褐色橘蚜RR-2型表皮蛋白基因鉴定及功能分析

为明确褐色橘蚜Toxoptera citricida RR-2型表皮蛋白基因的数量、表达特性及其在发育中的潜在功能,运用转录组数据和生物信息学软件对其进行鉴定和分析,利用实时荧光定量PCR技术测定其在褐色橘蚜不同发育阶段、有翅/无翅成蚜及不同组织中的表达量,并利用RNAi方法探索其在褐色橘蚜生长发育过程中的潜在功能。结果显示,共筛选鉴定出45个CPR（cuticular protein with R&R Consensus）家族基因,其中33个有完整的开放阅读框,具RR-2型CPR家族特有的签名序列及与几丁质结合必需的酪氨酸和苯丙氨酸残基,推测这些序列编码的RR-2型CPR具有几丁质结合活性。系统发育分析表明大部分褐色橘蚜RR-2型CPR同源性较高。TcCPR10、TcCPR14、TcCPR28和TcCPR68基因在褐色橘蚜若虫蜕皮后表达量较高;TcCPR7、TcCPR10、TcCPR28和TcCPR57基因主要在褐色橘蚜胸腹部表达,在相同组织中TcCPR10和TcCPR68基因在有翅蚜中的表达量显著低于在无翅蚜中的表达量。TcCPR7和TcCPR68基因可被有效沉默,其表达量分别下调26.62%和66.34%,但仅TcCPR68基因的沉默可导致褐色橘蚜大量死亡,存活率仅为36.45%,极显著低于对照组。表明褐色橘蚜RR-2型CPR家族基因的表达具有较强的时空特异性,可能在不同虫态、不同组织中发挥着不同功能;TcCPR68基因可能在褐色橘蚜发育过程中起重要作用。     

蚜虫蛋白质组双向电泳体系条件优化

为优化有效分离蚜虫全蛋白的双向电泳体系,以豌豆蚜Acyrthosiphon pisum (Harris)为材料,比较了不同蛋白提取方法(裂解液提取法、三氯乙酸/丙酮沉淀法、饱和酚抽提法)、蛋白上样量、IPG胶条pH梯度等条件对蚜虫全蛋白双向电泳的影响。结果表明:不同的蛋白提取方法所获得的豌豆蚜全蛋白提取率有显著差异,其中以饱和酚抽提法的提取率最高,为5.34±0.26 mg/g,且所提取的蛋白种类丰富度也优于其它2种方法;当蛋白上样量为100 μg时所得蛋白点为1 793±36个,高于其它上样量;相同条件下选用11 cm pH 3~10非线性IPG胶条时所得蛋白点为1 803±42个,优于pH 4~7的IPG胶条。表明采用饱和酚抽提法进行提取蛋白,选用11 cm pH 3~10非线性IPG胶条,以蛋白银染方法、分离胶浓度为12.5%进行双向电泳时最适蛋白上样量为100 μg,所得可识别蛋白质点最高,且重复性试验匹配率高,可用于豌豆蚜蛋白质组学研究。     

桃蚜基因组DNA提取及SSR反应体系优化和应用

针对蚜虫体型微小,体表有外骨骼等特点对改进的醋酸钾（KAC）法作了优化,优化后的方法可在常温条件下更加简易和有效地提取高质量的单头蚜虫基因组DNA,结果表明,DNA样品的A260/280值普遍在1.6～1.9之间,电泳检测基因组DNA纯度和完整性较好。同时在20 μL的反应体系中将PCR的5个主要成分分别设定10个浓度梯度,研究了适合桃蚜SSR分子标记的优化体系,结果表明,最适宜的优化浓度分别为：1.5 mmol/L Mg2+,0.25 mmol/L dNTP,1.0U Taq酶,40 ng/μL模板DNA,25 ng/μL引物。利用甘肃省酒泉地区马铃薯桃蚜来验证此优化体系,30%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果显示,扩增产物大多在100～300 bp,多态性高,且反应体系的稳定性和可重复性好。     

