牦牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因的克隆及序列分析

为了解牦牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因的特点,根据GenBank已公布的牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因序列设计4对引物,每个基因分两段扩增,测序并拼接,首次克隆牦牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因。序列分析表明,扩增到的牦牛应激型 HSPA1A基因全长2 134 bp,开放阅读框全长1 926 bp,编码641个氨基酸,分子质量为70.26 ku; HSPA2基因全长1 911 bp,开放阅读框全长1 911 bp,编码636个氨基酸,分子质量为69.85 ku。将 HSPA1A和 HSPA2基因开放阅读框编码的氨基酸序列进行ScanProsite分析,均得到3个HSP70蛋白家族标记。核苷酸序列同源性分析表明, HSPA1A和 HSPA2基因具有较高的保守性,牦牛与牛的 HSPA1A和 HSPA2基因核苷酸序列同源性最高,分别为99.8%和99.1%。遗传进化关系分析表明,牦牛与牛的应激型 HSPA1A和 HSPA2基因亲缘关系最近。     

红麻线粒体基因NAD3和COB的RNA编辑与表达分析

以红麻细胞质线粒体近等基因系UG93A(不育系)、UG93B(保持系)及UG93A×福红992(恢复系)的F1代为材料,研究花药线粒体基因NAD3和COB的转录与表达。结果发现,在3种供试材料中,基因NAD3的CDS区在DNA水平和RNA编辑水平上均无差异;不育系与保持系的COB基因DNA编码序列无差异,但在RNA水平上发生了编辑,8个位点的编辑均发生于密码子的第一或第二位碱基,且导致氨基酸种类变化,主要为亲水性氨基酸转变为疏水性氨基酸;COB基因在UG93A中的RNA编辑频率低于UG93B;NAD3和COB基因在3种材料中的转录本大小基本相同,但在表达水平上表现为不育系显著低于保持系和F1代。由此推测NAD3和COB基因在红麻花药发育过程中有着重要的作用。     

扩展莫尼茨绦虫不同体节CREB和PICK基因mRNA转录水平研究

为研究CREB和PICK在扩展莫尼茨绦虫不同体节的mRNA转录水平, 以beta Tubulin基因作为内参基因,采用SYBR Green real time RT PCR方法检测该基因在扩展莫尼茨绦虫4个不同发育阶段即头节、幼节、成节、孕节中的表达差异。标准曲线分析显示,CREB、PICK基因和beta Tubulin基因标准质粒实时定量扩增Ct值与标准质粒的质量浓度均呈良好的线性关系,相关系数均大于 0.99;熔解曲线分析表明,产物为特异的单峰,具有较高的特异性。同时结果还显示,CREB以及PICK基因在虫体各发育阶段中的表达丰度存在差异。CREB基因在扩展莫尼茨绦虫头颈节、幼节、成节和孕节的表达水平依次呈上升趋势,而PICK基因在扩展莫尼茨绦虫成节以及孕节的表达水平较高。     

结球甘蓝类钙调蛋白基因 CML48和 CML50在不同胁迫下的表达分析

为探究结球甘蓝类钙调蛋白（CMLs）响应不同胁迫时的功能,丰富CMLs参与钙信号网络调控,为CMLs参与植物逆境途径及其功能的研究提供依据。以结球甘蓝ZG为材料,克隆得到 CML48和 CML50基因,序列分析表明 CML48开放阅读框（ORF）为672 bp,含4个内含子,编码223 aa,分子量为25.28 ku; CML50开放阅读框ORF为1 095 bp,编码364 aa,分子量为38.06 ku,含3个内含子;均为亲水蛋白,均含有2个EF-hand结构域;系统发育树表明 CML48和 CML50均与甘蓝处于同一进化枝,与白菜、油菜的亲缘关系最近。qPCR表明 CML48和 CML50在干旱(PEG6000)、盐胁迫(NaCl)、低温(4 ℃)、高温(37 ℃)、H₂O₂、脱落酸（ABA）、水杨酸（SA）和茉莉酸甲酯（MeJA）等不同胁迫处理下,在叶和根中的表达均有上调,且 CML50的表达量均显著高于 CML48, CML48在茎尖中高度响应高温胁迫,而在根中不响应高温和H₂O₂胁迫。初步说明 CML48和 CML50在根和叶中均可响应上述8种非生物胁迫。     

