牛白细胞介素15基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

根据GenBankTM中发表的牛IL-15基因序列设计并合成了特异性引物,以经LPS和ConA刺激的牛外周血单个核细胞提取的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出长度约500 bp的目的基因片段,并将该基因克隆到pMD18-T载体上.酶切、PCR及序列测定结果表明,获得了牛IL-15全长基因的克隆.进一步通过PCR方法得到缺失其N端48个氨基酸的信号肽序列的牛IL-15成熟蛋白基因,将其亚克隆到原核表达载体pET-32a上,构建重组表达质粒pET-IL-15,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,该菌表达以包涵体形式存在的相对分子质量约为33 000的融合蛋白.用Ni螯合层析方法纯化表达的蛋白.Western-blot试验显示表达的重组融合蛋白能与抗6×His的单克隆抗体发生反应,同时也能与鼠抗猪IL-15的多克隆抗体发生明显交叉反应.     

青杆分子伴侣PwTCP-1基因的克隆及表达分析

分子伴侣TCP-1在调节植物生长发育过程中具有重要作用,但在林木生长发育及对非生物逆境胁迫响应机制方面的研究较少.从青杆cDNA文库中筛选出1个分子伴侣PwTCP-1(T-complex polypeptide 1)片段,通过RACE-PCR技术获得Pw TCP-1的末端序列,经过与EST序列拼接,获得PwTCP-1 cDNA全长序列.使用clustalx、Mega5.0、DNAMAN和Expasy等工具对Pw TCP-1的理化性质、二级结构和三级结构进行生物信息学分析.结果显示,PwTCP-1 cDNA全长为2 024 bp,开放阅读框1 605 bp,编码534个氨基酸残基的蛋白质,其理论分子质量为59.2kDa,理论等电点为6.12,富含α-螺旋.通过RT-qPCR技术检测了PwTCP-1组织特异性表达、激素响应模式及在种子萌发过程中表达量变化.结果表明:Pw TCP-1在青杆各个组织中均有表达,在花粉中表达量最高,在茎中表达量最低;Pw TCP-1表达量随着种子萌发先上升,在第4天达到最高,之后缓慢下降.PwTCP-1能响应多种激素处理.油菜素内酯(brassinolide,BR)和赤霉素(gibberellin,GA)分别处理后,Pw TCP-1的表达量均显著降低,而茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)处理后该基因表达量极显著升高.这些结果显示,PwTCP-1可能参与植物种子萌发过程并响应了多种激素反应过程.     

牛IgG Fc受体Ⅱ胞外区在大肠杆菌中的表达及特性鉴定

从牛肺巨噬细胞cDNA文库中扩增编码牛IgGFc受体Ⅱ(boFcγRⅡ)胞外区基因,PCR产物经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后,插入原核表达载体pET28a的T7启动子下游,构建重组表达质粒pETboRⅡ。以pETboRⅡ转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析诱导表达菌体可见分子量约为27kDa的蛋白条带,该表达蛋白在细胞质中主要以不溶性包涵体形式存在。Westernblotting和Dotblot检测表明,boFcγRⅡ重组蛋白在变性条件下可与牛IgG特异结合,提示牛FcγRⅡ胞外区可能存在IgG线性结合表位。     

牛支原体武威株脂蛋白P48基因的克隆、原核表达及亚细胞定位

【目的】验证牛支原体P48蛋白在细胞中的位置,并为后续功能的研究奠定基础.【方法】运用Overlap PCR扩增获得点突变后的牛支原体武威分离株P48基因,并将其克隆至pGEM-T Easy,将测序正确的质粒克隆至表达载体pET-28a中,构建原核表达质粒pET-P48,表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),并在IPTG诱导下成功获得融合蛋白表达产物rMbP48,大小约为51ku.重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体.在分离牛支原体膜蛋白的基础上应用Western-blot及间接ELISA对P48蛋白在细胞中的分布进行分析.【结果】P48蛋白主要存在于牛支原体的膜分离相.全菌免疫荧光试验进一步证实脂蛋白P48位于牛支原体的膜表面.【结论】牛支原体P48蛋白是存在于牛支原体表面的一种具有免疫原性的脂蛋白.本研究为进一步研究P48蛋白的生物学特性及建立高效的牛支原体诊断方法奠定了基础.     

