七星瓢虫乙酰辅酶A羧化酶基因克隆及表达分析

乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase,ACC)是脂肪酸合成第一步反应的限速酶,参与长链脂肪酸的合成。本试验基于七星瓢虫Coccinella septempunctata L.转录组数据,探究ACC在滞育七星瓢虫脂代谢中的调控作用。利用RT-PCR和RACE技术从七星瓢虫中克隆得到ACC基因全长,命名为CsACC(GenBank登录号:MT012819),该基因cDNA序列全长7 217 bp,开放阅读框(ORF)长为6 792 bp,编码2 263个氨基酸,预测蛋白质分子量为255.9 kDa,理论等电点(pI)为5.90,无跨膜螺旋结构,无信号肽。通过氨基酸多序列比对分析,结果显示CsACC与鞘翅目的赤拟谷盗Tribolium castaneum乙酰辅酶A羧化酶同源性较高。利用实时荧光定量PCR技术检测CsACC基因在七星瓢虫正常发育及滞育诱导不同阶段的相对表达量,结果显示,滞育诱导30 d表达量达到最高,滞育诱导60 d、滞育解除期以及正常发育30 d表达量几乎持平。本研究为揭示CsACC基因在脂代谢通路中的调控作用提供理论依据。     

七星瓢虫保幼激素环氧水解酶基因克隆及表达分析

保幼激素(juvenile hormone, JH)可以调控昆虫滞育,保幼激素环氧水解酶(juvenile hormone epoxide hydrolase, JHEH)是调节保幼激素代谢的关键酶之一。为探索JHEH在七星瓢虫Coccinella septempunctata L.滞育中的调控作用,利用RT-PCR和RACE技术克隆获得七星瓢虫JHEH全长基因,命名为Csjheh(GenBank登录号:MH932586),该基因cDNA全长2 077 bp,开放阅读框(ORF)1 380 bp,编码459个氨基酸,预测蛋白质分子量为51.39 kD,理论等电点(pI)为8.79。疏水性分析结果显示该基因具有典型环氧水解酶的N末端疏水结构。氨基酸序列比对结果表明,Csjheh与中欧山松大小蠹、赤拟谷盗、丽蝇蛹集金小蜂、内华达古白蚁保幼激素环氧水解酶同源性达到64.24%。利用实时荧光定量PCR技术研究其时空表达模式,结果表明Csjheh基因在七星瓢虫成虫初羽化阶段表达量较高,滞育诱导条件下表达量呈先下降后上升的趋势,滞育60 d时与初羽化阶段接近。本研究结果对揭示JHEH参与JH的调控作用,进而调控昆虫滞育提供了理论参考。     

褐飞虱两个酚氧化酶原基因的特性及细菌诱导后的表达分析

为探讨褐飞虱Nilaparvata lugens（Stål）酚氧化酶原基因的发育表达模式及生物学功能,利用转录组数据和RACE方法获得两条褐飞虱酚氧化酶原基因NlPPO1（GenBank No.：ALE32751）和NlPPO2（GenBank No.：ALE32752）全长序列,褐飞虱NlPPO1全长为2316 bp,CDS编码区为2073 bp,编码690氨基酸;NlPPO2全长为2738 bp,CDS编码区为2100 bp,编码699氨基酸。通过实时荧光定量PCR方法检测NlPPO的发育表达模式及注射细菌诱导后NlPPO的表达量变化。发育表达模式结果显示,NlPPO1和NlPPO2在肠中都有较高的表达水平,而NlPPO1在表皮细胞表达量最低,NlPPO2在脂肪体表达量最低;在5龄幼虫阶段NlPPO1随时间增加表达量增加,NlPPO2表达量则维持相对较高水平;在成虫阶段NlPPO1表达量维持在较低水平,NlPPO2随时间增加表达量降低。注射大肠杆菌诱导NlPPO结果表明,诱导24 h后,NlPPO1表达量显著升高,NlPPO2表达量变化差异不显著;注射枯草芽胞杆菌诱导NlPPO结果表明,诱导24 h后,NlPPO1和NlPPO2表达量都显著升高。研究结果显示褐飞虱NlPPO1和NlPPO2的发育表达模式存在差异,对不同菌诱导免疫应答也存在差异,暗示二者具有不同的生物学功能。该结果为进一步探索酚氧化酶原在褐飞虱对病原菌的免疫响应机制奠定基础。     