黄体期和卵泡期小尾寒羊KiSS-1与RFRP-3组织表达研究

为分析KiSS-1和RFRP-3基因在小尾寒羊不同繁殖时期(黄体期和卵泡期)下丘脑、垂体、性腺轴各组织中的表达差异,阐明这2个基因在绵羊发情转换中的表达模式,以常年发情的小尾寒羊为研究对象,采用实时荧光定量PCR技术,对比分析了KiSS-1和RFRP-3基因在黄体期和卵泡期的小尾寒羊下丘脑—垂体—性腺轴各组织中的表达差异。结果表明:1)KiSS-1和RFRP-3基因在下丘脑、垂体、卵巢等10种组织中均有表达;2)黄体期和卵泡期下丘脑中KiSS-1基因表达量均显著高于其他组织(P0.05),卵泡期下丘脑和松果体中KiSS-1基因表达量均显著高于黄体期(P0.05);3)黄体期和卵泡期下丘脑和卵巢中RFRP-3基因的表达量均显著高于其他组织(P0.05),且卵巢中RFRP-3基因在黄体期的表达量显著高于卵泡期(P0.05)。综上,研究发现KiSS-1和RFRP-3基因在绵羊发情调控中均发挥重要作用,KiSS-1促进发情而RFRP-3抑制发情。     

MsRCI2A/B/C基因超量表达对紫花苜蓿耐旱性的影响

【目的】分析紫花苜蓿MsRCI2A、MsRCI2B、MsRCI2C的表达差异并研究其抗旱功能,为苜蓿抗旱机制解析及分子育种奠定基础。【方法】采用qPCR的方法,分析紫花苜蓿MsRCI2A、MsRCI2B、MsRCI2C基因在20% PEG6000溶液模拟干旱条件下表达的差异,采用农杆菌介导法获得MsRCI2A、MsRCI2B和MsRCI2C基因超量表达的转基因苜蓿A12、A22、B13、B19、C2和C10,观察正常生长条件（干旱胁迫0 d）下和20% PEG6000干旱胁迫6,12 d的野生型株系WT（对照）及超量表达的转基因紫花苜蓿的表型,测定超表达苜蓿和WT的叶绿素含量、相对电导率、丙二醛（MDA）含量、抗氧化酶（超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT））活性及渗透调节系统（可溶性糖和脯氨酸含量）在干旱胁迫条件下的变化。【结果】在20%PEG6000模拟干旱条件下,MsRCI2A/B/C基因在紫花苜蓿叶和根中表达变化趋势相反,但3个基因在同一组织中的表达趋势相似。紫花苜蓿叶片中的MsRCI2A/B/C基因在干旱胁迫处理后均明显上调,其中MsRCI2A/C基因在干旱胁迫处理2 h时即极显著上升（P<0.01）,而MsRCI2B的表达相对缓慢,在处理8 h时极显著上升（MsRCI2A/B/C<0.01）。在根中,MsRCI2A/B/C基因在干旱胁迫处理2 h时相对表达量极显著下降（P<0.01）。在正常生长条件（干旱胁迫0 d）下,6个转基因苜蓿叶绿素含量、相对电导率和MDA含量、可溶性糖含量和脯氨酸含量与野生型苜蓿（WT）相比无明显差异,但转基因苜蓿SOD、POD、CAT活性明显高于WT（P<0.05）,其中转MsRCI2B/C基因苜蓿叶片中的SOD活性及叶和根中POD活性是WT的1.97~2.27倍。转基因株系A12、A22、B13、B19、C2和C10与野生型苜蓿(WT)同时进行20%PEG6000模拟干旱胁迫处理12 d后,各转基因株系的叶绿素含量极显著高于WT (P<0.01),为WT的3.00~3.46倍,而相对电导率和丙二醛含量则极显著下降了73%和55%。转基因苜蓿叶和根中的可溶性糖和脯氨酸含量及SOD、POD和CAT活性均显著升高（P<0.05）,其中MsRCI2A/C转基因苜蓿叶和根中的CAT活性是WT的2~3倍,MsRCI2B/C转基因苜蓿叶和根中的脯氨酸含量是WT的3倍。【结论】MsRCI2A、MsRCI2B和MsRCI2C的过表达可以增强苜蓿的耐旱性。     

