用固定细胞阻断酶联免疫吸附试验鉴别诊断猪传染性胃肠炎病毒和…

用固定细胞阻断酶联免疫吸附试验对来自丹麦猪的１８０份血清进行了猪传染性胃肠炎病毒和猪呼吸道冠状病毒感染的鉴别诊断，共检出了ＰＲＣＶ抗体阳性血清１０７份，ＴＧＥＶ抗体阳性血清０份。同时也检测了一些来自国内不同ＴＧＥＶ感染类型的猪场血清。     

RT-PCR检测和区分猪传染性胃肠炎病毒和猪呼吸道冠状病毒的研究

根据猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪呼吸道冠状病毒（PRCV）的基因组核苷酸序列，在S基因（纤突蛋白基因）5′端保守区设计了一对引物P3／P4，该对引物在TGEV扩增跨幅约为2.4kb；而PRCV由于在此区域存在一约0.6kb碱基缺失，扩增跨幅约为1.8kb。用引物P3／P4对TGEV Miller株、Purdue株和PRCV AR310株分别进行RT－PCR，根据RT－PCR扩增片段大小可以直接区分TGEV和PRCV。用引物P3／P4与引物P1／P2作Nested-PCR,提高了该RT－PCR的特异性和敏感性，建立的RT－PCR可为临床上诊断TGEV及调查我国是否存在PRCV感染提供可靠的鉴别手段。     

猪流行性腹泻传染性胃肠炎和轮状病毒RT-PCR鉴别诊断技术研究

分别设计了三对引物对猪流行性腹泻病毒（PEDV），猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪轮状病毒（RV）的RNA进行RT-PCR，结果其扩增产物的目的条带分别为：199bp、886bp、342bp，证明对引起猪病毒性腹泻的最主要的三种病毒用RT-PCR方法，可在3小时内作出快速鉴别诊断。病毒间无交叉反应。     

猪传染性胃肠炎病毒间接ELISA检测方法的建立

猪传染性胃肠炎（TGE）是由冠状病毒科、冠状病毒属的TGEV引起猪的一种以呕吐、严重水样腹泻和脱水为特征的急性、高度接触性传染病。TGE常与其他腹泻性疾病发生混合感染,并且在临床不易与其他腹泻病相区别。因此,对TGE进行准确的诊断与鉴别诊断对防制该病具有重要意义。EUSA检测方法具有敏感性高、特异性强、操作简便和样本检测量大等特点,可广泛用于病原和血清抗体检测。     

斑点酶联免疫吸附试验诊断猪囊虫病的研究

通过Sephadex G-200层析提纯猪囊虫的囊液抗原和匀浆抗原,并以此抗原建立Dot-ELISA法来诊断猪囊虫病。该法在接到病料后1.5h内准确报告结果,结果判定不但简易直观,而且还可以作为技术资料长期保存。本法以硝酸纤维素膜作为载体,抗原用量、其他器材和试剂用量都大为减少,因而降低了检测成本。与四种寄生虫病(旋毛虫、弓形虫、细颈囊尾蚴、猪蛔虫)阳性血清不发生交叉反应。对按“四部”规程肉检确认为猪囊虫阴性血清42份,阳性血清17份,经 Dot-ELISA 法检测,其阴性符合率为95.24%,阳性符合率为100%,经三次重复,重复率为100%。对西宁市肉联厂的536份商品猪血清进行检测,其猪囊虫病阳性检出率为4.29%。试验结果证明,该法符合“简便、快速、敏感、准确、经济”的原则,尤其易于在基层推广应用。     

猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体的制备与鉴定

以纯化的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)作为抗原免疫BALB/c小鼠,经3次免疫后,通过聚乙二醇方法进行融合,利用有限稀释法在HAT培养基上筛选杂交瘤细胞,共获得12株既能稳定生长并可以分泌特异性抗TGEV的单克隆抗体的杂交瘤细胞系,分别命名为8D2、4H4、5D6、7H10、4C3、9G1、3A2、8G1、5G6、2D7、4D6、6B10。间接ELISA、Western blot、间接免疫荧光结果表明,获得的12株单抗能特异性识别TGEV,通过间接ELISA做病原检测,显示12株单抗与猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪轮状病毒(PrV)不发生交叉反应。经抗体亚类鉴定,该12株单克隆抗体均为IgG2b。12株抗TGEV的单抗制备成功,为猪传染性胃肠炎病原特性研究和病原快速检测提供了物质基础。     

