牛结核分枝杆菌PCR检测方法的建立

随着牛结核病疫情日趋严重,快速、高效的分子生物学检测方法建立显得十分必要.试验设计合成了牛结核分枝杆菌特异性引物,优化反应条件,建立了牛分枝杆菌PCR检测方法.结果显示,所建立的牛结核分枝杆菌PCR检测方法可有效检测牛结核分枝杆菌,在模板浓度、引物浓度和退火温度分别为1.32 μg/mL、0.5 μm/L、54℃时最佳;性能评估显示,该方法具有较好的特异性、敏感性和临床应用性,为我省牛结核病的综合防控提供关键技术.     

牛分枝杆菌三重PCR检测方法的建立

为建立快速检测牛分枝杆菌(M.bovis)的三重PCR方法,本研究以M bovis ValleeⅢ株染色体DNA 为模板,分别以其recA、IS6110、IS1081基因特异性引物进行PCR扩增,建立检测M.bovis的recA-IS6110-IS1081三重PCR反应.通过PCR扩增获得大小约为860 bp、520bp和340 bp的DNA片段.BLAST序列分析表明,这3个基因片段与GenBank中登录的相关基因的核苷酸序列同源性均达到99%.同时,recA、IS6110和IS1081PCR扩增的敏感性分别达到585fg、19.5fg和19.5fg.特异性较强,只有M.bovis和人结核临床分离株扩增反应为阳性,为进一步研究recA、IS6110和IS1081基因以及其在牛结核病诊断中的应用奠定了基础.     

牛分枝杆菌特异性PCR检测方法的建立及初步应用

根据已发表的牛分枝杆菌的pncA的基因序列，设计和合成了一对可扩增294bp目的片段的引物，建立了特异性检测牛分枝杆菌的PCR方法。对牛分枝杆菌国际参考株和国内分离株成功扩增出294bp的特异性基因片段；对人结核分枝杆菌、副结核分枝杆菌、鸟胞内分枝杆菌和草分枝杆菌DNA的PCR扩增结果均为阴性。本PCR方法检测的敏感度可达到50pg。对10份牛分枝杆菌培养阳性和10份阴性样品的DNA分别进行了PCR检测，结果10份阳性样品中有9份样品为PCR扩增阳性，阳性符合率为90％（9／10）；而10份阴性样品则PCR扩增全部为阴性，阴性符合率为100％（10／10）。本方法可做为牛分枝杆菌的快速检测和流行病学调查的工具。     

应用TaqMan荧光定量PCR检测牛分枝杆菌

为建立快速检测牛分枝杆菌(M.bovis)的TaqMan荧光定量PCR方法,本研究以GenBank登录的M.bovis特有229 bp基因为研究对象,设计并合成引物及探针。该方法具有较好的特异性,与标准质控菌株呈阳性反应,与其他微生物样品呈阴性反应;灵敏性最低检测值可达1 pg/mL;对20阳性临床样品进行荧光定量PCR检测,均为阳性;而对培养为阴性的20份临床样品进行检测,6份为阳性。该研究结果表明,建立的方法特异性强,敏感性高,稳定性好,能够用于M.bovis的鉴别检测,对牛分枝杆菌病的快速检测和早期诊断具有重要意义。     

4种牛分枝杆菌特异性基因PCR检测方法的比较与评价

牛分枝杆菌是严重危害养牛业的重要人兽共患病原微生物,PCR是检测该病原的有效手段之一。本研究通过筛选最佳的PCR检测方法,以期为临床监测牛分枝杆菌感染提供技术参考。针对牛分枝杆菌4种常见的特异性基因(16S rRNA、IS6110、IS1081和Mpb64)分别设计引物,通过温度梯度PCR法确定最适退火温度;采用牛分枝杆菌参考株核酸确定PCR最小检测限,同时运用牛分枝杆菌国内参考株、牛分枝杆菌国际参考株、禽分枝杆菌、胞内分枝杆菌、副结核分枝杆菌、羊种布鲁菌以及牛种布鲁菌进行特异性比较试验;最后运用人工模拟牛分枝杆菌感染组织样本(肺脏、淋巴结、奶样)比较不同PCR方法检测效果。4对引物以60℃为退火温度时均能检测分枝杆菌,其中IS6110、IS1081和Mpb64基因引物可以特异性检测牛分枝杆菌。IS6110和IS1081基因引物对牛分枝杆菌基因组的检测灵敏度最高,可达10^-10 ng/μL;IS6110基因引物在肺脏和淋巴结中牛分枝杆菌检测灵敏度可达10⁶ CFU/mL以上,而Mpb64基因引物对奶样中牛分枝杆菌的检测灵敏度可达10^...     