粘虫过氧化物酶MsPOD基因的克隆及不同温度胁迫的诱导效应

过氧化物酶（POD）是昆虫体内一种很关键的抗氧化酶,在维持昆虫体内氧化还原的动态平衡及保护昆虫免受氧化损伤方面起到重要的作用。本试验通过转录组测序方法获得一条粘虫过氧化物酶基因的cDNA序列,该序列命名为MsPOD（GenBank登录号：MH606240）。该序列全长2433 bp,开放阅读框长度为2061 bp,编码686个氨基酸组成的多肽,分子量约76.1 ku,等电点5.68,具有1个标志性的动物亚铁血红素过氧化物酶细胞粘附蛋白结构域。氨基酸序列比对表明,MsPOD的氨基酸序列与鳞翅目夜蛾科其他昆虫亲缘关系较近,其中与棉铃虫POD氨基酸序列同源性最高,达92%。基因表达水平研究发现,MsPOD基因在不同发育阶段和不同组织中差异表达,在蛹期和唾腺中表达量最高。温度梯度诱导后,MsPOD基因在不同时间点的表达量具有显著差异,经35℃下12 h处理后表达量最高。研究结果为进一步研究过氧化物酶在昆虫体内的保护性作用以及利用该基因进行分子设计来防治粘虫奠定理论基础。     

黏虫几丁质酶MsCHT7基因的克隆、表达及蜕皮激素的调控

几丁质酶是几丁质水解的关键酶,在昆虫生长发育中具有重要作用。本试验通过高通量转录组测序获得黏虫几丁质酶基因cDNA序列MsCHT7（GenBank登录号MG551526）。cDNA全长3360 bp,包含一个长度为2970 bp的开放阅读框,编码989个氨基酸,具有1个糖苷水解酶18家族高度保守序列,2个Glyco_18催化结构域和1个几丁质结合结构域ChtBD2。通过基因表达水平研究发现,黏虫MsCHT7基因在不同发育阶段和不同组织中均有表达,且具有差异性。预蛹期和表皮MsCHT7基因表达量最大,蛹期最后1 d和成虫表达量较高,且幼虫各龄期最后1 d表达量均高于第1 d表达量。20E（20-羟基蜕皮酮）处理幼虫后,不同时间点MsCHT7基因表达量存在显著差异,在1～24 h基因表达量随时间逐渐升高,24 h时最高,之后表达量迅速降低。4种不同浓度20E处理后,MsCHT7基因表达量存在一定差异,当浓度为10 μg/μL时,MsCHT7基因表达量最大。通过生物学观察发现,不同浓度20E处理后5龄幼虫蜕皮时间均提前。由于MsCHT7基因表达量受蜕皮激素调控,MsCHT7可能在黏虫蜕皮过程中发挥一定作用。     

脂肽对稻瘟病菌几丁质酶和葡聚糖酶的影响

 研究经比基尼链霉菌(Streptomyces bikiniensis)HD-087发酵产物脂肽处理后的稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)菌丝体内的几丁质酶活性和β-1,3葡聚糖酶活性的变化情况,分析chit基因和β-1,3 glu基因的表达量变化,旨在探究脂肽抗稻瘟病菌的作用机理。采用HPLC分析法鉴定了S. bikiniensis HD-087产生的脂肽种类,利用荧光定量PCR技术检测稻瘟病菌菌丝中chit基因和β-1,3 glu基因mRNA的表达情况。结果表明S. bikiniensis HD-087产生的脂肽主要是伊枯草素。经EC₉₀浓度的脂肽提取物处理6 h后,稻瘟病菌菌丝中几丁质酶活性和chit基因的mRNA表达量分别比对照组上调了6.77倍和51.27倍;处理12 h后,β-1,3葡聚糖酶的活性和β-1,3 glu基因的mRNA表达量分别比对照组上调了2.44倍和14.13倍。表明脂肽能够诱导稻瘟病菌菌丝体chit基因和β-1,3 glu基因的大量表达,从而破坏细胞壁结构,推测脂肽阻遏了稻瘟病菌的细胞自噬进程。     

