牙鲆淋巴囊肿病DNA疫苗的安全性研究

<正>DNA疫苗(核酸疫苗)是利用现代免疫学、生物化学、分子生物学及生物信息学等生物技术研制而成的新型疫苗。核酸疫苗被导入宿主动物体内后,由体细胞摄取,并在细胞内表达病原体的蛋白质抗原,通过一系列的免疫反应刺激机体产生比较广泛的细胞免疫和体液免疫。与传统的灭活疫苗、亚单位疫苗和基因工程疫苗相     

牙鲆淋巴囊肿病药物防治试验

淋巴囊肿病（Lymphocyst ic disease简称LD）是由虹彩病毒科的淋巴囊肿病毒（L ymphocyst ic viru s简称LCV）引起的。牙鲆淋巴囊肿病发病率高,一年四季均可发病,目前尚无有效药物防治。牙鲆鱼淋巴囊肿病的特点是呈亚急性暴发,感染率高达809,6以上,病鱼死亡较多。但在同一养殖场的不同养殖车间,使用不同育苗场的牙鲆鱼苗种养殖的则未见发病,而使用同一厂家牙鲆鱼种苗所养殖的牙鲆鱼则普遍发病。     

养殖牙鲆淋巴囊肿病及防治

近年来,我国工厂化养殖牙鲆鱼规模不断扩大,随之而来的病害也日趋增多。2004年天津市病害测报中淋巴囊肿病是牙鲆鱼主要病害之一,该病是牙鲆工厂化养殖的高发病,我市测报牙鲆淋巴囊肿病发病面积1246m^3,累计发病率13．76％,经济损失逾百万元。牙鲆淋巴囊肿病可导致工厂化养殖大面积暴发流行,感染率高,损失惨重,因此加强病害综合防治非常重要。     

牙鲆淋巴囊肿病的病理和病原分离

应用常规显微和亚显微技术观察和分析患淋巴囊肿病养殖牙鲆(Paralichthys olioaceus)的病理学变化，利用差速离心和蔗糖密度梯度离心技术分离其病原——淋巴囊肿病毒，并利用牙鲆细组织细胞系FG—9307为感染基质，观察淋巴囊肿病毒引起的细胞病理变化。结果表明，患病牙鲆的囊肿组织是一些淋巴囊肿细胞的集合体，这些囊肿细胞排列紧密，直径为10—100μm，细胞近圆形，细胞质内散布有大量的嗜碱性包涵体，且多数集中在细胞的边缘部分；囊肿细胞内含有大量病毒粒子，其衣壳外形呈六角或五角形，直径为150—230nm，大多数病毒粒子中央有一致密的核，核外周包围着一双层核衣壳，核衣壳的表面可见一圈把手样亚单位。以患病牙鲆囊肿物制备的上清液接种细胞，7d内未见细胞异常，经盲传2—3代后，细胞出现较明显的细胞病变效应。     

利用中草药制剂防治牙鲆淋巴囊肿病的研究

中草药制剂作为一种无药物残留、无抗药性且能有效治疗鱼类疾病的药物已逐渐被研究开发和推广应用。本试验研究开发的防治鲆鲽类淋巴囊肿病的中草药制剂是在经过多年的艰苦探索,反复试验论证,并取得初步成效的基础上研制的。现将试验情况报告如下:     

应用免疫技术检测牙鲆组织内的淋巴囊肿病毒

应用免疫荧光抗体技术(IFAT)和标记链亲和素-生物素(LSAB)免疫组化法对患淋巴囊肿病牙鲆(Paralichthys olivaceus的肝、脾、肾、胃、幽门、肠、心脏、性腺、鳃、表皮10种组织进行了检测，结果发现体表有囊肿症状病鱼的胃、肠、鳃和表皮组织内有淋巴囊肿病毒存在；体表未见囊肿症状病鱼的胃、肠和表皮组织内也检测到了病毒，说明这两种免疫技术可以应用于牙鲆淋巴囊肿病的检测与诊断。同时本文还对淋巴囊肿病毒通过消化道感染的可能进行了探讨。     