牛结核分枝杆菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立可应用于快速检测奶牛结核病、评估鲜乳污染状况、追溯传播途径的试验方法,本研究根据牛结核分枝杆菌基因组设计合成特异性引物,建立实时荧光定量PCR方法,并对反应条件进行优化,构建标准曲线,评价该方法的性能。结果显示,本研究所建立的实时荧光定量PCR方法能有效检测牛结核分枝杆菌目的基因,其最佳引物浓度为400 nmol/L,最佳退火温度为52 ℃。所构建的标准曲线相关性好,可用于样本的定量检测。该方法的性能评价显示,其最小检出模板浓度为80.24 ng/L,且该方法具有较好的特异性、可重复性,可对鲜乳样本进行检测。试验结果表明,本研究所建方法可用于牛结核分枝杆菌的定性和定量检测,这为奶牛结核病的诊断与净化及鲜乳食品安全评估提供重要技术。     

牛分枝杆菌基因分型技术的研究进展

<正>牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)是结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex,MTC)中的重要成员,是引起牛结核病(Bovine tuberculosis)的主要病原菌。牛结核病在2016年被国际兽医局列为须申报的14类牛传染病之一,它不仅影响了养牛业的健康发展,还严重地威胁动物性食品安全和人类的健康~([1])。     

牛分枝杆菌遗传学研究进展

一、牛分枝杆菌基因组 牛分枝杆菌AF2212/97分离自肺部和支气管纵隔淋巴结发生干酪样病变的母牛,具有完全的毒力.该菌株基因组全长为4345492bp,分布于一单环染色体中,平均G C含量为65.63%.基因组包含3952个编码蛋白基因--包括一个前噬菌体和42个插入单位(IS).在核苷酸水平上,牛分枝杆菌与结核分枝杆菌基因组相比,其同源性大干99.95%,表现出共线性,没有广泛的置换、复制或倒置现象.     

牛分枝杆菌遗传学研究进展

牛分枝杆菌AF2212／97分离自肺部和支气管纵隔淋巴结发生干酪样病变的母牛,具有完全的毒力。该菌株基因组全长为4345492bp,分布于一单环染色体中,平均G＋C含量为65．63％。基因组包含3952个编码蛋白基因——包括一个前噬菌体和42个插入单位（IS）。在核苷酸水平上,牛分枝杆菌与结核分枝杆菌基因组相比,其同源性大于99．95％,     

牛腹泻病毒的PCR检测方法

<正>本研究是通过PCR技术对新生牛是否带有牛病毒性腹泻病毒进行检验,排除其患病牛,制备无病毒血清,进一步用于兽药的研制。一、材料与方法(一)材料1.主要试剂。RNAiso plus购自Takara公司;氯仿、无水乙醇、75%酒精,DEPC水、ddH_2O、DNAMarker购自TakaRa公司;核酸染料购自百泰克有限公司;高速低温离心机购自Sigma公司;PCR扩增仪为美国伯乐公司,型号为S1000;凝胶成像仪。     

荧光定量PCR技术在分子检测上的研究进展

荧光定量PCR技术是近年来发展起来的一种核酸定量技术,因其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确等优点成为核酸检测中的重要工具,作者将其研究进展作一综述,以供参考。     

应用噬菌体生物扩增技术检测牛结核分枝杆菌的方法研究

建立噬菌体生物扩增技术检测牛结核分枝杆菌试验方法,探讨最佳检测条件。比较各种检测方法对测定结果的影响。结果:噬菌体工作浓度为1×108PFU/ml、37℃感染2h,杀毒剂浓度在100mmol/L、室温作用10min为最佳检测条件。指示细胞浓度在1×106条/ml时,形成噬菌斑清晰,便于计数。结论:在选择最佳测定条件下,噬菌体生物扩增法检测牛结核分枝杆菌,快速、简便、灵敏。     

转基因牛多重PCR检测方法的建立

为建立一种快速检测转基因牛的多重PCR方法,针对牛线粒体16 S rRNA基因(BOS mtD-NA16 S rRNA,BOS)、转基因动物常用标记基因新霉素磷酸转移酶基因(NPT Ⅱ)、人乳铁蛋白编码基因(human laetoferrin gene,hLF)、人-α-乳清蛋白编码基因(human α-lactalb...     

