香蕉枯萎病菌SIX2基因序列及特异性分析

依据侵染的香蕉品种范围不同,引起香蕉枯萎病的尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,Foc)分为4个生理小种。Foc在寄主植物木质部分泌的SIX(secreted in xylem)蛋白可能与不同生理小种侵染的香蕉品种范围不同存在密切关系,找到Foc 4号生理小种(Foc4)特有的SIX蛋白编码基因将有利于进一步分析Foc4寄主范围更广的原因,从而开展抗病育种工作。采用PCR方法比较分析了国内不同地理区域及来源于澳大利亚与南非的Foc1、Foc2、Foc3、Foc4共56株菌株中的SIX2基因,并以8个以上其他专化型或其他种或属的热带作物病原菌共39株菌株分析了Foc4 SIX2基因序列的特异性,分析了SIX2基因的灵敏度及利用其检测感病植株。仅从供试的Foc4菌株基因组DNA中扩增出SIX2基因序列,检测的DNA灵敏度达5pg/25μL,并可用于检测感病的球茎组织。Foc4中特有的SIX2基因序列为特异性鉴定感病植株病原菌种类提供了快速分子检测技术,为明确该基因是否决定性影响Foc4对寄主差异性的选择研究提供了基础。     

香蕉枯萎病菌myosin-1基因的功能分析及外施dsRNA介导的抗性评估

 香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f. sp. cubense,Foc)引起的香蕉毁灭性土传病害,其中 4号生理小种(Foc4)能感染几乎所有的香蕉品系,危害最严重。SMART在线软件分析myosin-1基因具有肌球蛋白马达蛋白(myosin motor domain, MMD),肌动蛋白尾结构TH1(myosin tail)和 Src家族同源结构域SH3(src homology domain 3),与禾谷镰刀菌中氰烯菌酯靶标基因myosin-5具高度的蛋白同源性,相似性高达83%。利用Split-marker基因重组技术获得Foc4的myosin-1基因敲除突变体,Δmyosin-1突变株丧失了对氰烯菌酯的敏感性,菌丝生长缓慢,产孢量减少且孢子畸形,对香蕉致病力严重下降,证实myosin-1是氰烯菌酯在Foc4中的作用靶标基因。外施靶向myosin-1体外转录的dsRNA,能抑制菌丝的生长,降低菌丝活性;菌丝膨胀扭曲分枝增多,出现典型的球状结构,与氰烯菌酯处理后的表型一致。在盆栽活体人工接种实验中,体外施用dsRNA可以明显抑制枯萎病外部症状的发展,推迟发病时间,赋予寄主抗性,结果说明体外施用dsRNA可以作为新型杀菌剂防治香蕉枯萎病。综上,myosin-1基因作为氰烯菌酯在Foc4中的靶标基因具有高度的序列保守,在调控菌丝生长发育,产孢以及致病力等方面发挥重要作用,而外施dsRNA具有防治香蕉枯萎菌的巨大潜力。     

茎瘤芥(榨菜)根肿病综合防治方法

正茎瘤芥(榨菜)根肿病是由芸薹属根肿病菌(Plasmodiophora brassicae Worom)引起的重要土传性病害,自1994年涪陵榨菜首次受到根肿病菌的侵害以来,迅速扩展蔓延并成为制约榨菜生产的主要病害之一~([1])。近年来,该病侵染性强、传播速度快、传播方式多,并在土壤中可保持长期侵染活性,防治难度大~([2])。笔者对榨菜根肿病的研究进行综述,为防治该病害提供参考依据。1发病症状和病原菌     

苇状木霉3199菌株对黄瓜枯萎病的生物防治研究

黄瓜枯萎病由黄瓜专化型尖镰孢菌(Fusarium oxysporum f. sp.cucumerinum,Foc)侵染引起,是黄瓜生产中较难防治的一种土传病害,发病时多造成植株萎蔫枯死,可导致黄瓜大幅减产。本研究从美国农业研究菌种保藏中心(Agricultural Research Service Culture Collection, NRRL)获得了一株可产生抗菌肽的木霉菌株3199,经形态学和分子生物学鉴定确定为苇状木霉(Trichoderma arundinaceum)。平板对峙试验发现菌株3199对Foc抑制效果明显。盆栽试验表明菌株3199孢子悬浮液(浓度1×10⁸ 个孢子·mL^-1)灌根对黄瓜枯萎病的防效为51.3%。进一步对该菌株的抑菌活性物质进行分析,发现其发酵液乙酸乙酯提取物(12 mg·mL^-1)可显著抑制Foc生长。结果表明,T.arundinaceum菌株3199可代谢产生抑制Foc的活性天然产物,在黄瓜枯萎病生物防治方面有较大应用潜力。     