青杄分子伴侣PwTCP-1基因的克隆及表达分析

分子伴侣TCP-1在调节植物生长发育过程中具有重要作用,但在林木生长发育及对非生物逆境胁迫响应机制方面的研究较少。从青杄cDNA文库中筛选出1个分子伴侣PwTCP-1(T-complex polypeptide 1)片段,通过RACE-PCR技术获得PwTCP-1的末端序列,经过与EST序列拼接,获得PwTCP-1 cDNA全长序列。使用clustalx、Mega5.0、DNAMAN和Expasy等工具对PwTCP-1的理化性质、二级结构和三级结构进行生物信息学分析。结果显示,PwTCP-1 cDNA全长为2 024 bp,开放阅读框1 605 bp,编码534个氨基酸残基的蛋白质,其理论分子质量为59.2 kDa,理论等电点为6.12,富含α-螺旋。通过RT-qPCR技术检测了PwTCP-1组织特异性表达、激素响应模式及在种子萌发过程中表达量变化。结果表明:PwTCP-1在青杄各个组织中均有表达,在花粉中表达量最高,在茎中表达量最低;PwTCP-1表达量随着种子萌发先上升,在第4天达到最高,之后缓慢下降。PwTCP-1能响应多种激素处理。油菜素内酯(brassinolide,BR)和赤霉素(gibberellin,GA)分别处理后,PwTCP-1的表达量均显著降低,而茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)处理后该基因表达量极显著升高。这些结果显示,PwTCP-1可能参与植物种子萌发过程并响应了多种激素反应过程。      

外源蛋白在大肠杆菌中高效可溶性表达和胞外分泌策略研究综述

采用大肠杆菌作为表达宿主进行蛋白质异源表达的研究逐渐增多,然而实验过程中存在2个突出问题:(1)可溶性表达量低;(2)胞外分泌能效差。该文系统地综述了当前的国内外研究现状,内容涉及外源蛋白在大肠杆菌中高效可溶性表达策略及胞外分泌策略,并对实验中存在的问题和和研究趋势提出了见解。部分策略已用于实验教学并取得了良好的教学效果。     

牛分枝杆菌MPB83基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

为观察重组MPB83蛋白的免疫活性,揭示该蛋白在牛结核病的诊断和防治中的作用,克隆了牛分枝杆菌MPB83基因,构建了克隆载体pGEM-MPB83和表达载体pET30a-MPB83,经IPTG诱导在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,用SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物并进行蛋白纯化。试验结果表明:牛分枝杆菌MPB83基因体外扩增产物与预期值相符,约600 bp;所构建表达质粒pET30a-MPB83经测序,结果与预期一致;SDS-PAGE分析表明,该融合蛋白以包涵体的形式表达,其分子质量约为26 ku,蛋白表达量占菌体总蛋白的20%;该蛋白经电洗脱纯化后,纯度达95%以上;免疫印迹分析表明,原核表达的融合蛋白可与兔抗牛分枝杆菌多克隆抗体结合,并且具特异的免疫反应性。     

甘蔗分子伴侣ShDnaJ基因克隆及在甘蔗线条花叶病毒胁迫下的表达分析

【目的】克隆甘蔗分子伴侣基因Sh DnaJ,并分析其在甘蔗线条花叶病毒（SCSMV）胁迫下的表达模式,为探究ShDnaJ基因在甘蔗应答SCSMV侵染过程中的功能和作用机制提供理论参考。【方法】通过同源克隆技术克隆ShDnaJ基因完整开放阅读框（ORF）序列,利用生物信息学软件对其进行分析,再利用绿色荧光蛋白（GFP）融合表达法分析ShDnaJ蛋白的亚细胞定位,采用实时荧光定量PCR检测ShDnaJ基因在甘蔗不同组织及在SCSMV胁迫下的表达水平。【结果】ShDnaJ基因ORF全长1260 bp,编码419个氨基酸残基,蛋白分子量为45682.47 Da,理论等电点（pI）为8.78,属于稳定的亲水蛋白,含有DnaJ结构域,属于DnaJ超家族成员,定位于内质网。ShDnaJ蛋白的二级结构由113个α-螺旋、31个β-转角、78个延伸链和197个无规则卷曲组成。ShDnaJ蛋白与高粱SbDnaJ蛋白的氨基酸序列相似性最高,为96.93%,说明两者亲缘关系最近。ShDnaJ基因在甘蔗根、茎和叶中均有表达,且根和茎中的相对表达量显著高于叶中（P<0.05,下同）,但未成熟茎Sh DnaJ...     

