猪细小病毒NS1基因的克隆及表达

根据Bergeron等报道的猪细小病毒基因组序列设计引物，在下游引物中引入BglⅡ酶切位点以便于构建表达载体。利用PCR技术扩增得到NS1全基因，将其克隆到pMDl8-T载体中进行序列测定并分析，进而构建重组转移载体pFast-NS1，在DH10Bac大肠杆菌中与改造过的苜蓿夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)基因组(Bacmid)发生同源重组，获得重组穿梭载体Bacmid—NS1，经脂质体介导转染Sf9细胞后，得到重组杆状病毒(AcNPV-NS1)。SDS—PAGE、West-ern-blotting分析可见大小约为84000的特异性带，表明NS1蛋白在杆状病毒：Bac-To-Bac表达系统中成功地实现了表达。从而为研究其结构与功能创造了条件。     

猪细小病毒NS1基因密码子偏爱性分析

为给猪细小病毒（Porcineparvovirus,PPV）主要非结构蛋白（NS1）基因选择良好的宿主表达系统提供参考依据,本研究运用EMBOSS在线分析软件的CHIPS和CUSP程序对PPVNS1基因进行密码子偏爱性分析。结果显示PPVNS1基因的CAI值为0．642,ENC值为39．703,这表明NS1在密码子使用上存在较明显的偏爱性,且第三位核苷酸尤其偏爱A或T;从与PPVNS1基因密码子使用频率比值上看,使用频率差异较大的在大肠杆菌有33个、酵母有26个、人有27个;PPVNS1基因共有71个大肠杆菌稀有密码子,并且还有多个稀有密码子多次串联成簇出现的情况。结果表明酵母等真核生物与其密码子偏爱性较为接近,可作为该基因体外表达宿主的首选。     

鹅细小病毒NS1基因的克隆及原核表达

本研究根据GenBank发表的GPVB株全基因核苷酸序列，设计了1对用以扩增GPV主要非结构蛋白NS1基因的引物。通过PCR技术，扩增出NS1完整基因片段1．9kb。将PCR产物克隆到pMD18-T载体后进行序列测定及分析，结果表明：GPV H1株NS1基因全长1884bp，编码627个氨基酸，与国外已发表的B株核苷酸序列同源性为98．15％。同时将该目的基因正向插入到GST融合蛋白原核表达载体PGEX-6P-1的BamH1多克隆位点，构建了GPV NS1的原核表达载体，成功的表达了约97KD的NS1融合蛋白。     

猪细小病毒NS基因原核表达与多克隆抗体制备

旨在制备抗猪细小病毒(PPV)非结构蛋白共有氨基酸的NS多肽多克隆抗体。根据GenBank(MK993540)公布的PPV基因组序列,克隆其非结构蛋白NS1、NS2共有基因序列(NS基因),并进行生物信息学分析。进而将NS基因克隆至原核表达载体pET-32a,构建重组质粒pET-32a-NS,转化至大肠埃希菌Rosetta(DE3)中进行诱导表达,利用镍柱亲和层析技术纯化表达的重组多肽,用重组多肽免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体。结果显示,PPV杨凌株NS基因长258bp,编码86个氨基酸的多肽,是具有亲水性的非跨膜NS多肽,具有大量的B细胞线性表位。NS多肽在37℃、0.8mol/L IPTG条件下,诱导6h有大量的可溶性表达。免疫印迹试验结果显示,该多肽具有较好的抗原性。用纯化NS多肽免疫小鼠后获得鼠抗NS多肽的血清抗体效价为1∶12800。用制备的NS多克隆抗体检测纯化的NS重组多肽及真核表达的NS1蛋白,均能检测出相应特异性条带,为进一步研究NS蛋白在PPV致病过程中的作用奠定了基础。     

猪细小病毒YK株NS1基因的克隆与序列分析

提取猪细小病毒（PPV）YK株基因组DNA，利用PCR技术扩增得到了NS1基因全序列，将其克隆到pMD 18-T质粒载体并进行了序列测定和分析。结果表明，NS1基因全长1989bp，编码662个氨基酸。氨基酸序列中含有在PPV复制过程中起重要作用的保守基序GKRN，并有3个潜在的糖基化位点NISN、NFSN和NLTR。PPV YK株的NSl基因与其他PPV毒株NADL-2（4973）株、NADL-2（5075）株、NADL-2（5034）株和Kresse株相比，核苷酸同源性分别为98．3％、99．9％、99．9％和99．7％，氨基酸同源性分别为99．7％、99．7％、99．7％和97．7％。结果说明，NS1基因具有高度保守性。     

