酵母双杂交BBTV DNA2 ORF诱饵质粒构建及其互作蛋白筛选

 香蕉束顶病毒DNA2组分编码蛋白的功能尚不清楚,为了揭示其编码蛋白的功能,以本实验室保存的BBTV Haikou4分离物总DNA为模板进行PCR扩增,利用Gateway重组技术将BBTV DNA2 ORF构建到酵母双杂交系统(ProQuest^TM Two-Hybrid System, Invitrogen)的诱饵载体pDEST-32中,并通过酵母表型验证、诱饵质粒毒性验证以及自激活验证。结果显示,转有pDEST32-DNA2 ORF质粒的MaV203酵母菌具有弱的自激活背景,在3-AT 浓度为25 mmol/L的SeC-Leu-Trp-His平板上生长较弱,但在3-AT 浓度为50 mmol/L SeC-Leu-Trp-His 平板上不生长,表明诱饵质粒背景自激活可被浓度为50 mmol/L的3-AT 所抑制。在该条件下共转pDEST32-DNA2 ORF和文库质粒到MaV203感受态细胞进行互作蛋白筛选,通过PCR和测序等手段最终鉴定35个候选蛋白基因,分别编码转录调控因子、生长发育相关蛋白、代谢相关蛋白、抗逆相关蛋白和未知蛋白等。酵母双杂交BBTV DNA2 ORF诱饵质粒的构建及其与寄主互作蛋白的筛选,为揭示DNA2组分的蛋白功能提供了科学线索。     

葡萄VvSUC12基因启动子的克隆及上游调控因子鉴定

枝干病害葡萄溃疡病近年来严重限制了葡萄产业发展。研究表明葡萄蔗糖转运蛋白参与寄主植物和病原菌的互作过程。为解析蔗糖转运蛋白VvSUC12在葡萄免疫反应过程中的功能,本研究克隆了VvSUC12基因翻译起始位点上游1 500 bp的启动子区,通过生物信息学分析发现该区域包含4个Dof转录因子结合序列(A/TAAAG)及多种激素调节与防御相关的顺式元件。实时荧光定量分析显示,接种可可毛色二孢菌显著诱导VvSUC12和VvDof19基因的表达。通过酵母单杂交实验筛选得到与VvSUC12启动子互作的转录因子VvDof19。酵母双杂交实验证实VvDof19具有自激活活性;进一步通过烟草瞬时表达发现Dof19-GFP的相对GUS活性约为对照GFP的9倍,表明转录因子VvDof19能够激活VvSUC12基因的表达。研究结果为深入研究蔗糖转运蛋白在葡萄免疫反应中的功能奠定基础。     

大麦条纹花叶病毒中国株编码βC蛋白可以自身相互作用

以分别含有BSMV-CH基因组3个组分ds-cDNA全长的pMD-α、pMD-β和pMD-γ质粒为模板,PCR扩增BSMV-CH编码各蛋白基因,克隆至酵母双杂交载体,检测各蛋白是否存在自身激活特性,用酵母双杂交分析BSMV-CH编码蛋白之间的相互作用情况,测定β-半乳糖苷酶活性确认蛋白在酵母体内的作用,Western-blot分析蛋白的体外相互作用。结果表明成功克隆到BSMV-CH编码蛋白基因,并正确克隆至酵母双杂交载体,酵母双杂交检测未发现BSMV-CH编码蛋白之间的相互作用,但确定BSMV-CH编码的βC蛋白可以自身相互作用,体外可以单体或二聚体形式存在。     

苹果树腐烂病菌转录因子VmSte12的鉴定及功能分析

 Ste12是最早在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中发现的一类转录因子。之后在部分丝状真菌中也发现了该类转录因子的存在,并证明其能够参与调控生殖生长以及病原真菌的致病力。然而,苹果树腐烂病菌(Valsa mali)中是否存在该类转录因子以及其功能尚不明确。本研究基于生物信息学鉴定苹果树腐烂病菌中Ste12的同源基因,采用烟草瞬时表达系统进行蛋白亚细胞定位分析,利用酵母单杂技术进行转录激活功能分析,进而利用PEG介导的原生质体转化技术构建基因缺失突变体,并对其进行表型观察与分析。结果表明,苹果树腐烂病菌存在Ste12的同源基因,我们将其命名为VmSte12。该基因编码701个氨基酸,包含Ste同源结构域和C₂H₂锌指结构域。VmSte12定位于细胞核,并具有体外转录激活功能。与野生型相比,VmSte12敲除突变体生长速率平均下降10.1%,分生孢子器数量平均下降94.6%,致病力平均下降27.4%。可见,VmSte12具有Ste12类转录因子特征,并且极有可能在腐烂病菌的生长、繁殖、致病等方面发挥重要作用。     