牛尿酸氧化酶基因的原核表达载体构建与表达研究

为了研究牛尿酸氧化酶(urate oxidase; EC 1. 7. 3. 3)的原核表达并优化表达条件,构建pETUO尿酸氧化酶原核表达载体,优化牛尿酸氧化酶的原核表达条件,对表达的尿酸氧化酶的活性进行测定.结果显示,表达的牛尿酸氧化酶大小为34 ku.在42℃的最适温度下,测定该酶活力达到9 U·mL-1.文中对原核表达牛尿酸氧化酶的意义做了进一步的探讨.     

传染性造血组织坏死症病毒囊膜蛋白在原核细胞中的表达

通过RT-PCR获得了传染性造血组织坏死症病毒(infectious hematopoietic necrosis virus,IHNV)囊膜糖蛋白(G蛋白)基因,并将其克隆入新型MBP(麦芽糖结合蛋白)融合表达质粒pMAL-c2X,构建重组质粒pMAL-c2X/IHNVG并转入大肠杆菌Rossetta-gami2(DE3)splyS.经IPTG诱导后.表达出包含全长G蛋白在内、预期分子质量为99 ku的融合蛋白.基于anti-MBP抗体的Western blot鉴定证实表达蛋白存在.     

山羊PTHrP基因CDs区克隆及其融合蛋白的表达

【目的】克隆山羊甲状旁腺相关肽(Parathyroid hormone related protein,PTHrP)基因,并进行原核表达,获得具有生物学活性的融合蛋白。【方法】无菌采集山羊乳腺组织,采用TRIZOL法提取总RNA,RT-PCR克隆山羊PTHrP基因全CDs区。将山羊PTHrP基因全CDs区插入pET-32a(+)表达质粒构建pET-PTHrP质粒,经酶切和测序鉴定后,将其转化E.coliBL21(DE3)菌株,经2mmol/LIPTG、37℃诱导表达8h后,进行SDS-PAGE和Westernblotting分析。【结果】获得了山羊PTHrP基因全CDs区,长534bp(GenBank登录号GU573787);酶切和测序显示,原核表达载体pET-PTHrP构建成功;SDS-PAGE和Westernblotting分析表明,在E.coliBL21(DE3)中成功诱导表达了pET-PTHrP融合蛋白。【结论】克隆了山羊PTHrP基因,获得了PTHrP融合蛋白。     

中国奶牛牛支原体流行病学调查分析

为调查中国奶牛养殖地区牛支原体(Mycoplasma bovis)的流行情况,从2013—2019年,在中国6个奶牛养殖区域集约化牧场,通过随机采样收集犊牛鼻拭子1 878份,对样品进行M.bovis分离鉴定,并分析M.bovis阳性率时间分布,空间分布以及犊牛日龄与M.bovis阳性率的关系。结果表明:1)空间上,中国不同奶牛养殖地区,M.bovis阳性率是不同的。其中西北区(38.7%)高于华东区(35.6%)、华北区(33.6%)、华中区(30.8%)、华南区(29.9%)和西南区(27.1%)。2)时间上,2013—2015年M.bovis 阳性率平均值为47.9%,三年间M.bovis阳性率差异不显著(P>0.05)。2016—2019年,M.bovis阳性率平均值为21.1%,四年间M.bovis阳性率无显著性差异。2013—2015年M.bovis 阳性率显著高于2016—2019年M.bovis 阳性率(P<0.05)。3)季节上,夏秋季节M.bovis平均阳性率为31.3%,冬春季节M.bovis阳性率平均值为33.9%,不同季节M.bovis阳性率差异不显著(P>0.05)。4)通过线性回归分析,表明M.bovis 阳性率与犊牛日龄呈正相关。综上,2013—2019年,中国奶牛养殖地区M.bovis阳性率平均值为32.6%,M.bovis在中国呈长期流行趋势。季节并不影响M.bovis在犊牛中的流行。M.bovis阳性率与犊牛日龄呈线性正相关。本研究丰富了中国奶牛养殖地区牛支原体流行情况数据,从病原学角度为预防和临床用药提供重要的数据支撑。     