猪细小病毒SH-1株VP2和NS1基因的克隆与原核表达

通过PCR技术,从感染了猪细小病毒的ST细胞中扩增出猪细小病毒的VP2基因和NS1基因,并将其亚克隆至原核表达载体中,分别构建了重组表达载体pET32c/VP2和pET30a/NS1,经IPTG诱导,使pET32c/VP2和pET30a/NS1在受体菌BL21(DE3)中得到高效表达。经Western-blot检测具有生物学活性,为猪细小病毒野毒与疫苗毒的鉴别诊断奠定基础。     

猪细小病毒NS1蛋白的表达与鉴定

为了获得具有良好免疫学活性的猪细小病毒(PPV)基因工程抗原,试验采用原核表达方法对猪细小病毒NS1蛋白进行了表达研究。结果表明:成功克隆了大小为1 389 bp的NS1基因主要抗原区域,经IPTG诱导获得了大小为60 ku、以包涵体形式表达的重组蛋白。利用6×His-Tagged Protein Purification Kit获得了高纯度的纯化蛋白,纯化蛋白能与PPV阳性血清发生特异性反应,以纯化蛋白作为包被抗原的间接ELISA方法与血凝抑制试验(HI)的符合率为97.92%。说明试验成功获得了体外表达的NS1重组蛋白,且重组蛋白具有良好的免疫学活性。     

猪细小病毒非结构蛋白NS1基因的克隆、序列分析及蛋白质结构预测

根据GenBank登录的猪细小病毒NADL-2株和China株序列,利用Oligo 6.0软件设计1对扩增NS1全基因的特异性引物,对从贵州省安顺地区检测到的PPV的NS1基因进行扩增、克隆、测序、序列分析和蛋白质结构预测分析。测序结果表明,扩增的目的基因长度为1986 bp,共编码659个氨基酸,其中NS1基因的1287、1288和1298位碱基发生了缺失,导致429、430和433位氨基酸发生缺失。系统发生树结果表明,本试验测序的NS1基因与NADL-2弱毒株处在同一进化分支;氨基酸同源性与NADL-2弱毒株和Kresse毒株最高,均为98.6%。蛋白质结构预测分析结果表明,非结构蛋白NS1的分子质量为75269.76 u,理论等电点pI为7.25,不稳定系数为41.57,推测其为不稳定蛋白质;脂肪指数为73.58,总体平均亲水性为-0.565,推测该蛋白质是一种亲水性蛋白质;该蛋白质含有丰富的α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲,柔性区域较多,呈连续分布;非结构蛋白NS1无跨膜区和信号肽;预测非结构蛋白NS1含有3个N-糖基化位点、3个cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点、5个蛋白激酶C磷酸化位点、22个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、1个酪氨酸激酶磷酸化位点、8个N-肉豆蔻酰化位点、1个酰胺化位点及1个ATP/GTP结合位点基序A(P-环);该蛋白质抗原表位较多,存在10个主要的抗原表位。     

猪细小病毒NS1基因低温诱导表达及间接ELISA方法的建立

利用PCR技术从猪细小病毒的DNA模板中扩增了NS1的基因片段,将PCR产物克隆至pET32c载体,将构建好的重组质粒pET32c-NS1,转入表达宿主茵BL21中,利用低温诱导表达的方法,避免了包涵体的形成.West-ern-blot结果显示,表达产物有良好的生物活性.纯化后的重组蛋白作为抗原,包被酶标板,建立了检测猪细小病毒特异性抗体的间接ELISA方法.抗原最佳包被质量浓度为2.5 mg/L、血清最佳稀释度为1∶200.表达的NS1蛋白可作为免疫诊断试剂用于检测PPV,且能很好的区别灭活疫苗免疫猪和自然感染猪.     