长白和蓝塘猪印记基因 IGF2 和 H19 的时空表达研究

运用实时荧光定量PCR技术,检测 IGF2和H19 印记基因在长白猪和蓝塘猪中的表达水平.测定了1日龄和180日龄2个阶段的基因在各组织中的转录表达水平,按照生长性状分组,对组间的表达差异进行了比较分析.分析不同日龄长白、蓝塘猪各组织中 IGF2、H19 的表达量.结果显示,仔猪初生体质量大的组肝脏组织中 IGF2 基因表达水平显著高于初生体质量轻的组;180日龄猪皮脂厚的组脂肪组织的 IGF2 基因表达量高于皮脂薄的组;1日龄仔猪肝脏、肌肉和胃组织中 IGF2 表达量高于其他测定组织和180日龄的各组织;180日龄蓝塘猪肾脏组织中的 H19 表达量显著升高.     

转cry1Ab和epsps基因玉米C0030.3.5对土壤古菌丰度和多样性的影响

为探讨转基因玉米的生态安全问题,2015年分别于玉米拔节期、抽雄期、乳熟期和完熟期采集土壤样品,并采用荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,q PCR)和末端限制性片段长度多态性分析(Terminal restriction fragment length polymorphism,TRFLP)技术,研究了转cry1Ab和epsps基因玉米C0030.3.5种植对土壤古菌丰度和多样性的影响。结果表明:转cry1Ab和epsps基因玉米C0030.3.5(TM)和受体玉米DBN318(PM)的根际土和非根际土古菌数量为1.41×10~9~4.04×10~9copies·g~(-1)土,随生长时期的推进均呈现先升高后降低的变化趋势,同一生长时期和土壤样品采集区域,2种玉米古菌16S rRNA基因丰度间无显著差异。T-RFLP分析共获得15种不同长度的T-RFs,其中89 bp和184 bp片段为优势种群,同一生长时期和土壤样品采集区域每种优势种群在TM和PM间均无显著差异。土壤古菌Shannon指数除PM非根际土呈现先降低后升高的变化趋势外,其他均表现为先降低后升高再降低;TM和PM根际土古菌Evenness指数的变化趋势均为先降低后升高,而非根际土古菌Evenness指数表现为先降低后升高再降低。同一生长时期和土壤样品采集区域TM和PM的Shannon指数间及Evenness指数间差异均不显著。冗余分析(Redundancy analysis,RDA)显示土壤总氮和硝态氮含量对古菌群落结构有显著影响。主成分分析(Principal component analysis,PCA)表明,TM和PM土壤古菌群落在根际土和非根际土中均未发生明显分离,说明TM和PM土壤古菌群落组成无显著差异。上述结果表明:转cry1Ab和epsps基因玉米C0030.3.5土壤古菌丰度和群落结构组成与受体玉米DBN318无显著差异,古菌丰度和多样性主要受生长时期的影响,受土壤样品采集区域的影响不显著,土壤总氮和硝态氮是调控土壤古菌群落变化的关键因子。     

chi-miR-4110对奶山羊 Smad2基因的靶向调控作用

为揭示chi-miR-4110对奶山羊繁殖机能的调控作用,在前期构建的多羔(1胎3~5羔)和单羔(1胎1羔)关中奶山羊发情期卵巢差异表达miRNA文库的基础上,利用生物信息学、qRT-PCR和Western blot等技术验证chi-miR-4110的靶基因及其对靶基因的调控作用。荧光素酶检测结果表明,chi-miR-4110通过与Smad2基因的3′UTR相互作用导致荧光素酶活性降低,初步鉴定Smad2为chi-miR-4110的靶基因。将chimiR-4110mimics和阴性对照分别转染到奶山羊卵巢颗粒细胞中,qRT-PCR和Western blotting结果表明,在奶山羊卵巢颗粒细胞中,过表达chi-miR-4110使Smad2 mRNA以及Smad2蛋白的表达量均显著降低,表明chi-miR-4110在转录后水平对Smad2起负调控作用。表明Smad2是chi-miR-4110的靶基因,在奶山羊卵巢颗粒细胞中,chi-miR-4110靶向调控Smad2的表达。     