香蕉枯萎病及其防治研究进展

香蕉枯萎病(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)是破坏香蕉维管束导致植株死亡的毁灭性病害。其病菌腐生能力很强,在土壤中可长期存活。香蕉枯萎病是典型的土传病害,侵染来源主要是带菌的吸芽、病株残体及带菌土壤。病菌从寄主根部伤口侵入寄主,通过寄主维管束向假茎上部及叶部蔓延。目前还没有一种理想的防治香蕉枯萎病的化学药剂,与水稻轮作是控制病害的最有效途径。半个世纪前,香蕉枯萎病菌1号小种几乎摧毁了世界的香蕉产业,现在则由于4号小种的蔓延,香蕉产业又面临新的威胁。对香蕉枯萎病菌4号小种实施检疫控制是防止枯萎病扩散的关键。…     

3种甘薯病毒多重RT-PCR检测方法的建立及应用

正病毒病是引起甘薯品质降低和减产的重要原因之一,现已报道30多种能侵染甘薯的病毒~([1,2])。山东省是甘薯种植大省,病毒种类近10种~([3,4])。甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFM V)、甘薯潜隐病毒(Sweet potato latent virus,SPLV)是为害甘薯的主要病毒,在全国甘薯种植区广泛分布~([5,6])。甘薯病毒2(Sweet potato virus 2,SPV2)为Potyvirus的一个暂定种,多与同属的其他病毒混合侵染~([7])。多重PCR技术由Chamberian等~([8])1988年首次提出,可实现多基因的同时扩增,具有节省时间、提高效率的优点,已初     

一种马铃薯根茎腐烂病病原鉴定

正马铃薯(Solanum tuberosum)为茄科茄属植物,是全世界广泛种植的重要粮食作物~([1])。马铃薯为人们提供了丰富的营养物质,如碳水化合物、多种微量营养素和有利于健康的膳食纤维~([2,3])。马铃薯根茎腐烂病由多种病原菌引起,是马铃薯采后的主要病害~([4])。甘薯长喙壳菌也引起多种植物果实腐烂,如巴西首次报道甘薯长喙壳菌侵染鸡蛋     

番茄与白粉病菌互作反应中活性氧的积累

番茄白粉病菌Oidium neolycopersici是一种产生单生分生孢子的真菌,主要分布在欧洲、非洲、南北美洲和亚洲的一种世界性植物病害的病原菌~([1]).已有研究表明,受病原菌侵染的植物体内活性氧的积累与植物抗病性密切相关~([2]).目前关于番茄与番茄白粉病菌互作中活性氧进发与抗病性关系的研究,国内外很少报道.     

香蕉枯萎病及其防治研究进展

香蕉枯萎病（Fusarium oxysporum f．sp．cubense）是破坏香蕉维管束导致植株死亡的毁灭性病害。其病菌腐生能力很强，在土壤中可长期存活。香蕉枯萎病是典型的土传病害，侵染来源主要是带菌的吸芽、病株残体及带菌土壤。病菌从寄主根部伤口侵入寄主，通过寄主维管束向假茎上部及叶部蔓延。目前还没有一种理想的防治香蕉枯萎病的化学药剂，与水稻轮作是控制病害的最有效途径。半个世纪前，香蕉枯萎病菌1号小种几乎摧毁了世界的香蕉产业，现在则由于4号小种的蔓延，香蕉产业又面临新的挑战。对香蕉枯萎病菌4号小种实施检疫控制是防止枯萎病扩散的关键。     

小麦苗期抗纹枯病鉴定方法的改良及抗病品种筛选

<正>小麦纹枯病又称尖眼斑(点)病,是由禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)引起的一种以土壤传播为主的小麦真菌病害~([1])。引起小麦纹枯病的病原菌主要是禾谷丝核菌的第一菌丝融合群(CAG-1)~([2～4])。在自然条件下,病原菌首先侵染寄主植株基部叶鞘,随着     