猪细小病毒NS2基因mRNA的克隆和序列分析

为了研究NS2基因的表达及其功能,试验用猪细小病毒PPV-BQ株接种传代培养的ST细胞,并提取复制过程中的总RNA,反转录成cDNA;通过RT-PCR扩增出NS2基因mRNA的片段(长约486bp)和NS2基因前体mRNA片段(长约1959bp);分别将2个目的片段克隆到pMD18-T载体上并进行序列测定和分析。结果表明:PPV-BQ株NS2基因mRNA片段与GenBank已发表的核苷酸序列同源性为97.4%～99.4%,推导氨基酸序列同源性为94.4%～98.8%。说明PPV-BQ株与四川SR-1分离株、加拿大Kresse分离株、美国NADL-2分离株亲缘关系较近。     

鹅细小病毒YBLJ株NS1基因的克隆及生物信息学分析

为了克隆鹅细小病毒(GPV)NS1基因,并对其进行生物信息学分析,试验参照Gen Bank发表的GPV全基因组序列(U25749)设计扩增GPV-NS1基因的1对特异引物,经PCR扩增,将克隆的GPV-NS1基因进行TA克隆和转化,对鉴定正确的质粒进行测序,并对测序结果进行生物信息学分析。结果表明:YBLJ株GPV-NS1基因全长1 884 bp,编码627个氨基酸,与其他11株GPV的NS1基因核苷酸同源性为93.6%~99.9%,氨基酸同源性为96.2%~99.8%;蛋白二级结构中α螺旋占31.42%,β折叠占19.30%,无规则卷曲占49.28%;蛋白三级结构中α螺旋和β折叠占GPV-NS1总蛋白的一半以上的比例。说明GPV-NS1基因和其编码的氨基酸均较保守,尤其氨基酸更为保守,提示NS1蛋白虽然是非结构蛋白,但其对于GPV应该是至关重要的功能蛋白。     

贵阳地区犬细小病毒NS1基因的克隆及序列分析

为了解贵阳地区犬细小病毒(CPV)非结构蛋白NS1的遗传变异进化状况,试验采用PCR检测、分子克隆、测序及生物信息学软件对分离自贵阳的8株CPV的NS1基因进行序列分析。结果表明:成功扩增并克隆测序得到8株CPV NS1基因,全长为2 007 bp,共编码668个氨基酸;分离株间NS1基因核苷酸序列的同源性为98.4%～99.8%,与10株犬类参考毒株CPV NS1基因序列的同源性为98.3%～99.6%,与其他11株非犬类参考毒株NS1基因核苷酸的同源性为39.4%～99.1%。说明CPV NS1基因具有一定的种属特异性,其亲缘关系越近同源性越高。     

犬细小病毒YBYJ株NS1基因的克隆及序列分析

为了克隆YBYJ株犬细小病毒(CPV)NS1基因,并对其进行序列分析,试验选择Gen Bank中的CPV-NS1基因(登录号为NC_001539)序列设计1对特异性引物,以延边大学预防兽医学实验室分离的CPV YBYJ株为毒株,经PCR扩增得到NS1基因,将其克隆至p MD18-T simple载体,然后进行基因测序和序列分析。结果表明:YBYJ株CPV-NS1基因大小为2 007 bp,编码668个氨基酸,与国内外其他10株CPV-NS1基因的核苷酸同源性为98.0%~99.7%,氨基酸同源性为96.7%~99.7%。提示CPV-NS1基因变异较小,遗传进化相对稳定。     

猪源流感病毒NS1基因的克隆及原核表达

对H3N2亚型猪流感病毒NS1基因进行原核表达,获得纯化表达产物,以期为检测猪流感抗体的ELISA试剂盒的研制奠定基础。采用RT-PCR方法扩增H3N2亚型猪源流感病毒的NS1基因（693bp）,并将该片段克隆至pET-28（a）构建重组表达质粒pET-NS1。将重组质粒转化E．coli BL21（DE3）感受态细胞,以终浓度1mmol／L的IPTG在不同时间进行诱导表达,SDS-PAGE检测蛋白表达情况,并经Western-blot分析表达产物的抗原性。pET—NS1重组表达质粒表达的NS1蛋白相对分子质量约为26kD,1mmol／L的IPTG诱导4h时蛋白表达量达到高峰。Western-blot印迹分析证实表达蛋白能与阳性血清发生特异性反应,而与阴性血清不反应。NS1基因的原核表达产物可用来鉴别流感感染猪群和灭活疫苗免疫猪群。     