甜樱桃(Prunus avium L.)LEAFY基因的克隆及表达模式分析

为探索LEAFY基因在甜樱桃花芽分化过程中的表达及作用,以甜樱桃(Prunus avium)‘红蜜'(Hongmi)为试材,利用同源克隆和RACE方法克隆甜樱桃中LEAFY同源基因cDNA全序列,对其序列进行分析,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对该基因在花芽分化过程中的表达量进行鉴定。结果显示:在甜樱桃中具有3中不同长度类型,分别为1 532、1 498和1 410bp,主要由3′UTR区长度不同所导致,开放阅读框长1 233bp,编码410个氨基酸,推测蛋白分子量约为45.6ku,等电点约为6.88。结构预测NCBI序列比对发现其氨基酸序列与其他植物中同源基因相似性均在70%以上,故命名为PaLEAFY。qRT-PCR分析发现,在果实成熟至成熟后33d,PaLEAFY在花芽中的表达量由高变低,果实成熟后45d,PaLEAFY表达量开始急剧升高并维持至69d,69d之后表达量再次升高,并于果实成熟后99d达到最高。此外,PaLEAFY在甜樱桃花的柱头中的表达量最高,其次是花瓣、雄蕊和花萼,在甜樱桃的茎和叶中的表达量非常低。说明PaLEAFY参与甜樱桃花芽分化及花发育过程。     

pH对产叶酸植物乳杆菌叶酸产量及相关基因表达的影响

叶酸是细胞代谢的重要中间体,人类由于缺乏叶酸生物合成途径中的关键酶,需要从膳食中摄取叶酸。由于谷氨酸尾数目的差别,生物合成的叶酸更容易被人体利用。一些植物乳杆菌菌株可以合成叶酸,但培养条件对叶酸合成有较大影响。选择一株高产叶酸的植物乳杆菌4_3菌株,探讨了在同一培养基中,不调节pH和使pH稳定在6.0对其生长状况和叶酸合成的影响。比起不调节pH,维持pH 6.0可以长期保持较高的活细胞密度。实时荧光定量PCR的结果显示,在pH 6.0的培养基中,叶酸合成相关基因表达量均要高于不调节pH的培养基。     

原花青素对铁负荷大鼠肝脏功能及TfR2、hepcidin基因表达的影响

为探讨原花青素对铁负荷致大鼠肝损伤的影响,通过监测肝功能、病理切片及转铁蛋白受体-2(TfR2)、铁调素(hepcidin)基因表达,将40只SD大鼠随机分为对照组、原花青素组、铁负荷组和试验组(铁负荷+原花青素)。ICP法辅以肝脏普鲁士蓝染色判别铁负荷大鼠模型是否建立成功;相关试剂盒检测谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的活性;HE染色观察肝组织形态学变化;Real-Time PCR检测肝组织中TfR2、hepcidin基因表达的变化。与对照组相比,铁负荷组Fe及ALT、AST水平显著升高(P0.05),肝组织结构严重紊乱,hepcidin基因的表达量显著下降(P0.05),TfR2基因的表达无明显差异;原花青素组Fe显著降低(P0.05),ALT、AST水平无显著性变化,肝组织结构正常,TfR2与hepcidin基因的表达量显著下降(P0.05)。与铁负荷组相比,试验组ALT、AST水平显著降低(P0.05),肝组织紊乱程度减轻,Fe含量、TfR2及hepcidin基因的表达量均略降低,但差异无统计学意义。原花青素可以抑制铁的摄入量;在机体铁过载状态下,原花青素抑制铁吸收的能力可以在一定程度上改善肝功能。     

