichothecene biosynthetic genes, and characterisation of chemotypes of Fusarium graminearum, Fusarium culmorum and Fusarium cerealis

Fusarium graminearum, Fusarium culmorum and Fusarium cerealis are major causal agents of Fusarium Head Blight (scab) which is a disease of global significance in all cereal growing areas. These fungi produce trichothecene mycotoxins, principally nivalenol (NIV) and deoxynivalenol (DON). Genes Tri13 and Tri7 from the trichothecene biosynthetic gene cluster convert DON to NIV (Tri13) and NIV to 4-acetyl-NIV (Tri7). We have developed positive–negative PCR assays based on these two genes, which accurately indicate a DON or NIV chemotype in F. graminearum, F. culmorum and F. cerealis. These assays are useful in assessing the risk of trichothecene contamination, and can be informative in epidemiological studies. All NIV chemotype isolates studied have functional copies of both Tri13 and Tri7, and all DON-producing isolates have both genes disrupted or deleted. We have identified several mutations in these genes, which are conserved across F. graminearum lineage, RAPD and SCAR groupings and between the three species. There appears to be evidence of inter-species hybridisation within the trichothecene biosynthetic gene cluster.     

沙米生长特性调查及遗传多样性分析

为明确不同原生地沙米的生长特性和遗传多样性,在宁夏、甘肃、内蒙古等不同原生地设置样方开展物候期调查、形态学观察、种子营养成分分析,利用SSR分子标记对3个省、自治区的17个自然居群沙米进行遗传多样性分析,获得如下结果：不同原生地沙米的物候期、器官形态和种子营养成分含量有差异,其中甘肃民勤地区的沙米株高达20~135 cm,种子千粒重达1.59 g,淀粉含量达307.46 mg·g^-1、蛋白质含量达103.36 mg·g^-1、粗脂肪含量达54.90 mg·g^-1,均优于甘肃武威、宁夏银川市和内蒙古阿拉善地区的沙米;3个省、自治区的17份自然居群的沙米种质资源遗传多样性分析,检测到76个条带,其中有39条多态性条带,多态性比率为51.3%;利用NTSYSpc (Version 2.10e)软件计算出17份沙米种质资源遗传相似性系数介于0.28~0.71之间。以0.58作为相似性系数分界点,将17份沙米资源聚为3类,其中宁夏滨河新区的资源聚为一类,内蒙古阿拉善地区9号资源和其他地区的15份资源均来自腾格里沙漠腹地,各聚为一类。研究表明供试沙米资源的物候期、形态特征、种子营养成分及遗传多样性均与原生地的生态地理环境具有一定相关性。     

Cultural characteristics, pathogenicity and genetic diversity of Fusarium oxysporum isolates from tobacco fields in Spain

Several formae speciales of Fusarium oxysporum are capable to produce disease in tobacco plants. Different authors have classified those isolates as a forma specialis or a race within on the basis of the severity of disease and host specificity. Fusarium wilt of tobacco plant in Extremadura (central Spain) tobacco fields have been recorded in the last years and F. oxysporum was isolated from symptomatic plants. The aim of our study was to characterize these F. oxysporum populations. For this purpose, the in vitro spore production and growth and the virulence (severity of disease) have been tested. Although all isolates behaved as pathogen, the virulence of isolates was different. The differences in growth could not be correlated with other characteristics but the two isolates with scarce spore production have also behaved as the weakest pathogen. We have analyzed intergenic spacer (IGS) region polymorphism of ribosomal DNA and random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers to assess the genetic diversity within F. oxysporum isolates. These molecular analyses showed two major groups with different physiological capabilities that could reflect two different lineages. One group was characterized by medium–high sporulation, high virulence and the same IGS-RFLP pattern. The other group was more heterogeneous featuring low–medium sporulation and variable virulence and growth. This first experimental approach to pathogen population could be a good starting point for further studies including non-pathogenic isolates and a larger number of pathogen that could clarify if there are two or more genetic lineages.     

苦瓜枯萎病菌的鉴定及其遗传多样性分析

 对分离获得的32株苦瓜枯萎病菌菌株进行形态学特征和寄主专化型测定, 结果表明, 测试的苦瓜枯萎病菌株均为尖孢镰刀菌苦瓜专化型 (Fusarium oxysporum f. sp. momordicae), 这些菌株可以侵染苦瓜和瓠瓜幼苗, 但不侵染其他葫芦科瓜类作物。对苦瓜枯萎病菌菌株的rDNA-ITS区 (ITS1、5.8S和ITS2)序列进行扩增测序, 结果显示其序列长度均为456 bp;聚类分析表明测序菌株与镰刀菌属中尖孢镰刀菌不同专化型的菌株聚为一群。利用RAPD标记技术分析苦瓜枯萎病菌的遗传多样性, 结果显示苦瓜枯萎病菌株与其他葫芦科瓜类作物枯萎病菌株间的遗传相似系数范围为0.59~0.99, 当遗传相似系数为0.85时, 供试的48个菌株分成10个类群 (G_1~10)。在RAPD聚类树中所有苦瓜枯萎病菌株聚在一个分支上 (G₁群), 菌株间的遗传相似系数范围为0.92~1.00, 具有较高的遗传相似性, 且菌株的聚群与地理来源存在一定的相关性。     