转录因子OsEIL2正调控水稻对纹枯病的抗性

纹枯病(sheath blight)是水稻三大病害之一,对水稻产量和品质造成严重影响。基因芯片数据分析发现,水稻受到纹枯病菌侵染时,与拟南芥EIN3同源的基因OsEIL2表达量显著升高,预示OsEIL2与水稻对纹枯病的抗性反应相关。利用农杆菌介导的方法,构建了OsEIL2-RNAi植株,实时荧光定量RT-PCR分析表明,该基因被特异性沉默,接种结果显示,OsEIL2沉默后,水稻对纹枯病菌感病性增强。通过水稻原生质体和烟草亚细胞定位分析,发现该基因定位于细胞核,酵母单杂交结果表明,该基因具有转录激活活性。在OsEIL2-RNAi植株中,乙烯合成关键酶的编码基因OsACO1表达量下降。综上,OsEIL2是一个与拟南芥EIN3蛋白同源的转录因子,能正调控水稻对纹枯病的抗性。     

4个禾本科植物NAC基因家族的系统进化及其在玉米中的干旱表达谱分析

利用生物信息学方法,对4个禾本科物种玉米、高粱、二穗短柄草和水稻的NAC基因家族进行鉴定和系统进化分析。结果表明：4个禾本科物种共556个NAC 基因可以聚类为6个进化枝;物种内NAC转录因子有相似的理化性质,但在进化枝上又表现出差异,进化枝1、2、3和进化枝4、5、6分别表现出相似的相对分子质量,进化枝1、2、3、5表现出相似的等电点,进化枝4、6表现出相似的等电点;4个物种共鉴定出27个含跨膜结构域的NAC基因,并且大部分（88.9%）都位于进化枝4上;使用溯源法共鉴定出174个禾本科祖先基因,每个物种NAC基因丢失和保留都存在差异;基因复制分析发现,串联复制对禾本科NAC基因家族扩张贡献明显（20.3%,113/556）,而玉米的大片段复制事件对玉米NAC基因家族扩张贡献明显（30.5%,50/164）;干旱胁迫下玉米转录表达分析鉴定出51个差异表达基因,且不同组织内的差异表达基因数目存在差异,叶和雌穗内的差异表达基因数目多于雄穗。     

三七NAC基因家族全基因组鉴定与表达分析

为明确三七Panax notoginseng NAC转录因子基因家族的分布、功能和结构,通过生物信息学分析法进行鉴定,对其理化特性、染色体位置和进化特征进行分析,并根据RNA-seq数据分析其家族成员的时空表达模式和受黑斑病菌Alternaria panax诱导后的表达情况。结果显示,三七中共有98个NAC基因家族成员,其编码蛋白质长度介于104～882个氨基酸之间,分子量在11.78～100.20 kD之间,等电点在4.12～9.75之间。这98个NAC基因家族不均匀地分布在三七的12条染色体上,其中1号染色体分布最多（16个）,而11号染色体上分布最少（1个）。三七NAC基因启动子区域存在与光响应、生长素响应、赤霉素响应及茉莉酸甲酯响应等相关的多种顺式作用元件。NAC基因在三七不同组织及根部不同发育时期均有表达,在受到黑斑病菌侵染的叶片中NAC部分基因家族成员显著上调表达。表明NAC基因家族在三七的生长发育和响应黑斑病菌侵染过程中具有重要作用。     

利用酵母双杂交筛选与致病疫霉菌效应蛋白PITG_07586互作的寄主蛋白

 致病疫霉是引起马铃薯晚疫病的病原菌,其分泌的效应蛋白是侵染寄主的重要毒力因子。本研究在致病疫霉转录组中筛选到一个侵染早期表达的效应蛋白基因PITG_07586(GenBank:XM_002904522.1)。该基因全长447 bp,其编码蛋白包含1个信号肽,1个核定位信号序列(RRRRKRRKKKK)。在本氏烟草中,瞬时表达该基因显著促进病原菌侵染。亚细胞定位表明GFP-PITG_07586定位在细胞核中。利用酵母双杂交技术并以PITG_07586为诱饵筛选马铃薯cDNA文库,最终获得3个靶标蛋白。经序列比对分析,这3个靶标蛋白分别是马铃薯POM30蛋白、电压依赖阴离子通道蛋白VDAC以及SRC2类蛋白。研究结果为致病疫霉菌效应蛋白PITG_07586及其靶标蛋白如何调控植物免疫提供重要依据。     