安格斯牛UCP2和UCP3基因组织表达规律研究

为了研究UCP2基因和UCP3基因在安格斯牛不同组织中的表达规律,运用实时荧光定量PCR技术检测UCP2和UCP3基因在安格斯牛心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、背最长肌和皮下脂9种组织中的相对表达情况.结果 表明:UCP2和UCP3在所检测的组织中均有表达,且UCP2在肺脏中的相对表达量最高,极显著高于其他组织(P＜0.01),其次为脾脏和肾脏,其表达量极显著高于除肺脏外的其他组织(P＜0.01),其余组织的表达量虽有差异,差异不显著(P＞0.05);UCP3基因在皮下脂中的表达量极显著高于其他各组织(P＜0.01),其次为肾脏和肺脏,背最长肌的相对表达量极显著高于大肠、小肠、心脏、肝脏和脾脏组织(P＜0.01),其余各组织的相对表达量较低.通过对UCP2和㈣基因在安格斯牛不同组织中的表达情况进行分析,揭示这两个基因在安格斯牛不同组织中的表达差异,为进一步拓展UCP2和UCP3基因在不同组织中的功能研究提供理论支持,在某种程度上为安格斯牛的育种提供一些基础资料.     

日本白鲫BMP15和GDF9基因片段的克隆及组织表达分析

根据斑马鱼GDF9、BMP15基因的保守序列设计引物,采用RT PCR方法扩增获得日本白鲫GDF9、BMP15基因片段。日本白鲫GDF9基因片段长778 bp,编码145个氨基酸;BMP15基因片段长811 bp,编码270个氨基酸。氨基酸序列分析表明日本白鲫GDF9与斑马鱼的同源性最高,为78%,与其他物种的同源性在58%~78%之间;日本白鲫BMP15与斑马鱼同源性最高,为80%,与其他物种的同源性在30%~80%之间。系统进化树分析显示,鱼类的GDF9基因独立聚成一支,其中日本白鲫的GDF9基因与斑马鱼的GDF9基因聚成一支;鱼类的BMP15基因独立聚成一支,其中日本白鲫的BMP15基因与斑马鱼的BMP15基因聚成一支。半定量PCR结果显示,BMP15 mRNA在脾脏、肝脏、鳃、脑、心脏、肌肉、肾脏、卵巢中均有表达,其中卵巢中表达量最高;GDF9 mRNA在肝脏、脑、心脏、肌肉、卵巢中均有表达,而在脾脏、鳃、肾脏中表达量极低或不表达,在卵巢中表达量最高,为进一步研究日本白鲫GDF9与BMP15基因的结构与功能奠定了基础。     

克氏原螯虾泛素结合酶E2基因的克隆及其在卵巢中的表达分析

利用RACE技术获得了UB-E2基因c DNA全长,通过RT-PCR技术研究UB-E2基因在不同组织、发育时期的表达量和17α-羟孕酮激素刺激后UB-E2表达量及性腺发育情况。结果表明:该基因序列全长3 943bp,开放阅读框675 bp,编码224个氨基酸,相对分子量23. 93 ku,等电点8. 61,82～219位氨基酸序列为泛素结合酶家族特有的结构域。氨基酸序列比对发现,克氏原螯虾UB-E2基因与节肢动物UB-E2基因有较高的同源性;系统进化分析表明,UB-E2基因与凡纳滨对虾和斑节对虾聚为一支。荧光定量结果显示,UB-E2基因在克氏原螯虾卵巢组织中的表达量显著高于其他组织(P 0. 05);在卵巢发育初期表达量最低,随后逐渐升高,到产卵后期开始下降; 17α-羟孕酮刺激结果显示,试验组卵巢发育速度明显加快,同时UB-E2基因的表达量也显著上升,卵巢发育速度和UB-E2基因表现为受17α-羟孕酮刺激响应一致。推测UB-E2基因在克氏原螯虾的卵巢发育和配子发生中起着重要的作用,本研究为克氏原螯虾性腺发育分子调控机制提供一定的理论依据。     