青藏高原地区青稞茎基腐病病原菌的群体遗传多样性、毒素化学型及其地理分布

为明确青藏高原沿线甘肃省甘南藏族自治州和青海省青稞茎基腐病燕麦镰孢菌Fusarium avenaceum的群体遗传多样性、毒素化学型及其地理分布,采用SSR分子标记法对6个地理种群91株燕麦镰孢菌菌株的遗传多样性进行分析。结果表明,6对SSR引物在91株燕麦镰孢菌中共检测到等位位点数14个,多态性位点数13个,多态性条带百分率为92.86%。6个地理种群的平均等位基因数为1.82,有效等位基因数为1.55,Nei’s基因多样性指数为0.32,Shannon信息指数为0.47,多态性位点数为11.50,多态位点百分率为82.15%。6个地理种群的Nei’s遗传相似度为0.83～0.99,遗传距离为0.01～0.18。种群间的遗传距离和地理距离、遗传相似度与海拔差距无显著相关性。燕麦镰孢菌地理种群聚为3个大类群,Group Ⅰ由甘肃省临潭县、合作市和卓尼县种群组成,Group Ⅱ由青海省互助土族自治县和刚察县种群组成,Group Ⅲ由青海省海晏县种群组成。燕麦镰孢菌种群的遗传变异主要来自种群内部,占总变异的93.63%。燕麦镰孢菌毒素化学型分为NIV、DON、3-AcDON三大类,没有15-AcDON毒素化学型,其中DON毒素化学型在6个地理种群中均有分布。表明燕麦镰孢菌地理种群的遗传多样性高。     

甘蓝型冬油菜抗寒性评价及遗传多样性分析

针对不同品种甘蓝型冬油菜抗寒性和遗传多样性存在差异等特点,于2021年采用随机区组设计,结合系统聚类分析法及SSR标记对32份甘肃省生产应用甘蓝型冬油菜与9份陕西中部及江苏省现推广应用甘蓝型冬油菜品种的越冬率及春化特性差异和遗传多样性进行分析,探究其抗寒性差异,分析品种间遗传多样性及亲缘关系。结果表明：甘肃省生产应用甘蓝型冬油菜越冬率高于80%,陕西中部及江苏省甘蓝型冬油菜品种越冬率均小于25%,且抗寒性强弱差异明显;根据春化率高低,参试材料可分为强冬性、冬性、半冬性、弱冬性等4个级别;强冬性材料未现蕾的植株占比高,春播后难以抽薹现蕾进入生殖生长,加权平均薹高随之偏低,抗寒性强;春化率越高,成熟期的加权平均株高越高且抗性越弱,越冬率与春化率呈负相关关系;筛选出的98对多态性高的引物组合共扩增出976个总位点,其中多态性条带750个,多态位点比率达72%,说明其分子遗传水平上的多态性丰富度高,陕西中部及江苏省甘蓝型冬油菜遗传多样性整体高于甘肃省生产应用甘蓝型冬油菜;通过聚类分析,可将甘蓝型冬油菜划分为9类;根据群体遗传结构分析及主成分分析可分为3大类,与抗寒性分类趋于一致。研究成果有望为鉴别甘蓝型冬油菜品种、构建指纹图谱及选择不同生态区适宜品种等研究奠定基础。     

我国玉米灰斑病菌遗传多样性的ISSR分析

为明确我国发生的玉米灰斑病菌地理差异及遗传结构,利用简单序列重复区间(ISSR)对玉米灰斑病菌遗传多样性进行了分析,并利用尾孢菌特异引物对分离自四川、云南、湖北、贵州等西南地区的16个玉米灰斑病菌菌株进行了分子鉴定。结果显示,通过ISSR标记筛选出10个扩增多态性好且稳定的通用引物,共扩增出81条DNA条带,均为多态性条带,扩增片段大小在200~2 000 bp之间,菌株遗传相似系数为0.19~1.00。在遗传相似系数为0.19时,供试菌株被聚为2大类群,来自西南地区和东北地区的菌株各自聚为一组,在DNA水平上表现出明显差异,认为是2类不同的致病类群。分子鉴定结果显示引起西南各地区玉米灰斑病的主要致病菌均为玉米尾孢菌Cercospora zeina。表明我国玉米灰斑病菌存在丰富的遗传多样性,ISSR标记可揭示出玉米灰斑病菌株间的亲缘关系及遗传差异性,可用于其遗传多样性研究。