杨扇舟蛾颗粒体病毒经口侵染因子PIF0~PIF6间分子互作的酵母双杂交验证

为阐明杨扇舟蛾颗粒体病毒(Clostera anachoreta granulovirus,ClanGV)的口服侵染机制,利用酵母双杂交技术,通过双向互作方法研究了ClanGV的经口侵染因子PIF0、PIF1、PIF2、PIF3、PIF4、PIF5和PIF6之间的分子互作情况。自激活试验证明,PIF5的重组诱饵载体(B5)有自激活现象,其它重组诱饵载体均无自激活现象。酵母双杂交试验结果表明,ClanGV的4个经口侵染因子PIF1～PIF4之间存在双向互作现象,而且这4个蛋白均能同时与自身发生互作,暗示这4个经口侵染因子有可能是以二聚体或多聚体的形式存在并发挥功能。在ClanGV经口侵染因子间的6组单向互作中,PIF5作为捕获载体时分别能与PIF1、PIF3和PIF4发生互作,PIF6作为诱饵载体时分别能与PIF3和PIF4发生互作,PIF0作为捕获载体时能与PIF4发生互作。表明ClanGV的经口侵染因子像核型多角体病毒(nucleopolyhedrovirus,NPV)一样,在病毒粒子表面通过分子互作形成复合体并在病毒的经口侵染过程中发挥功能。     

苦荞麦WRKY15转录因子基因的分子克隆及其在叶斑病原与激素诱导下的表达分析

苦荞麦(Fagopyrum tataricum)叶斑病由链格孢(Alternaria alternata)和黑孢霉(Nigrospora osmanthi)引起。WRKY转录因子在植物免疫调节过程中发挥重要作用。研究苦荞麦FtWRKY15在叶斑病原与激素诱导下的表达，为深入解析FtWRKY15在植物抗病反应中的功能与机理奠定基础。采用逆转录PCR克隆获得了FtWRKY15的完整编码序列，长537 bp,编码178个氨基酸。FtWRKY15具有1个WRKY保守结构域，锌指类型为CCHH,属于WRKY IIc亚组。同源序列比对与系统进化分析表明，FtWRKY15与FtWRKY76的氨基酸序列同一性最高(64.0%),其次是藜麦(Chenopodium quinoa) WRKY50 (52.3%)。原生质体瞬时表达分析表明FtWRKY15定位在细胞核中，与亚细胞定位预测结果一致。酵母单杂交实验表明FtWRKY15具有转录激活活性，其N端为酸性结构区(30～60位),富含丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸磷酸化位点，可能负责转录激活。实时荧光定量PCR分析表明FtWRKY15在叶、花中的表达丰度最高，其次...     

基于酵母双杂交系统筛选灰飞虱体内与大麦黄条点花叶病毒核衣壳蛋白互作的蛋白质

 为了获取影响大麦黄条点花叶病毒(BYSMV)在灰飞虱体内增殖、积累和传播的相关介体因子,本研究利用分离泛素酵母双杂交膜系统,以BYSMV核衣壳蛋白(N)为诱饵对灰飞虱cDNA文库进行了筛选。 将BYSMV N基因构建到诱饵载体pDHB1上进行表达检测和功能验证,结果表明重组载体pDHB1-N能在酵母内正常表达并行使功能。利用诱饵载体筛选pPR3-N空文库对文库筛选条件进行优化,确定3-氨基-1,2,4-三唑(3-AT)浓度为12 mmol·L^-1的QDO平板为筛选文库培养基条件,去除可能存在的轻微筛库背景。在此筛选条件下以诱饵载体从灰飞虱cDNA文库中筛选得到57个阳性克隆,序列比对结果表明这些阳性克隆编码17种候选蛋白,包括表皮蛋白、泛素B、核糖体膜相关蛋白、细胞色素b5以及海藻糖转运蛋白等。 经酵母双杂交共转验证和β-半乳糖苷酶检测进一步确认了这17个候选蛋白与BYSMV N发生互作。本研究成功从灰飞虱分离泛素酵母双杂交膜系统cDNA文库筛选到与BYSMV N互作的蛋白质,为进一步探索弹状病毒与介体昆虫的分子互作机制奠定了基础。     

N‐acetylcysteine interferes with the biofilm formation,motility and epiphytic behaviour of Xanthomonas citri subsp. citri