拮抗尖孢镰刀菌的PGPR筛选与抑菌机制的初步研究

自黄瓜根围分离的促生细菌(plant growth-promoting rhizobacteria,PGPR)中筛选获得拮抗尖孢镰刀菌黄瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum,Foc)作用的5株PGPR PR2-1、PS1-3、PS1-5、PS2-6和PS3-2。根据16S r DNA基因序列分析和生理生化特性分析,鉴定该5株分别为Burkholderia cepacia、Bacillus subtilis、Ba.velezensis、Pseudomonas fluorescens和Ba.velezensis。该5株PGPR具有很强的解蛋白活性,溶解率分别为45%、51%、50%、83%和77%;PR2-1、PS1-5和PS3-2具有嗜铁素活性,其溶解率分别为56%、63%和73%。对峙培养中5株PGPR对Foc的抑制率分别为48%、49%、51%、66%和56%,其发酵液的抑菌率分别为47%、52%、50%、67%和54%;FOC菌丝生长受到抑制,发生畸形、溶解、色素积累和内含物凝聚等,并观测到色素沉积量大、颜色深的菌丝易断裂,这是国内外新发现的PGPR抑菌现象。PGPR各菌株1×108cfu/m L发酵液对Foc分生孢子萌发抑制率均高于92%,并且其抑菌能力遗传性较为稳定。PS2-6对F.graminearum,PS3-2对F.acuminatum、F.proliferatum和Verticillium dahliae,PS1-5对Alternaria alternata和Botrytis cinerea的抑制作用最大。PR2-1除了具有很强的抑制真菌作用外,对马铃薯和生姜青枯病病原细菌(Ralstonia solanacearum)也具有显著抑制效果,分别为73%和91%,表明该菌株对病原真菌和细菌具有双抗作用,属首次报道。     

利用香蕉水培系统测定枯萎病病原菌致病力

 为建立一种评价香蕉枯萎病病原菌(Fusarium oxysporum f.sp. cubense)菌株间致病力差异的体系,在改进的香蕉水培系统基础上,对影响香蕉枯萎病菌致病力的接种菌液浓度、类型及处理方式等因素开展分析,同时与不同菌株盆栽测定结果进行比较以验证该方法的可靠性。结果表明:在香蕉水培系统下,将摇培5 d的菌液稀释10倍以上,使孢子初始浓度为1×10⁶ cfu·mL^-1,直接加入该菌液50 mL即可用于致病力评价,且不同菌株用该测定方法与盆栽测定的致病力结果基本一致。该方法的建立为香蕉枯萎病菌致病力的评价提供了快速简便的方法,也为下一步解析尖孢镰刀菌致病相关基因功能和致病机理及抗病品种的选育奠定了基础。     

基于原生质体转化的甘蔗梢腐病菌YN41基因敲除体系的构建

基因敲除技术日益成为基因功能研究的重要手段,为了深入研究甘蔗梢腐病菌致病基因的功能,构建了梢腐病菌YN41菌株的基因敲除体系。本研究构建了基于线性DNA的同源重组基因敲除技术,融合PCR构建敲除盒即带有潮霉素基因标记的线性DNA融合片段,配置0.05 g·mL^-1溶壁酶+0.01 g·mL^-1崩溃酶的复合酶液28℃酶解3 h获得了高产量的原生质体,利用聚乙二醇(PEG)介导的原生质体的转化,PCR鉴定技术和酶切鉴定技术对转化子进行鉴定,荧光定量PCR分析和Southern Blot方法进一步对基因缺失突变体进行验证,生物学表型(菌落形态、生长速率、产孢量、生物量和致病力)验证了PK基因敲除体系的成功构建。28℃酶解3 h获得了2×10⁷个·mL^-1原生质体;对编码丙酮酸激酶的PK基因进行了基因敲除验证,获得了纯合敲除突变体;荧光定量PCR检测转录水平无表达;Southern Blot结果显示使用PK基因探针杂交,基因缺失突变体无条带,野生型杂交到目的条带;生物学表型验证了PK基因敲除突变体对比野生型...     