溶藻弧菌外膜蛋白OmpK的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】构建溶藻弧菌外膜蛋白OmpK原核表达载体,优化OmpK蛋白的诱导表达条件,制备OmpK蛋白小鼠多克隆抗体。【方法】通过PCR扩增获得ompK基因,连接pET-32a质粒构建OmpK-pET32a载体,将其转化大肠杆菌BL21后进行诱导表达。利用切胶纯化获得OmpK蛋白后,免疫小鼠制备OmpK蛋白多克隆抗体,采用ELISA法检测抗体效价,Western-Blotting法检测抗血清特异性。通过正交试验,获得OmpK菌株的最佳诱导表达条件与培养条件。【结果】PCR扩增获得了长816bp的ompK基因;成功构建了OmpK-pET32a载体,其诱导表达产物分子质量为30ku,与预期结果一致。ELISA法获得OmpK抗血清效价达1∶1 600,Western-Blotting试验证实抗血清具有很好的特异性。OmpK菌株最佳诱导表达条件为:菌液OD600值0.8,IPTG终浓度0.3mmol/L,诱导时间8h,诱导温度32℃;最佳培养条件为:不添加葡萄糖,转速230r/min,装液量50mL。【结论】成功制备了OmpK蛋白多克隆抗体,确定了OmpK蛋白菌株的最佳诱导表达条件与培养条件。     

绵羊肺炎支原体延伸因子EF-P基因的克隆、表达及其重组蛋白免疫原性研究

为筛选绵羊肺炎支原体(MO)免疫相关蛋白,以MO新疆流行株基因组DNA为模板,通过PCR扩增其EF-P基因,测序后对其编码蛋白进行分子特征分析;用生物信息学软件预测其抗原表位集中区编码片段;进一步将该基因片段克隆入pET-32a(+)中,构建原核表达载体pET-32a(+)-EF-P,将pET-32a(+)-EF-P质粒转化至感受态细胞Escherichia coli BL21(DE3)中,IPTG诱导目的蛋白表达后,检测重组蛋白反应原性和免疫原性。SDS-PAGE结果显示,EF-P重组蛋白分子质量为29.5ku;Western blot结果显示,该重组蛋白可被MO阳性血清特异性识别,证实其具有良好的反应原性;小鼠免疫试验结果显示,该重组蛋白可诱导机体产生特异性抗体,采用正向间接血凝方法检测效价可达1∶64,提示其具有较强的免疫原性。     

猪流产嗜性衣原体MOMP基因的克隆及原核表达

【目的】克隆猪流产嗜性衣原体青海株主要外膜蛋白(Major outer membrane protein,MOMP)基因,并进行序列分析及原核表达。【方法】根据GenBank公布的猪流产嗜性衣原体MOMP基因的核苷酸序列,设计并合成4条特异性引物,用套式PCR方法扩增猪流产嗜性衣原体青海株MOMP基因,将其克隆入pMD18-T载体中,进行测序及序列分析。然后将MOMP基因亚克隆入原核表达载体pGEX4T-1中,在大肠杆菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot检测。【结果】扩增到猪流产嗜性衣原体青海株1170bp的MOMP全长基因。序列分析结果表明,该基因与已发表的猪流产嗜性衣原体B11001株和CP/12株核苷酸同源性均为99.7%。SDS-PAGE电泳可检测到分子质量约为66ku的融合蛋白,主要以包涵体形式存在。Western-blot分析表明,重组蛋白可被猪流产嗜性衣原体抗体识别。【结论】成功克隆了猪流产嗜性衣原体青海株MOMP基因,并进行了原核表达,表达的蛋白具有抗原活性。     

伪狂犬病病毒gE基因主要抗原表位区的原核表达及间接ELISA方法的建立

【目的】为了区分伪狂犬病病毒疫苗免疫猪和自然感染猪,建立快速诊断的方法.【方法】利用PCR方法从伪狂犬病病毒中扩增出糖蛋白E(g E)基因的主要抗原表位区,用Bam HⅠ和HindⅢ双酶切后,插入原核表达载体p ET-32a(+)中,构建重组表达质粒p ET-g E184,并转化至大肠埃希菌Escherichia coli BL21(DE3),经IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳和Western-blot检测,用纯化后的g E184蛋白作为包被抗原,建立间接g E184-ELISA检测方法.【结果和结论】用该方法检测290份临床猪血清样本,并与商品化ELISA试剂盒检测结果比较,两者的符合率为93.1%.     