青花菜抗坏血酸过氧化物酶基因BoAPX2的克隆与表达分析

 抗坏血酸过氧化物酶（Ascorbate peroxidase,APX）是H₂O₂清除剂,在植物抗逆反应中起着重要作用。根据NCBI发布的过氧化物体抗坏血酸过氧化物酶（Peroxisomal APX, pAPX）基因序列设计简并引物,分别以青花菜（Brassica oleracea var. italica）叶片DNA和cDNA为材料进行PCR扩增,克隆到一个APX基因,命名为BoAPX2,序列提交GenBank,登录号为JN172929。BoAPX2的基因组序列长为2 013 bp,具有8个内含子,编码区全长864 bp,编码287个氨基酸。序列分析结果表明,BoAPX2与已知的过氧化物体APX有较高的相似性,氨基酸的C端具1个跨膜结构域。RT-PCR结果表明,BoAPX2的表达受霜霉病菌（Hyaloperonospora parasitica）、H₂O₂、水杨酸和NaCl诱导。     

小黑瓢虫雌成虫滞育基因的转录组测序分析

为明确小黑瓢虫Delphastus catalinae滞育的分子机制,使用Illumina HiSeq2500高通量测序平台分析小黑瓢虫雌成虫非滞育期、滞育期和滞育解除期的相对转录水平,从转录组测序数据中选取碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）基因、过氧化氢酶（catalase,CAT）基因、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）基因、过氧化物酶（peroxidase,POD）基因、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）基因、海藻糖酶（trehalase,TRE）基因、促葡萄糖转运1蛋白亚基基因Ref和SCoAL琥珀酰辅酶连接酶基因GDP-forming,采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRTPCR)技术检测上述基因在小黑瓢虫雌成虫3个不同时期的表达特征。结果显示,从9个样品中共筛选出67.86 Gb的clean data;936 447条contig被组装成52 255条unigene,所有的unigene都通过BLAST对Nr数据库进行了注释,有23 539...     

温度和光周期对小黑瓢虫滞育的调节作用

在实验室条件下研究了温度（11℃、16℃、21℃、26℃和31℃）和光周期（16L：8D、14L：10D、12L：12D、10L：14D和8L：16D）对小黑瓢虫Delphastus catalinae（Horn）滞育的影响。结果表明,温度、光周期及二者的相互作用均对小黑瓢虫滞育有显著影响。低温和短光照诱导成虫进入滞育。26℃和31℃时,测定的5个光周期均不能诱导滞育;而11℃、16℃和21℃时,滞育率随温度降低或光照时长缩短均呈升高的趋势。11℃和光周期8L：16D是诱导滞育的最适条件。11℃和光周期8L：16D诱导40 d,成虫进入稳定的滞育状态,滞育率高达95.44%。同时发现,滞育成虫产卵前期随温度降低或光照时长缩短而延长。11℃和光周期8L：16D有利于维持滞育,延长成虫产卵前期。21℃和光周期14L：10D加速滞育的解除,缩短成虫产卵前期。     

心叶烟NPR1基因全长cDNA序列的克隆及表达分析

 NPR1(non-expressor of pathogenesis-related gene 1)基因在拟南芥系统获得抗性中起着关键作用,可调控拟南芥植株广谱抗性的发生。本文报道了从心叶烟中克隆NPR1同源基因(NgNPR1)及其表达特性的研究结果。NgNPR1 cDNA全长2253 bp,编码588个氨基酸。将NgNPR1基因组全长与cDNA序列进行比对发现,NgNPR1基因组DNA含有4个外显子和3个内含子。Southern杂交分析表明,在心叶烟基因组中NgNPR1为单拷贝基因。采用绿色荧光蛋白在洋葱表皮瞬时表达的试验,证明了NgNPR1蛋白在水杨酸诱导时会从细胞质转运到细胞核中。Northern杂交分析发现,NgNPR1基因可以被与植物抗病相关的信号分子如水杨酸、茉莉酸甲酯、过氧化氢和乙烯所诱导。进一步研究发现,植物病原物如赤星病菌、青枯病菌和烟草花叶病毒对心叶烟植株的侵染也会使NgNPR1表达量增加。这些结果表明,NgNPR1基因在心叶烟植株抵御病原物侵染过程中可能起着重要作用。     