2018年湖北省小麦赤霉菌群体组成及杀菌剂敏感性检测

 由小麦赤霉菌(Fusarium spp.)引起的小麦赤霉病是小麦生产中最主要的病害之一,严重影响小麦的产量和品质。为明确目前湖北省小麦赤霉菌种群的组成、毒素化学型的分布及对杀菌剂的敏感性现状,本研究于2018年采集分离了96株小麦赤霉菌菌株,经TEF1-α基因鉴定,78株为Fusarium asiaticum,18株为F. graminearum,表明湖北省小麦赤霉菌的优势群体为F. asiaticum;利用特异性片段扩增法鉴定了菌株的毒素化学型,结果表明湖北省小麦赤霉菌菌株以3A DON化学型为主,占供试菌株群体的58%,其次为15A DON,占32%,NIV化学型最少,占10%。采用区分浓度法共检测到2株对多菌灵产生抗药性的菌株,均为F. asiaticum菌株。采用菌丝生长速率法,测定了Fusarium spp.对戊唑醇的有效抑制中浓度(EC₅₀),平均值为(0.66± 0.29)μg·mL^-1,其敏感性已经下降;其中,F. asiaticum与F. graminearum对戊唑醇的EC₅₀均值分别为(0.77± 0.26)μg·mL^-1和(0.35 ± 0.08)μg·mL^-1,表明F. graminearum群体对戊唑醇更敏感。     

醚菌酯对假禾谷镰孢的抑制作用及对小麦茎基腐病的防效研究

 为了明确醚菌酯对假禾谷镰孢的抑制作用,本研究采用菌丝生长速率法和孢子萌发抑制法分别测定了醚菌酯对2019年从河南省13个地市分离的50株假禾谷镰孢的毒力。两种方法结果表明,醚菌酯对供试50株菌株的EC₅₀值范围分别在0.127 3~3.070 9 μg·mL^-1和0.001 3~0.070 9 μg·mL^-1,平均EC₅₀值为(1.304 1±0.804 2)μg·mL^-1和(0.017 4±0.017 0)μg·mL^-1。敏感性频率分布图显示,两种方法分别有80％(40株)和70％(35株)的菌株敏感性频率呈正态分布,其平均EC₅₀值分别为(1.135 2±0.531 2)μg·mL^-1和(0.011 4±0.006 3)μg·mL^-1,可作为假禾谷镰孢对醚菌酯的敏感性基线。方差分析结果表明,同一县市的假禾谷镰孢对醚菌酯的敏感性差异较大,EC₅₀值变化范围为0.545 2~2.156 4 μg·mL^-1和0.001 9~0.036 7 μg·mL^-1。聚类分析结果显示,河南省假禾谷镰孢对醚菌酯敏感性差异与菌株的地理来源无明显关联性。温室防效结果显示,小麦种子与醚菌酯悬浮种衣剂进行拌种处理可以起到一定防治效果,0.42 μL AI/2g处理防效最高,防治效果可达50.33％。本研究结果可为河南省假禾谷镰孢对醚菌酯的敏感性监测提供信息,同时为醚菌酯对小麦茎基腐病的防治提供理论依据。     

丙环唑对水稻恶苗病菌(Fusarium fujikuroi)生物活性研究

 丙环唑是一种具有广谱活性的三唑类杀菌剂。本研究首次采用菌丝生长速率法建立了浙江省绍兴市、江苏省淮安市和黑龙江省尚志市不同地区的80株水稻恶苗病原菌(Fusarium fujikuroi)对丙环唑的敏感性基线,测定了丙环唑对水稻恶苗病菌的生理影响和对水稻的安全性。结果表明: 丙环唑对水稻恶苗病菌菌丝生长的有效抑制中浓度(EC₅₀值)范围在0.029 8~0.211 0 μg·mL^-1,EC₅₀平均值为(0.106 7 ± 0.004 4) μg·mL^-1。水稻恶苗病菌经0.1 μg·mL^-1(EC₅₀平均值)或3 μg·mL^-1(EC₉₀平均值)丙环唑处理后,分生孢子产量显著降低,细胞膜通透性显著升高;3 μg·mL^-1丙环唑不影响水稻恶苗病菌细胞核的分布与定位,但可以使细胞壁缢缩,菌丝顶端膨大,破坏水稻恶苗病菌细胞膜和细胞器。丙环唑浓度为不超过200 μg·mL^-1时,对水稻种子发芽率和株高无显著影响,同时可显著增加水稻鲜重;当浓度为500 μg·mL^-1时,对水稻种子发芽率、株高和鲜重均无显著性影响;当浓度达到1 000 μg·mL^-1时,发芽率显著降低但株高和鲜重无显著性差异;水稻种子发芽长度随丙环唑浓度升高而降低。本研究明确了丙环唑对水稻恶苗病菌的生物活性和对水稻的安全性,为丙环唑防治水稻恶苗病提供了指导,并进一步加深对丙环唑作用机理的认识。     