橘小实蝇蛋白饵剂田间应用及效果评估

应用橘小实蝇蛋白饵剂主要有悬挂诱集瓶和点喷两种方式,为了提高田间应用效果,研究了稀释倍数、使用量和周期等对引诱效果的影响。结果表明,悬挂诱集瓶和点喷使用时,稀释2倍的效果最佳;对橘小实蝇的引诱效果均随着使用量的增加而增加,最佳使用量分别为15mL和30mL;使用周期均为5d。悬挂诱集瓶试验结果中发现,适当提高pH可提高引诱效果,pH为6时引诱效果最佳,引诱数量为6.67头,其中雌虫和雄虫分别为4.67头和2.00头;比较不同寄主果园和不同地点中应用效果时发现,杨桃果园里的引诱效果比柑橘和蜜柚果园好,引诱数量为5.00头;公园、果园和校园的引诱数量分别为11.73、7.00头和5.33头。点喷应用的试验结果表明,添加量为0.20%马拉硫磷效果最佳,成虫死亡数量为7.67头。     

低温贮存、僵蚜粘贴部位及田间条件下苹果棉蚜蚜小蜂羽化率研究

本文研究了不同温度下贮存、苹果绵蚜粘贴方式对苹果棉蚜蚜小蜂羽化率的影响,调查了苹果棉蚜蚜小蜂在苹果园的自然寄生率、羽化率。结果表明,10℃贮存1 d、15℃贮存1~2 d、20℃贮存1~15 d对苹果棉蚜蚜小蜂羽化率无影响;苹果绵蚜僵蚜腹面粘贴时,苹果棉蚜蚜小蜂羽化率(64.71%)显著高于侧面粘贴和背面粘贴的效果(分别为53.13%和55.94%);7月上旬至9月中旬苹果园中苹果棉蚜蚜小蜂自然寄生率较高(35.46%~53.00%),7月上旬至8月中旬苹果棉蚜蚜小蜂自然羽化率较高(24.62%~37.36%)。     

适用于双向电泳分析的链格孢菌体蛋白提取方法的筛选

为筛选出一套适用于双向电泳分析的链格孢菌蛋白的提取方法,以该菌为研究材料,首先采用TCA-丙酮法、磷酸-TCA-丙酮法、SDS提取法和TCA/丙酮-SDS/酚抽提法分别提取菌丝蛋白质,然后进行蛋白质浓度的测定和单向SDS-PAGE试验,并建立双向电泳体系。结果表明:TCA/丙酮-SDS/酚抽提法所获得的蛋白质浓度为15.9 mg/mL,分别是其他三种方法所得蛋白浓度的2.64、4.61和1.43倍;SDS-PAGE图谱中形成的条带数目最多、丰度最好;所获得的2-DE图谱背景清晰干净,无明显的横纵条纹,分辨率高,可辨别的蛋白质点数为1 138个,是TCA-丙酮法所分离蛋白点数的1.89倍。由此可知,TCA/丙酮-SDS/酚抽提法为链格孢菌蛋白提取的最优方法,该方法所提取的蛋白质适用于双向电泳分析及后续的蛋白质组学研究。     

丽蚜小蜂糖转运蛋白基因克隆及其诱导表达

丽蚜小蜂Encarsia formosa Gahan是粉虱类害虫的重要寄生性天敌昆虫,补充糖分等营养可以延长丽蚜小蜂寿命及增加其产卵量,但对其糖转运相关蛋白基因及其糖诱导表达尚不清楚。本研究克隆获得丽蚜小蜂的糖转运蛋白EfST1基因,与其他寄生蜂的糖转运蛋白基因序列同源性达65%以上;进一步采用实时荧光定量qPCR技术检测发现,饲喂不同浓度的葡萄糖溶液均可显著提高EfST1基因的表达量,且饲喂不同时间段（2～48 h）后,丽蚜小蜂EfST1基因表达量均显著高于对照组,2 h和48 h处理组间差异不显著。综上,EfST1基因可能与糖分补充及其转运密切相关,该基因诱导表达受糖分浓度影响小。研究结果为进一步研究寄生蜂生物防治过程中补充营养及其转运机制奠定基础。     

酸水解对提高橘小实蝇蛋白饵剂中总游离糖含量的影响

为了提高蛋白饵剂中总游离糖的含量,采用酸水解的方法,通过单因素试验和正交试验对糖类水解酸浓度、水解温度和水解时间3个影响因素进行分析.在本试验范围内,最佳水解条件为酸(盐酸)浓度2.5 mol/L,温度为95℃,时间为3h.水解酸(盐酸)浓度对糖类的水解影响最显著,其次是水解温度,水解时间影响最小.     