牛支原体双重PCR检测方法的建立

为鉴别牛支原体(Mycoplasma bovis)与丝状支原体丝状亚种SC(M.mycoides subsp.mycoides SC),本实验通过优化M.bovis特异性引物pMB81-1/pMB81-2s和MmmSC特异性引物SC1/SC2的退火温度,建立了鉴别M.bovis和MmmSC的双重PCR检测方法。该方法能够分别由M.bovis和MmmSC扩增得到528bp和270bp片段。敏感性试验结果显示该方法检测M.bovis和MmmSC培养物的最低浓度分别为106cfu/mL和105cfu/mL。特异性试验结果显示,该方法对无乳支原体代表株PG2、丝状支原体丝状亚种LC型代表株Y-goat、山羊支原体山羊肺炎亚种Mccp、绵羊支原体Y-98、猪鼻支原体BST-7、巴氏杆菌以及结核分枝杆菌扩增结果均为阴性。应用该方法对临床病料的检测结果与培养鉴定结果的符合率为100%,表明该方法具有良好的特异性和敏感性,可以应用于临床检测。     

牛布氏杆菌PCR检测方法的建立

根据GenBank上公布的牛布氏杆菌外膜蛋白OMP31的基因序列设计特异性引物,对牛布氏杆菌样品进行PCR扩增并将产物克隆到pMD18-T载体后测序。结果表明,扩增的目的片段大小为602 bp,与预期扩增序列同源性为99.7％;该PCR检测体系的特异性强,不能在非布氏杆菌 DNA中扩增出条带;敏感性高,最低检测的DNA含量为0.9 pg/μL。该检测体系的成功构建为牛布氏杆菌病的检测、鉴定和流行病学调查提供了有力的技术支持。     

猪链球菌PCR检测技术研究进展

猪链球菌是猪的一种重要病原菌,并且也会引起人的链球菌病。有35个荚膜血清型(1/21、~34),通常自发病或死亡猪体分离获得1,2,7,9型和14型菌株,其中2型是毒力最强的血清型。根据已知猪链球菌16 SrRNA及溶血素(sly)、谷氨酸脱氢酶(gdh)、荚膜多糖(cps)、胞壁蛋白或溶菌酶释放相关蛋白(mrp)、胞外因子(epf)编码基因序列设计特异性引物,建立猪链球菌群和1(14),2(1/2),7型和9型特异性PCR或多重PCR,建立2型致病性菌株和1型高致病性菌株毒力鉴定PCR或多重PCR,用于检测和鉴别临床病料和细菌分离物中的猪链球菌,具有高敏感性和高特异性,与其他致病菌及其他血清的猪链球菌型无交叉反应,为疫病诊断及流行病学的研究提供了快速、简便和有用的工具。     

牛布鲁氏菌和牛疱疹病毒双重PCR检测方法的建立

牛布鲁氏菌(Brucella Bru-A)和牛疱疹病毒都是可引起牛流产,睾丸炎等疾病的病原。牛布鲁氏菌是一种革兰氏阴性菌,细胞内寄生,其感染的宿主范围极广。患病母畜在患病期间以及在流产后相当长的一段时间内,仍可以通过乳汁排菌。布鲁氏菌对外界的理化环境有一定的抵抗力,感染布鲁氏菌的奶制品是主要的公共卫生危害。牛疱疹病毒(Bovine herpesvirus,BHV)引起牛传染性鼻气管炎,是一种严重的呼吸道疾病。1972年,该病毒在整个西欧国家引起了严重的牛呼     

牛支原体检测方法研究进展

随着规模化养牛业的不断发展,牛支原体已经成为危害养牛业的一种重要致病性支原体。本文介绍了牛支原体病原学、血清学及分子生物学方面实验室检测方法的研究进展,为我国牛支原体病的防治提供了参考。     

PCR方法鉴定牛早期胚胎性别研究进展

对用于早期胚胎性别鉴定的多重PCR、巢式PCR、引物一扩展预扩增PCR、非电泳PCR和LAMP法等扩增技术进行了综述,并针对早期胚胎性别鉴定技术在养牛业生产中的应用现状和存在问题进行分析与讨论,展望了PCR性别鉴定技术在养牛业中广阔的商业应用前景。