香梨果萼黑斑病菌Alternaria alternata遗传转化体系的建立及GFP标记菌株的获得

 为建立香梨果萼黑斑病菌链格孢(Alternaria alternata)的原生质体遗传转化体系,本实验以香梨果萼黑斑病菌强致病性菌株LI1为供试材料,研究菌龄、酶系统、酶解时间等对链格孢菌原生质体制备的影响。链格孢菌菌丝在CM液体培养基中培养20 h,以0.7 mol·L^-1 NaCl为稳渗剂,1%裂解酶+1%崩溃酶+1%蜗牛酶的酶液组合下,28 ℃酶解4 h,原生质体制备效率最高。通过PEG/CaCl₂介导法将含有潮霉素B抗性基因和绿色荧光蛋白基因的质粒转入链格孢菌LI1,转化子生长表型及外源基因的PCR鉴定结果表明抗性基因已成功整合到香梨果萼黑斑病菌中。成功建立了香梨果萼黑斑病菌链格孢菌的原生质体遗传转化体系,并成功获得GFP标记菌株,为病原菌侵染定殖过程及致病机制研究奠定了基础。     

金属蛋白酶FocM352在香蕉枯萎病菌热带4号生理小种侵染过程中的功能

香蕉枯萎病菌热带4号生理小种(Fusarium oxysporum f. sp.cubense tropical race 4,Foc TR4)严重威胁世界香蕉产业的可持续发展，一些特殊功能的蛋白在其侵染过程中起重要作用。我们分析Foc TR4接种巴西蕉后的转录组数据发现M35金属蛋白酶(metalloprotease 35)同源基因FocM35＿2在病原菌侵染初期受诱导显著上调表达，经同源重组法敲除该基因，突变体致病力显著下降，菌丝生长速率降低，产孢量略微减少，回补突变体则可以恢复其致病力和生长发育；与野生型菌株相比较，突变体对外源氧胁迫、渗透压和细胞膜压力更敏感；在本氏烟草(Nicotiana benthamiana)中的瞬时表达结果显示该蛋白定位于质外体，并引起叶片产生超敏反应(HR,hypersensitive response);该蛋白的缺失还能够诱导寄主更高水平几丁质酶的活性。因此，FocM35＿2是促进Foc TR4侵染寄主的的重要致病因子。     

梨黑斑病菌遗传操作体系的建立与RFP标记转化子的致病性分析

由链格孢(Alternaria alternata)引起的梨黑斑病是我国梨生产上的主要病害之一,导致梨叶与果实产生黑斑症状及早期落叶,对我国梨产业的健康发展构成严重威胁。本实验在前期获得强致病性梨黑斑病菌菌株HN-5基础上,建立该病菌的遗传转化体系。通过优化原生质体制备过程以及转化体系发现梨黑斑病菌HN-5原生质体制备的最优条件为:菌丝在M R液体培养基中培养36 h;以0.7 M NaCl+0.8 M Mannitol为稳渗剂,配置复合细胞壁裂解酶(1%崩溃酶+1%裂解酶+1%纤维素酶+1%蜗牛酶),酶解菌丝3 h,原生质体的产量可达0.5×10~7个·mL~(-1)。通过PEG介导的原生质体遗传转化体系,将含有RFP基因的质粒p KD7转入链格孢菌HN-5中,转化效率为6个·μg~(-1)DNA。PCR检测和转化子荧光观察均表明RFP基因整合到了HN-5基因组中并成功表达。致病性分析发现RFP (Red Fluorescent Protein)标记转化子致病性未发生变化。本研究成功建立了PEG (Polyethylene glycol)介导的梨黑斑病菌遗传转化体系,构建了RFP标记菌株,为研究该病菌的致病机理奠定基础。