麦长管蚜信号传导G蛋白β亚基基因克隆与组织分布

根据所有已知G蛋白亚基的保守区设计简并性寡核苷酸引物,通过3'-和5'-RACE方法结合RT-PCR技术,从麦长管蚜中分离全长cDNA序列,并用半定量RT-PCR的方法研究基因在不同组织的转录水平.克隆的β亚基序全长1336bp,编码340个aa,推测的分子量为37.27kDa,等电点为5.56.GenBank BLAST结果表明,β亚基与冈比亚蚊Anopheles gambiae的氨基酸序列同源性最高,为93%,与果蝇Drosophila melanogaster β的同源性为90%,与线虫Caenorhabditis elegans 的同源性为85%,与哺浮动物β2的同源性为可以参与多种信号传寻途径的调控.该基因首次从麦蚜中克隆到,命名为SavGβ,在Gen Bank中的登录号为AY205294.     

针茅属植物RAPD条件优化

本试验以针茅属 ( Stipa L.)植物为材料 ,使用 CTAB法提取其基因组 DNA,通过对 RAPD( Random amplified polymorphic NDA,随机扩增的多态性 )条件优化分析 ,初步确定了针茅属植物 RAPD的最佳方案 ,即在 PCR扩增程序为 94℃预变性 3min,94℃变性 1 min,37℃复性 1 min,72℃延伸 1 .5 min,设 45个循环 ,最后 72℃保温 5 min时 ,2 5μL反应体系中包括 :0 .2 μL( 1 0 mmol/L) d NTPs,2 .0 μL( 1 0 mmol/L) Mg2 + ,0 .5 μL( 1 0 0 pmol/μL)引物 ,模板DNA80 ng,Taq酶 ( Sangon) 1 .0 U,2 .5 μL1 0×buffer缓冲液 ,其余部分用无菌三蒸水补平可以得到较好的扩增结果。     

甘草愈伤组织蛋白质组双向电泳技术的建立

以来源于野生乌拉尔甘草的愈伤组织为试材,对甘草愈伤组织蛋白质的提取、SDS-PAGE电泳、上样量、染色方法等关键步骤进行了优化,结果表明:采用改良丙酮法可提高提取液中蛋白质的含量及单向电泳图谱的分辨率;17 cm IPG胶条上样量为450μg时,采用银染法提高了双向电泳图谱的分辨率及分离效果,获得了1 132个蛋白点。建立了一套适用于乌拉尔甘草的愈伤组织蛋白质组分析的双向电泳方法。     

感染马铃薯Y病毒烟株对烟蚜取食行为及烟蚜茧蜂适应性的影响

为探明烟蚜茧蜂Aphidius gifuensis Ashmead对烟蚜Myzus persicae(Sulzer)取食感染马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)烟株的适应性,利用刺探电位图谱(EPG)技术记录了烟蚜在感病烟株与健康烟株上的取食行为,并测定了烟蚜茧蜂对取食2种烟株烟蚜的寄生率以及烟蚜茧蜂的羽化率、发育时间及性比等指标。结果表明,与健康烟株相比,烟蚜在感染PVY烟株上的第1次刺探取食持续时间显著延长,且口针遇到阻力的次数(F波)和总持续时间均显著减少。烟蚜在感病烟株木质部的吸食时间(G波)显著长于健康烟株。感病烟株上烟蚜在韧皮部阶段的分泌唾液时间(E1波)较在健康烟株上显著缩短,而被动吸食汁液时间(E2波)显著延长。烟蚜茧蜂寄生取食感染PVY烟株的烟蚜,虽然能成功完成其生活史,但适应性与寄生取食健康烟株烟蚜的蚜茧蜂存在差异。在感染PVY烟株上,烟蚜茧蜂对烟蚜的寄生率为33.67%,显著低于对照的64.67%;且僵蚜体重明显下降,羽化的成蜂个体较小;成蜂存活时间1.48 d也极显著短于对照组的2.25 d。表明烟蚜茧蜂对取食感染PVY烟株烟蚜的适应性较低,PVY可通过烟蚜为介体间接降低烟蚜茧蜂的适应力。     