Citrus canker is caused by Xanthomonas citri subsp. citri. Bacterial biofilm formation is important in the development of this disease because it is a factor in epiphytic bacterial survival on leaves and in infection. N‐acetylcysteine (NAC), in addition to having antibacterial properties, reduces biofilm formation by a variety of bacteria and was therefore tested for impairing biofilm formation by X. citri. Copper is currently the antimicrobial compound most commonly applied in agriculture to control citrus canker. Therefore, this study also evaluated a possible synergistic effect between NAC and copper to improve the strategy for controlling this phytopathogen. NAC was found to decrease biofilm formation, the production of extracellular polysaccharides and bacterial stickiness. Motility was also affected in the presence of NAC. The best combination of NAC and copper for controlling X. citri was application of NAC followed by copper 48 h later. The concentrations of 6 mg mL^?1 of NAC and 3·5 μg mL^?1 of copper were able to kill X. citri. NAC inhibited the epiphytic behaviour of X. citri on leaves, altering cell growth and the bacterial ability to form biofilms. The addition of copper to cells previously treated with NAC enhanced its bactericidal activity. In conclusion, NAC has antibacterial properties against X. citri, interfering with bacterial growth, motility and biofilm formation. Under epiphytic conditions, NAC made the cells more susceptible to copper by affecting X. citri biofilm formation. This study opens new possibilities for the use of NAC in combination with copper, possibly resulting in more sustainable management of citrus canker.     

Interaction between the helicase domain of the tobacco mosaic virus replicase and a tobacco arginine decarboxylase

In a yeast two-hybrid screening test for tobacco proteins that interact with TMV replicase using the helicase (H) domain as bait, a cDNA clone was selected that encodes a polyamine biosynthetic enzyme, arginine decarboxylase (ADC). In yeast cells, the C-terminal internal region of ADC interacted with the H domain. This observation was confirmed in vitro by far-Western blotting. Inhibition of the binding between the H domain and the IRnHEL (I region and N-terminus of helicase domain) region by ADC using a yeast three-hybrid assay suggested possible interference of the heterodimerization of 126K and 183K by ADC.The nucleotide sequence data of pADCF reported in this study is available in the DDBJ/EMBL/GenBank databases under accession number AB110952     

沼泽红假单胞菌蛋白Rhp-PSP对烟草花叶病毒的系统抗性诱导及互作蛋白筛选

本文研究了蛋白Rhp-PSP诱导烟草抗TMV过程中相关防御酶的活性以及丙二醛（MDA）含量的变化，同时测定了抗病相关基因的表达情况。试验证明，蛋白Rhp-PSP处理烟草后，叶片中苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）的活性显著提高，但降低了MDA含量。同时基因PR-1、PR-3、PR-5、PDF1.2表达显著上调，证明了蛋白Rhp-PSP具有诱导烟草产生抗TMV的活性。为阐明诱导抗性机制，利用酵母双杂交系统从烟草cDNA文库进行互作蛋白的筛选并验证，结果表明GPI锚定蛋白、VAN3结合蛋白及叶绿素结合蛋白A与蛋白Rhp-PSP互作。     

Dithiocarbamate fungicide zineb induces oxidative stress and apoptosis in Chinese hamster lung fibroblasts

Dithiocarbamate fungicide zineb leads to disturbances in many cellular processes in Chinese hamster fibroblasts (V79 cells). We observed high apoptotic activity and oxidative stress induced in vitro by exposure of V79 cells to zineb demonstrated by statistically significant increase in lipid peroxidation (measured as TBARS - thiobarbituric acid reactive substances) as well as disturbances in glutathione homeostasis. Zineb also inhibited activity of topoisomerase I. Zineb did not show any effect on protein oxidation (measured by protein carbonyls content). N-acetyl-l-cysteine (NAC) suppressed cellular changes induced by this fungicide in V79 cells. NAC pre-treatment prevented TBARS production and significantly decreased the number of apoptotic cells induced by zineb. These results show that zineb can disturb many cellular processes via oxidative damage.     

内质网应激因子NAC089突变体的创建及其对病毒侵染胁迫的响应

 有研究表明烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus, TMV)或黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)侵染烟草能够激活转录因子NbNAC089,从ER膜移至细胞核。为进一步阐释内质网应激因子NbNAC089对病毒侵染胁迫的响应机制,利用CRISPR/Cas9技术构建敲除载体,经烟草遗传转染获得NbNAC089基因突变植株。植株接种病毒后采用qRT-PCR检测病毒CP基因和寄主UPR基因的表达。结果表明:CRISPR/Cas9系统定点敲除NbNAC089基因后,目的基因靶位点序列有碱基的置换与缺失。正常生长条件下,转基因植株与野生型无差异。植株接种TMV-GFP后24~96 h,突变体中UPR基因(BiP、bZIP28、bZIP60)的表达量显著高于野生型;接种TMV-GFP后2~6 d突变体中病毒的积累量和扩展速度显著高于野生型。表明NbNAC089为UPR的抑制因子,对病毒增殖具有负调控作用。