青海湖裸鲤TNNI1和TNNI2基因克隆及其响应盐碱胁迫的表达研究

【目的】克隆青海湖裸鲤慢收缩骨骼肌型肌钙蛋白I基因(TNNI1)和快收缩骨骼肌型肌钙蛋白I基因(TNNI2),分析其在不同组织及盐碱胁迫环境下皮肤和腹侧肌肉组织中的表达水平,为揭示青海湖裸鲤生长缓慢及恢复青海湖裸鲤鱼类资源提供基础数据。【方法】以青藏高原特有鱼类青海湖裸鲤为研究材料,利用RACE技术克隆TNNI1和TNNI2基因全长cDNA序列,进行氨基酸序列同源性比对;利用实时荧光定量PCR法检测2个基因在青海湖裸鲤鳃、眼、脑、脾脏、肝脏、肠、肾、心、皮肤、腹侧肌肉组织的表达情况,以及盐碱胁迫下腹侧肌肉和皮肤组织中的表达规律。【结果】青海湖裸鲤TNNI1 cDNA序列全长为1 211 bp,其中开放阅读框540 bp,共编码179个氨基酸;TNNI2 cDNA序列全长为737 bp,其中开放阅读框531 bp,共编码176个氨基酸。序列同源性分析发现,青海湖裸鲤TNNI1氨基酸序列与安水金线鲃的同源性高达92.13%,TNNI2氨基酸序列与鲤鱼的同源性最高为92.61%。系统发育树结果显示,从TNNI1氨基酸序列来看,青海湖裸鲤与金线鲃属鱼类、鲫鱼、鲤鱼的亲缘关系较近;从TNNI2氨基酸序列来看,青海湖裸鲤与鲤鱼的亲缘关系最近,其次是鲫鱼和金线鲃属鱼类。TNNI1和TNNI2基因在青海湖裸鲤不同组织中均有表达,且在腹侧肌肉中相对表达量最高。盐碱胁迫条件下,TNNI1和TNNI2基因在肌肉组织中的相对表达量均显著下调;在皮肤组织中TNNI1的相对表达量极显著下调（P＜0.01）,而TNNI2极显著上调（P＜0.01）。【结论】成功克隆了青海湖裸鲤TNNI1、TNNI2基因全长;TNNI1、TNNI2基因在腹侧肌肉组织中高表达,表明其与肌肉组织发育密切相关;盐碱胁迫条件下TNNI1、TNNI2基因在腹侧肌肉组织中的表达均显著下调,提示2个基因表达量降低可能是青海湖裸鲤生长缓慢的重要因素。     

墨兰FT同源基因的时空表达及功能分析

FLOWERING LOCUS T(FT)基因是植物开花调控途径的整合基因,整合来自光周期途径、春化途径和自主途径等不同花发育途径的信号,在植物花发育中发挥着重要作用。从墨兰品种‘企剑黑墨’中克隆了新的FT同源基因,并对其各组织部位的表达特性和生物学功能进行了分析。结果表明,墨兰FT基因c DNA全长序列为618bp,其中开放阅读框为531 bp,编码176个氨基酸。其氨基酸序列与拟南芥、水稻中FT基因的氨基酸序列有较高的同源性。墨兰FT同源基因在‘企剑黑墨’各器官中均有表达,营养生长期FT基因在腋芽中的表达量最高,生殖生长期FT基因在腋芽,花梗,花蕾等器官中的表达量较高,在根和叶中的表达量最低。在拟南芥中超表达墨兰FT同源基因,能显著促进拟南芥开花。     