棉铃虫脂肪酸结合蛋白的克隆与表达

为深入了解棉铃虫Helicoverpa armigera脂肪酸结合蛋白HaFABP1在参与细胞内脂肪酸代谢过程中的功能,基于酵母单杂交结果从幼虫中肠cDNA中扩增得到HaFABP1的开发阅读框,构建重组菌株BL21-pET28a-HaFABP1,进行融合蛋白His-HaFABP1的诱导和纯化,并利用实时荧光定量PCR检测棉铃虫不同时期和组织中HaFABP1的表达规律,最后检测2-十三烷酮处理下棉铃虫6龄幼虫中肠组织内HaFABP1的变化情况。结果显示,克隆获得的棉铃虫HaFABP1为405 bp,编码134个氨基酸,相对分子量和等电点分别为15.08 kD和5.54;在37℃下用0.5 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组菌株4 h后,得到约18.4 kD的可溶性蛋白His-HaFABP1,纯化后的融合蛋白条带单一且大小符合预期;HaFABP1在棉铃虫的脂肪体、中肠、体壁和头部中都有表达,在头部的表达量最低,在中肠中的表达量最高;HaFABP1在棉铃虫幼虫的每个发育时期都有表达,表达量总体呈现先降低后升高的趋势,4龄时最低而1龄时最高;10 mg/g 2-十三烷酮处理饲料饲喂棉铃虫6龄幼虫6 h和15 h后,中肠内HaFABP1的表达量与对照相比显著提高,且随着时间的延长逐渐增加。表明HaFABP1与棉铃虫的生长发育有关,并且有可能参与了昆虫的解毒过程。     

烟蚜热激蛋白Hsp90基因的克隆及在UV-B胁迫下的表达分析

为探讨UV-B胁迫对烟蚜Myzus persicae热激蛋白Hsp90基因表达量的影响,采用RT-PCR与RACE技术克隆了烟蚜热激蛋白Hsp90基因的全长,并对其进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR技术研究了烟蚜Hsp90基因在不同时长UV-B胁迫下的表达量变化。结果表明,烟蚜Hsp90基因的cDNA全长为2 670 bp,编码728个氨基酸,编码蛋白质的相对分子量为82.6 kD,等电点为4.95,获得的氨基酸序列具有Hsp90蛋白家族的1个签名序列及C末端MEEVD基序,推测其属于胞质型热激蛋白。系统进化树结果显示,烟蚜Hsp90与其它昆虫Hsp90具有很高的相似性。实时荧光定量PCR结果表明,不同时长UV-B胁迫下烟蚜Hsp90均有表达,随着照射时间延长,Hsp90表达量表现为先上升后下降的趋势;与对照相比,照射时间为15、30、60、90和120 min时,Hsp90表达量均显著升高,且在60 min时Hsp90表达量达最大,是对照组的2.05倍。表明Hsp90基因在不同时长UV-B胁迫下差异表达,在烟蚜适应紫外胁迫的分子机制中具有重要作用。     

麦二叉蚜唾液蛋白基因Sg1655时空表达谱及其抑制小麦防御反应的功能

为进一步明确麦二叉蚜Schizaphis graminum唾液蛋白Sg1655在调控小麦防御反应中的作用,基于麦二叉蚜唾液腺转录组数据,利用PCR技术克隆获取Sg1655开放阅读框,利用生物信息学软件对其序列进行分析;通过实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR,RT-qPCR）技术检测Sg1655在麦二叉蚜不同组织及不同龄期中的表达;利用细菌III型分泌系统将Sg1655导入到小麦叶片内,检测其瞬时表达对小麦胼胝质积累的影响。结果表明,Sg1655开放阅读框全长375 bp,编码125个氨基酸残基,N端1~21位为信号肽序列,预测蛋白分子量为14.90 kD。麦二叉蚜Sg1655氨基酸序列与玉米蚜Rhopalosiphum maidis同源序列相致性最高,为89.52%;麦二叉蚜Sg1655与玉米蚜同源序列聚为一个分支,亲缘关系最近。Sg1655在麦二叉蚜各组织中均有表达,其中在唾液腺中表达量最高,Sg1655在麦二叉蚜各个龄期均有表达,且在不同龄期之间无显著差异。小麦叶片内Sg1655瞬时表达可显著抑制小麦胼胝质积累,表明该蛋白可作为潜在效应子参与抑制小麦防御反应。     