鸡传染性法氏囊病病毒BJ-10株VP2基因的克隆及原核表达

【目的】克隆鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)BJ-10株VP2基因,构建其原核表达载体,并在大肠埃希菌中进行高效表达。【方法】根据IBDVVP2基因序列设计1对特异性引物,应用RT-PCR技术克隆IBDV BJ-10株VP2基因;将目的基因插入pMD18-T连接载体,筛选出阳性重组质粒;将该质粒克隆至原核表达载体pET-32α中,转化入JM109,经IPTG诱导表达,对产物进行SDS-PAGE电泳分析,确定IPTG的最佳诱导表达时间和浓度。【结果】克隆到了全长1 356bp的IBDV BJ-10株VP2基因;PCR、酶切鉴定分析表明,成功构建了重组质粒pET-32α-VP2;SDS-PAGE电泳分析表明,在宿主菌JM109中成功表达了约为60ku的VP2蛋白;IPTG诱导表达时间以4.5h为宜,诱导最佳浓度为0.8mmol/L。【结论】成功克隆了IBDV BJ-10株VP2基因,并在大肠埃希菌中表达了VP2蛋白。     

五谷虫蛋白粗提液对牛源致病性Escherichia coli O_1和E.coli O_(78)体外抑菌作用

为研究五谷虫蛋白粗提液对Escherichia coli O_1和E.coli O_(78)的体外抑菌作用,采用试剂盒测定五谷虫粗提液蛋白含量;牛津杯法测定蛋白粗提液对牛源病源性E.coli O_1和E.coli O_(78)的抑菌圈直径;通过二倍稀释法测定蛋白粗提液对2种细菌的最低抑菌浓度(MIC);平板法测定最低杀菌浓度(MBC);酶标比浊法测定粗提液对2种细菌的24h生长曲线、细胞膜通透性以及碱性磷酸酶(AKP)的含量。研究表明:1)五谷虫蛋白粗提液蛋白质量浓度为0.680mg/mL;粗提液对E.coli O_1和E.coli O_(78)的抑菌圈直径分别为(25.09±0.62)和(20.96±0.48)mm,MIC分别为15.625和31.250mg/mL,MBC为62.5和125mg/mL,传统中药水煎剂和提取缓冲液没有体外抑菌效果。2)粗提液能影响E.coli O_1和E.coli O_(78)的生长曲线,增加细菌细胞膜和细胞壁通透性。由此可见,蛋白粗提液对E.coli O_1和E.coli O_(78)均有体外抑菌效果,且对E.coli O_1的体外抑菌效果优于E.coli O_(78)。     

pagP基因缺失对禽致病性大肠埃希菌外膜特性的影响

【目的】研究pagP基因缺失对禽致病性大肠埃希菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)外膜特性的影响。【方法】采用最低抑菌浓度(MIC)试验探索pagP基因缺失对菌株生物被膜通透性的影响;通过菌体自聚合试验、外膜疏水性试验以及生物被膜形成条件,分析pagP基因缺失对生物被膜形成能力的影响,并在扫描电镜下观察细菌生物被膜形态。【结果】pagP基因缺失后,菌株MIC降低,菌株的外膜通透性增强且菌体自聚合能力显著增强(P0.01),其中红霉素和氨苄西林的MIC分别为7和20μg/mL,菌株自聚合能力为87.89%;pagP基因缺失对菌株外膜疏水性无显著影响,疏水性仅为5.337%;随着细菌在LB培养基中静置培养时间的延长,生物被膜形成量增多;pagP基因缺失株的生物被膜形成能力高于野生株。【结论】pagP基因缺失可使APEC外膜特性发生改变,生物被膜形成能力增强。     

沙门菌、巴氏杆菌和大肠埃希菌多重PCR检测方法的建立

旨在建立一种可以应用于临床样本同时检测沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌感染的多重PCR方法。根据NCBI上已收录的沙门菌hut基因、多杀性巴氏杆菌 kmt1基因和大肠埃希菌23SrRNA基因的全基因序列,设计并合成3对特异性引物,通过优化多重PCR反应条件,建立能够同时检测3种细菌混合感染的多重PCR诊断方法。特异性分析表明,应用该方法可以从沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌以及3种细菌的混合物中扩增出3条大小分别为286 bp、457 bp和652 bp的特异性条带,其他对照组检测结果均为阴性;敏感性分析表明,该方法对沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌的最低检出量分别为1.77×10　、1.99×10　、2.01×10　 CFU/mL;人工模拟感染样本检测表明,该方法能从混合感染的病料中检测出3种病原菌。可见：所建立的多重PCR方法具有特异性强,敏感度高,稳定性好的特点,可以有效检测沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌的混合感染。