猪细小病毒SY-99株非结构蛋白NS1基因的克隆及序列分析

猪细小病毒（Porcine parvovirus,PPV)SY-99株由本室分离，提取SY－99株的基因组DNA，利用PCR扩增出全长NS1基因，将该基因克隆到 核表达载体pET28a中并测序。结果表明，NS1基因全长1989bp，编码662个氨基酸，氨基酸序列中含有PP 制过程中发挥重要作用的保守基序GKRN，并有3个潜在的糖基化位点，分别位于356－359、446－449、513－516位氨基酸处，SY－99株NS1基因与其它PPV毒株NADL2－1、NADL2－2、Kresse株核苷酸同源性分别为98％、99％、99％，氨基酸同源性分别为97％、99％、995。SN1基因的克隆为研究NS1在PPV的复制中所发挥的功能及利用人工表达的NS1来制备诊断抗原提供了可能。     

猫细小病毒NS部分基因的克隆及序列分析

将疫苗用猫细小病毒(FPV)株提取基因组DNA,针对NS特定片段设计引物,利用PCR扩增出了部分基因并将该基因克隆到pMD18-T Vector中测序.结果表明,该基因长613bp,编码204个氨基酸.分离株基因与犬的细小病毒(CPV)、貂的细小病毒(MEV)毒株核苷酸同源性均为99%.氨基酸同源性达到97%、98%以上,与犬、貂的肠炎病毒有密切的亲缘关系.     

猫细小病毒CC-1株NS1全基因的克隆及序列分析

根据GenBank中收录的猫细小病毒(FPV)CU-4株基因序列设计引物,扩增本实验室分离保存的FPV CC-1株NS1基因,并进行序列测定。结果表明,该毒株NS1基因序列长度约为2.35 kb,该基因的阅读框总长为2007 bp,编码668个氨基酸。该序列与FPV193/70株、PLI-IV株、TU-2株、CU-4株、94-1株和X J-1株的NS1基因比较,核苷酸的同源性分别为99.0%、98.9%、98.8%、98.7%、98.6%、99.4%,氨基酸的同源性分别为98.8%、98.7%、98.5%、98.7%、98.5%、99.3%。该毒株与犬细小病毒(CPV)、貂细小病毒(MEM)、大鼠细小病毒(RPV)、猪细小病毒(PPV)、鹅细小病毒(GPV)、鼠细小病毒(MVM)NS1的进化树分析表明,它与MEM和CPV的亲缘关系比较近,与PPV的亲缘关系较远。     

猪细小病毒VP2基因的克隆、测序与原核表达

利用PCR技术从猪细小病毒的RF DNA模板中扩增了含有VP2全基因的2.0kb的基因片段，将PCR产物克隆至pMD18-T载体，利用双脱氧末端终止法测定了VP2全基因的核苷酸序列。将所得的核心苷酸序列和推导的氨基酸序列分别与GenBank中的相应序列进行同源性比较，同源性均在99%以上，从而说明该蛋白的碱基序列和氨基酸序列均具有高度的保守性。将VP2全基因分别克隆入原核表达载体pET15(b)、pET17(b)和pET28(b)构建成表达质粒pET15bVP2、pET17bVP2和pET28bVP2；将含有VP2基因起始位点至EcoRⅠ切点间的0.8kb片段克隆入pET17(b)中构建成表达质粒pET17bVP2f。利用上述四种质粒转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导后SDS-PAGE检测表达情况，结果发现pET17bVP2f质粒在45kD处有一特异性表达带，而其它几种质粒均未看到特异性表达带，推测VP2基因3‘端的某些结构可能对VP2全基因的表达有一定影响。这一结果对研究VP2基因的结构与功能具有重要意义。     

猪细小病毒PPV-SD1株VP2全基因的克隆及原核表达

为研究猪细小病毒PPV-SD1分离株的VP2蛋白的结构与功能,自行设计引物,通过PCR扩增的方法,获得VP2全基因,克隆到pMD18-T载体中进行测序,然后亚克隆到pET30a(+)表达载体中,构建并筛选出阳性重组子,标记为pET30a-VP2。将阳性重组质粒转化进RosettaTM宿主菌中,通过改变IPTG浓度、诱导温度和诱导时间,使重组蛋白获得表达,并确定最佳诱导条件为:IPTG终浓度1.0 mmol/L、诱导温度37℃、诱导时间为3~4 h。经SDS-PAGE和Western-blotting分析表明该重组蛋白相对分子量约为68 ku,具有良好的免疫学活性。