柑橘大实蝇GSTd1基因的克隆、原核表达及重组蛋白GSTd1的酶学特征

为深入研究柑橘大实蝇Bactrocera minax嗅觉系统中气味信号降解机制,对柑橘大实蝇头部转录组进行分析,筛选谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)基因,对其进行序列测定和分子生物学分析,利用实时荧光定量PCR技术检测该基因在柑橘大实蝇成虫各组织中的表达模式,并对该基因进行克隆和原核表达,采用Western blot对获得的编码蛋白GSTd1进行检测,并分析该蛋白的酶学特征。结果显示,成功获得1条具有完整开放阅读框的GST基因,将其命名为GSTd1,该基因完整开放阅读框为624 bp,编码207个氨基酸残基,预测蛋白分子量为23.72 kD,等电点为6.16,无信号肽,不含跨膜结构域,属于胞质型GST蛋白。序列比对和系统进化树分析结果表明柑橘大实蝇GSTd1属于昆虫特有的GST蛋白的Delta亚家族成员。柑橘大实蝇GSTd1基因在柑橘大实蝇成虫触角中的相对表达量最高。柑橘大实蝇GSTd1重组蛋白具有催化其通用底物1-氯-2,4-二硝基苯(1-chloro-2,4-dinitrobenzene,CDNB)的能力,最大反应速度和米氏常数分别为...     

南方根结线虫MiV901基因在拟南芥中的异源表达及其表型分析

为明确南方根结线虫Meloidogyne incognita效应蛋白MiV901在其寄生过程中的生物学功能,通过构建MiV901基因的植物表达载体,利用根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导的花序浸染法将其转化拟南芥Arabidopsis thaliana,并采用室内人工接种法测定转基因植株对灰葡萄孢 Botrytis cinerea侵染及南方根结线虫寄生的影响。结果显示：经Southern blot检测,MiV901基因以不同的拷贝数插入到转基因拟南芥株系901-6、901-8和901-12的基因组中,且qPCR检测结果证实 MiV901基因能够正常表达。3个转基因拟南芥株系901-6、901-8和901-12叶部接种灰葡萄孢3 d后,叶片上形成的病斑平均直径分别为1.00、1.06、1.05 cm,比野生型对照扩大了9.9%~16.5%。相比野生型对照,转基因拟南芥株系901-12、901-6和901-8接种南方根结线虫2龄幼虫后根系上产生了更多的雌虫和卵块,雌虫数分别显著增加了45.4%、34.4%和23.7%,卵块数分别显著增加了51.2%、 46.3%和31.7%。表明异源表达MiV901基因能够抑制植物免疫,增加拟南芥对灰葡萄孢和南方根结线虫侵染的敏感性。     

京水菜种子SU1抗菌蛋白的纯化、稳定性和抑菌机制

为拓展抗菌蛋白在新型生物农药上的潜在应用价值,通过SP-Sepharose阳离子交换层析、Mone S阳离子交换层析和Superdex 75凝胶过滤层析从京水菜Brassica juncea var. multisecta种子中纯化得到一种分子量约为30 kD的SU1抗菌蛋白,采用纸片扩散法测定该抗菌蛋白的稳定性和抑菌活性,并采用荧光染色法分析其抗菌机制。结果表明,在pH为1～3和11～13条件下,SU1抗菌蛋白抑菌活性不受影响;40～80℃热处理和100 mmol/L Mn~(2+)、Al~(3+)、Zn~(2+)、Cu~(2+)、Fe3+、Pb~(2+)、Mg~(2+)、K~+和Cr~(3+)离子处理后,该抗菌蛋白仍具有抑菌活性,而100 mmol/L Ca~(2+)离子处理后该抑菌蛋白的抑菌活性消失。此外,乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)溶液处理后SU1抗菌蛋白的抑菌活性消失,再次加入Cr~(3+)离子时,其抑菌活性恢复。SU1抗菌蛋白能抑制7种植物病原真菌的生长,可破坏尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum菌丝细胞膜透性和细胞核的完整性,并引起线粒体膜电势增加和菌丝细胞脱氧核糖核酸的分解。