利用重组抗原建立间接酶联免疫吸附试验检测猪传染性胃肠炎血清抗体

随着分子生物学的发展 ,重组抗原用于疾病的血清学诊断的报道越来越多 [3 ] 。周仲芳等报道了采用杆状病毒表达系统生产的TGE病毒纤突蛋白 ( S)建立了一种竞争ELISA检测猪 TGE血清抗体 ,获得了较为理想的特异性和准确性。本文报道了采用同样的重组抗原建立了一种间接 ELISA用于TGE血清抗体的检测 ,同时由于在结果判定中采用终点滴度技术 ( End- titer) ,使得检测结果的判定更直观和迅速。1　材料与方法1.1　 EL ISA操作方法　本研究中的抗原制备和包被方法见周仲芳等 ( 1997)的报道。ELISA板经抗原包被后可立即使用 ,也可保存…     

Prokaryotic Expression and Development of an Indirect ELISA Detection Method of Porcine Transmissible Gastroenteritis Virus N Protein

In the study,the recombinant expression plasmid pET28a-TGEV-N was constructed,and expression and purification of the TGEV N protein was completed.Through SDS-PAGE and Western blotting analysis,the N protein could be identified by transmissible gastroenteritis virus (TGEV) positive serum.Using the TGEV N protein as diagnosis antigen,we established an indirect ELISA method for detecting TGEV serum antibodies.The coefficients of variation of intro-batch and inter-batch duplicability test were less than 5%.The specificity was 100%,and the rate of false positive and the false negative rate were 0 and 5%,respectively.No cross reactions with seven porcine diseases positive serum were detected.Using this method,the clinical serum samples were detected.The results showed 100% coincidence rate compared with neutralization test.The method could detect TGEV antibody quickly and effectively,and had good repeatability and specificity,which laid the foundation for the development of standardized diagnostic kits.     

猪传染性胃肠炎病毒N蛋白原核表达和间接ELISA检测方法的建立

试验构建了pET28a-TGEV-N重组表达质粒,完成TGEV N蛋白的表达和纯化,通过SDS-PAGE和Western blotting分析,表明表达产物N蛋白可被猪TGEV阳性血清识别。用TGEV N蛋白作为诊断抗原,建立了检测TGEV血清抗体的间接ELISA检测方法,该方法批内、批间重复试验变异系数均小于5%;检测血清的特异性为100%,假阳性率为0,假阴性率为5%,与7种常见猪病血清无交叉反应。针对临床血清,用该方法检测结果与中和试验结果相比,符合率为100%。该方法能够快速、有效地检出TGEV抗体,重复性和特异性好,为标准化诊断试剂盒的开发奠定了基础。     

猪伪狂犬重组抗原间接ELISA诊断方法的建立

本研究应用重组抗原,成功建立了检测猪伪狂犬病病毒血清抗体的间接ELISA诊断方法。通过方阵滴定确定了抗原最适包被量为1.45μg/孔,血清最适稀释度为1∶80,其作用时间为60 min,酶标抗体最适作用时间为60 min。其阳性临界值为OD≥0.123。此外,该抗原不与猪其他疾病的阳性血清反应,具有良好的特异性;批内重复试验,变异系数小于10%。该方法与进口诊断试剂盒的符合率为96.3%。本研究为现地免疫猪群抗体检测和进行PRV流行病学调查提供了一种简便的血清学诊断方法。     

猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪A群轮状病毒多重RT-PCR检测方法的建立及临床应用

本试验旨在建立能同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪A群轮状病毒(GAR)的多重RT-PCR检测方法。根据GenBank收录的PEDVM基因、TGEVN基因、GARVP7基因,利用软件Pri mer 5.0设计合成能分别特异性扩增PEDV、TGEV、GAR相应基因的引物。利用这3对引物,作者建立了一种新的能够同时检测PEDV、TGEV和GAR的多重RT-PCR方法,并将这种方法和常规的RT-PCR进行了比较。实验室检测中,多重RT-PCR检测方法能够检测到35 pg的TGEV-PEDV-GAR三联苗的混合RNA。应用该方法检测了华中地区75份腹泻猪粪样,同时利用常规RT-PCR检测方法对该检测方法的敏感性和特异性进行了分析,结果表明该方法检测PEDV、TGEV、GAR的敏感性分别为92%、100%、100%,特异性均为100%。该方法敏感性高、特异性强,是一种新的检测PEDV、TGEV和GAR的方法。     

猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻疫苗研究进展

猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻均是由冠状病毒引起,患病仔猪以呕吐、腹泻、脱水为特征。目前,对这两种病的预防和控制以接种疫苗为主。本文就各种疫苗近年来的研究进展进行了综述,并指出了研究中存在的问题以及未来展望,希望能为这两种传染病疫苗的进一步研究提供新的思路。     

Prokaryotic Expression of Truncated S Gene of Porcine Transmissible Gastroenteritis Virus and Preliminary Test of Immunogenicity

To monitor TGEV antibody in pig,major antigenic fragments of TGE B/C zone was amplified by PCR,purified PCR product and pET-32a which were separately digested,and were connected and transformed into the BL21 competent cells.We picked out successfully transformed bacterial colonies to amplify by PCR,and put the remained bacterial colonies into LB solution to culture overnight,which was extracted to get recombinant plasmid and sequenced.We cultivated right sequenced bacteria to induce protein to express by IPTG,there was a right target band in 37 ku,which was purified by cutting polyacrylamide gel,then detected by Western blotting with homemade anti-rabbit serum,specific band (about 37 ku) could finally be seen in the right position,which proved that this recombinant protein was immunogenic.It would profitably create ELISA-kit to supervise TGEV antibody,and effectively provide some relevant value in immune situation of pig.     

猪传染性胃肠炎病毒截短S基因原核表达及免疫原性初步检测

为监测猪场猪群中猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）抗体水平,本研究利用TGEV冻存液,通过RT-PCR扩增得到S基因的主要抗原片段B/C区约560 bp,将其酶切后连接到pET-32a载体,转化大肠杆菌BL21感受态细胞。挑取转化成功的部分菌落进行PCR试验,将目的条带正确的菌落添加到LB培养基过夜培养,提取重组质粒并送测序。培养测序正确的菌液,利用IPTG诱导蛋白表达,通过SDS-PAGE试验,在约37 ku位置有一明显的目的条带。利用自制猪传染性胃肠炎兔血清通过Western blotting试验检测纯化的重组蛋白,在37 ku处可见一条带,表明此重组蛋白具有一定的免疫原性。本研究将有助于研究TGEV ELSIA检测试剂盒的组装并进行TGEV抗体水平的监测,为猪场免疫情况提供相应参考。     

Establishment of Double PCR Detection Method of Transmissible Gastroenteritis Virus (TGEV) and Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV)

Two pairs of primers used to respectively amplify transmissible gastroenteritis virus (TGEV) S gene and porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) M gene were designed to develop a method of differential diagnosis of TGEV and PEDV.The established double PCR could detect S gene of TGEV with the length of 299 bp and M gene of PEDV with the length of 437 bp.Negative results using CSFV,PCV2,PRRSV and PRV as control were obtained.The detection limit of this method was 10⁴ copies/μL.68 clinical samples collected from swine farm were submitted to detect TGEV and PEDV,and the result showed that the established double PCR method with the characteristics of high sensitivity and high specificity could be widely used in clinical diagnosis and epidemiological investigation.     

猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒二重PCR检测方法的建立

通过对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因和猪流行性腹泻病毒(PEDV)M基因进行序列分析,本试验利用DNAStar软件分别设计2对特异性引物,扩增片段长度分别为299和437 bp,建立一种针对TGEV和PEDV感染的二重PCR鉴别诊断方法.该方法能同时检测到TGEV和PEDV,而对猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)等均无扩增,其检测TGEV、PEDV的极限为10⁴ 拷贝/μL;用该方法对临床收集的68份疑似病毒性腹泻仔猪粪便和肠道组织样本进行检测,结果表明本试验建立的二重PCR方法具有特异性强、灵敏度高等特点,能用于临床诊断及流行病学调查.