非昆虫源人工饲料饲养的七星瓢虫对豆蚜的捕食功能

为评价非昆虫源人工饲料饲养七星瓢虫的捕食能力,在室内比较了用人工饲料饲养的七星瓢虫种群和蚜虫饲养的七星瓢虫种群对豆蚜捕食作用的异同。结果表明,两种七星瓢虫种群各虫态的捕食量均随着猎物密度的增加而上升,当猎物密度增加到一定水平,捕食量趋向稳定,捕食功能反应曲线均符合Holling Ⅱ型方程。人工饲料饲养种群的1～4龄幼虫、雌成虫和雄成虫的理论最大日捕食量分别是20.9、36.0、100.2、403.2、490.9和395.3头,蚜虫饲养种群的1～4龄幼虫、雌成虫和雄成虫的理论最大日捕食量分别是20.0、28.9、102.1、476.2、472.2和396.4头。结果说明两种种群各虫态对豆蚜的最大日捕食量差异不大,表明人工饲料饲养的七星瓢虫对豆蚜也有较强的控制作用。     

苹果炭疽叶枯病菌致病相关基因CgNVF1的功能初步分析

苹果炭疽叶枯病是主要由胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起的一种苹果重要叶部病害,严重威胁着苹果树的生长。本研究从构建的苹果炭疽叶枯病菌T-DNA突变体库中筛选获得一株致病力缺失的突变菌株A3083,采用hiTAIL-PCR方法克隆了该突变体T-DNA插入位点的右翼序列;通过与胶孢炭疽菌基因组序列比对分析,发现T-DNA插入位点位于1个预测的CGGC5_9603基因内,并将该基因命名为CgNVF1。CgNVF1基因全长2252 bp,含有2个内含子,编码709个氨基酸。CgNVF1定位于细胞质,在苹果炭疽叶枯病菌菌丝、分生孢子和附着胞中均有表达。通过构建CgNVF1敲除菌株和CgNVF1互补菌株,并结合表型分析,证实CgNVF1基因在苹果炭疽叶枯病菌附着胞形成及致病中具有重要的作用。     

桃蛀螟细胞色素P450基因CYP4G113时空表达及功能研究

CYP家族基因是昆虫体内重要的解毒酶基因,本研究拟明确桃蛀螟体内解毒酶基因CYP4G113的基本序列特征、表达模式及其在桃蛀螟适应性进化中的功能.基于桃蛀螟转录组数据信息,克隆获得桃蛀螟CYP4G113的开放阅读框;利用实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技术,测定...     

茶足柄瘤蚜茧蜂脂代谢相关的滞育关联基因差异表达分析

本文对茶足柄瘤蚜茧蜂滞育组与正常发育组进行转录组测序,筛选差异表达基因,根据功能注释发现这些滞育关联基因主要与碳水化合物代谢、脂质代谢以及信号转导等途径相关。借助KEGG数据库,共筛选出滞育期间401个与脂代谢相关的差异基因,在滞育期间呈现不同程度的上调表达,涉及了脂肪酸生物合成、甘油脂代谢、类固醇生物合成等代谢途径,除与脂质合成相关的脂肪酸合成酶、超长链脂肪酸延伸酶基因上调表达外,与脂质分解相关的酶,如酯酶同样上调表达,可能与提高茶足柄瘤蚜茧蜂免疫力有关;与激素合成相关基因的上调表达,可能抑制茶足柄瘤蚜茧蜂卵巢发育。     

褐飞虱clip丝氨酸蛋白酶基因NlCSP4的克隆及功能分析

Clip丝氨酸蛋白酶（clip-domainserineprotease,CSP）是广泛存在于昆虫体内的一类结构保守、功能多样的蛋白质水解酶类,在昆虫生长、发育和免疫等诸多生理过程中发挥重要功能。本研究克隆并鉴定获得一个褐飞虱CSP编码基因NlCSP4(GenBank登录号：OK018340）,其cDNA序列全长1911bp,编码636个氨基酸,预测蛋白质分子量为69.29kD,等电点为9.02。NlCSP4蛋白N端包含一段由25个氨基酸残基组成的信号肽和一段由44个氨基酸残基组成的clip结构域,C端具有CSP蛋白家族典型的Tryp＿SPc结构域,且其中包含特异性保守的His-Asp-Ser催化中心三元件。系统发育分析表明NlCSP4与其他同属半翅目昆虫的CSP在NJ进化树上聚为一支,而与鳞翅目昆虫CSP亲缘关系较远。qRT-PCR分析显示,NlCSP4基因表达具有明显的时空特异性,其在雌成虫中的表达量最高,且高龄若虫期（4龄和5龄）表达量显著高于卵期和1～3龄若虫期;NlCSP4基因在褐飞虱雌成虫脂肪体、肠道和卵巢中均有表达,且在脂肪体中表达量最高;金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性细菌）...     