大鳞副泥鳅GPR30基因的克隆及EE2暴露对其表达的影响

【目的】克隆大鳞副泥鳅(Paramisgurnus dabryanus)G蛋白偶联受体30(G protein-coupled receptor30)基因GPR30,研究其在成鱼各组织中的表达状况;用EE2(17α-ethynylestradiol)处理大鳞副泥鳅雌性幼鱼后,检测GPR30、ERαmRNA在幼鱼肝脏和卵巢中的表达状况,探究EE2对雌激素膜受体GPR30和经典雌激素核受体ERα基因表达的影响,推测GPR30可能存在的生理功能。【方法】采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和快速扩增cDNA末端(RACE)技术,克隆大鳞副泥鳅GPR30,对其核苷酸序列及所编码的氨基酸序列信息和进化关系进行分析;采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)方法,研究GPR30mRNA在大鳞副泥鳅成鱼性腺、肠道、肌肉、肾脏、脑、肝脏、鳃、眼睛等组织中的表达状况,以及经不同质量浓度(1,5,25ng/L)EE2处理后雌性幼鱼肝脏和卵巢中GPR30和ERαmRNA的表达。【结果】克隆获得了GPR30,该基因全长2 152bp,阅读框全长1 062bp,编码353个氨基酸,该基因氨基酸序列与斑马鱼的GPR30氨基酸序列相似性最高,达92.9%。GPR30氨基酸序列的比对结果显示,大鳞副泥鳅与其他脊椎动物的GPR30结构域一致。荧光定量PCR分析表明,GPR30在大鳞副泥鳅成鱼卵巢中表达最高,在雄鱼肠道中表达最低,且GPR30mRNA在雌雄大鳞副泥鳅的性腺中差异性表达,在卵巢中的表达量较精巢中高702倍。EE2暴露试验显示,在5ng/L EE2处理组的卵巢及1和5ng/L EE2处理组的肝脏中,GPR30有略微增长;随着EE2质量浓度的增高,ERαmRNA在肝脏中的相对表达水平较对照组显著增长。【结论】成功克隆了大鳞副泥鳅GPR30,其与哺乳动物的GPR30有相似的结构和功能,可能与雌激素效应存在密切关系。在基因转录水平上,GPR30与ERα可能不存在直接的显著相关关系。     

金鱼Tgf2转座酶的原核表达及其DNA结合活性

金鱼Tgf2转座子基因属于Hobo/Activator/Tam3（hAT）超家族,其编码的活性转座酶能在多种鱼类转座中介导基因插入及诱变,因此在鱼类重要性状主控基因的筛选、功能解释及育种等方面具有重要的应用前景。鉴于Tgf2转座酶基因（JN886591）存在众多稀有密码子,本研究依据大肠杆菌对密码子的偏好性,对金鱼Tgf2转座酶基因进行密码子优化,所得Tgf2转座酶基因连接原核表达载体pET-28a（+）,将重组载体转化到大肠杆菌BL21（DE3）细胞。该大肠杆菌细胞在培养温度37℃、OD₆₀₀≈0.5时用IPTG诱导获得高效表达,即菌体中含有8.8%的重组蛋白,上清液中含有4.0%重组蛋白。采用亲和层析纯化从菌体上清液中分离得到分子量约70 ku的可溶性重组蛋白,经MALDI-（TOF）/TOF串联质谱鉴定其为重组Tgf2转座酶。进而采用分子排阻色谱法研究转座酶的DNA结合活性,结果表明：所得重组Tgf2转座酶能识别并结合含Tgf2转座子特异性亚末端重复序列的DNA探针,即启动转座。采用原核表达体系高效获得重组Tgf2转座酶,为其作为工具酶应用于鱼类生物学研究奠定必要的基础。     

胡杨PeXTH基因的克隆及其转基因烟草的抗镉性分析

【目的】克隆胡杨木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因PeXTH,并研究该基因和植物抗Cd2+性之间的关系。【方法】利用RT-PCR方法从胡杨中克隆一个木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因PeXTH,将该基因的全长cDNA克隆到植物表达载体pGreen0029上,然后通过农杆菌介导法,将重组表达载体转入烟草,并对转基因烟草的抗Cd2+能力进行初步分析。【结果】PeXTH基因的开放阅读框(ORF)长867bp,含ATG起始密码子和TAG终止密码子,编码由288个氨基酸组成的蛋白;多重氨基酸序列比对结果显示,PeXTH蛋白含有木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶(XTHs)的保守催化活性域DEIDFEFLG和N-糖基化位点NLSG;Real-Time PCR检测结果表明,PeXTH基因已经成功在2个转基因株系(L6和L14)中过表达;Cd2+胁迫后,转基因烟草根组织中积累的Cd2+含量显著高于野生型,而叶组织中积累的Cd2+含量明显低于野生型;Cd2+胁迫下,转基因烟草叶片的相对电导率显著低于野生型,但抗氧化酶活性、营养元素含量、叶片净光合速率和蒸腾速率等生理指标都要明显高于野生型。【结论】PeXTH基因的过表达提高了烟草对Cd2+的抗性,为进一步深入研究PeXTH基因在植物抗Cd2+机制中的作用奠定了良好基础。