玉米衰老相关蛋白基因ZmSAP的克隆与表达分析

利用立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)诱导胁迫下玉米高耐纹枯病自交系幼苗叶片所构建的cDNA文库中获得的EST序列,通过电子克隆和RT-PCR方法,结合cDNA末端快速扩增技术,从玉米叶片中分离克隆到衰老相关蛋白基因的全长cDNA序列,命名为ZmSAP(GenBank登录号:GU253311)。序列分析表明,ZmSAP全长1156bp,包含一个完整的603bp的开放阅读框(ORF),具有连续的Poly A尾和典型的加尾信号AATTAA。ProtParam程序预测表明该基因编码200个氨基酸,相对分子量为21.92kD,等电点为10.38。该氨基酸序列与豌豆、挪威云杉、寄生藻等有不同程度的同源性且在不同物种间具有一个保守结构域,染色体定位发现该基因位于玉米第1条染色体上。荧光定量PCR分析表明,在高耐纹枯病自交系R15和高感纹枯病材料478中ZmSAP基因在病菌胁迫初期呈诱导表达,可能参与了病原菌诱导的细胞程序性死亡过程,说明该基因与纹枯病菌胁迫响应机制密切相关。     

意大利蝗越冬卵抗寒物质分析

意大利蝗Calliptamus italicus是新疆草原主要优势危害种,以滞育卵越冬.为弄清意大利蝗越冬卵发育及滞育过程的抗寒机制,本研究检测了自然条件下越冬卵的糖类、多元醇、脂肪和氨基酸等主要抗寒物质的含量变化,分析蝗卵发育过程不同阶段抗寒物质含量的变化趋势.结果表明,意大利蝗卵在越冬过程中,除脂肪含量无显著差异外...     

水稻VQ37基因的克隆及其在病原侵染下的表达

 VQ蛋白作为转录辅助蛋白,在植物的生长、发育和抗逆等生理过程中发挥重要的调节功能。本研究采用RT-PCR从水稻叶片中克隆了VQ37基因的完整cDNA序列。VQ37 cDNA长622 bp,具有长为546 bp的完整开放读码框,编码蛋白质长181个氨基酸,具有FxxxVHxVTG的VQ基序变体。系统进化分析表明,水稻VQ37与短花药野生稻(Oryza brachyantha)、大麦(Hordeum vulgare)和Dichanthelium oligosanthes等禾本科植物亲缘关系近;除水稻旁系同源物VQ39外,VQ37与短花药野生稻中的XP 015699121亲缘关系最近。原生质体瞬间表达实验证实VQ37定位在细胞核中。荧光定量PCR分析显示,VQ37基因的组织特异性表达和诱导表达结果与启动子顺式元件预测基本一致。VQ37在叶片中的表达丰度最高,其次是叶鞘、茎、穗、根和花,在胚和胚乳中无表达。VQ37受纹枯病菌(Rhizoctonia solani)和稻瘟病菌(Magnaporthe oryza)显著诱导,而不受白叶枯细菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)诱导;与此一致的是,VQ37受真菌病原相关模式(PAMP)分子几丁质寡糖快速诱导,而不受细菌鞭毛蛋白flg22影响。茉莉酸甲酯和乙烯利能显著诱导VQ37的表达,而水杨酸对其表达无明显影响。上述结果提示,VQ37可能调控水稻对稻瘟病菌和纹枯病菌防御反应,这种调节作用可能依赖于茉莉酸/乙烯介导的信号途径,而与水杨酸信号途径无关。该研究为阐释水稻VQ37基因在水稻抗病反应中的调节功能提供了基础。