无乳链球菌Sip-GAPDH嵌合核酸疫苗的制备及免疫效果评价

为了研究无乳链球菌Sip-GAPDH嵌合核酸疫苗对罗非鱼链球菌病的免疫保护作用,本研究通过PCR和重叠延伸拼接技术(SOEing)获得融合基因Sip-GAPDH,连接至真核表达载体pcDNA3.1(+)制备DNA疫苗,通过背鳍肌肉注射方式免疫吉富罗非鱼,免疫后第7、28天取样,采用PCR及RT-PCR方法检测pcDNA-Sip-GAPDH在各个组织(包括肌肉、脑、头肾、脾脏、鳃和肝脏)中的表达情况。采用ELISA、Real-time PCR法和体外攻毒法分别分析各实验组不同时间血清抗体效价、免疫基因(IgM、IL-1β和CD8)表达变化规律和相对保护率,研究该嵌合性疫苗对吉富罗非鱼的保护效果。结果显示,实验组在免疫接种第7和第28天时,注射点周围的肌肉、脑、头肾、脾脏、鳃和肝脏均能检测到嵌合性质粒,实验组罗非鱼血清抗体效价均高于对照组并于21 d时达到峰值(1∶4 096);qPCR数据表明,实验组鱼体胸腺、头肾和脾脏的IgM、IL-1β和CD8基因的mRNA表达量均出现了上调,并且在胸腺、头肾和脾脏中的表达量分别在免疫后第12和第48 h达到峰值;免疫后42 d进行人工攻毒后计算免疫保护率为93.3%。以上研究结果表明,本研究构建的无乳链球菌Sip-GAPDH嵌合核酸疫苗在罗非鱼链球菌病防治中具有潜在的应用价值。     

牙鲆抗淋巴囊肿病相关SSR标记的筛选与鉴定

为了筛选出中国牙鲆群体的抗淋巴囊肿病相关SSR标记,实验采用分群分析法对102个牙鲆个体(感病56个,抗病46个)进行了抗淋巴囊肿病相关SSR标记的筛选。首先构建了抗、感基因池(抗病个体和感病个体各15个),并利用178对微卫星引物对其进行了扫描;对于在抗、感池间扩增出差异条带的引物,用构建基因池的30个个体对其进行了第一次单个体验证;对于在第一次单个体验证中差异显著的引物用102个个体进行了第二次验证。结果显示,有4对引物(scaffold440_22585、scaffold826_5003、scaffold703_4284和scaffold185_597)在抗、感基因池间扩增出了差异条带;经第一次单个体验证,表明scaffold826_5003(P=0.023)和scaffold185_597(P178bp=0.028,P173bp=0.009)的差异条带在抗、感个体中呈显著性差异;经第二次单个体验证,发现scaffold185_597的差异条带在抗、感个体中出现的频率分别为60.9%和14.3%(P=0.001),差异显著;对scaffold185_597在10个抗病个体中扩增出的差异条带进行了克隆并测序,经BLAST比对,证实其为黄海水产研究所水产基因组与细胞工程研究室公布的牙鲆微卫星标记scaffold185_597中的一段,同源性达到96%。研究表明,微卫星标记scaffold185_597可能与牙鲆抗淋巴囊肿病相关。     

牙鲆淋巴囊肿病毒纯化及不同来源病毒免疫特性比较

比较了3种不同的牙鲆淋巴囊肿病毒纯化方法,优化后的方法如下：剥离囊肿表面薄膜,收集内容物,匀浆后再用超声波细胞破碎仪破碎,反复冻融,650×g、1800×g差速离心,30%（W/W）蔗糖垫底超速离心（78500×g）浓缩病毒,最后蔗糖密度梯度超速离心（78500×g）纯化病毒。电镜观察发现,出现在47%～52%蔗糖密度区域的病毒带含有多量、纯净和结构一致的病毒粒子。此外,利用制备的兔抗血清对不同地区的病毒进行了免疫特性分析,Western blotting检测显示来自威海、青岛及秦皇岛3个地区的淋巴囊肿病毒反应结果是一致的,均有3条蛋白带发生反应,其分子量分别为125、66和55kDa。     

鱼用疫苗免疫效果评价的研究进展

<正>病害是影响我国水产养殖业健康发展的重要因素。2012年我国由于病害导致的水产养殖产量损失达2.5×105t(2013中国渔业统计年鉴),造成了严重的经济损失。因此,寻找有效的病害防控方法至关重要。当前广泛采用的鱼病防控方法是药物防控,即大量使用广谱抗生素和化学药物,这种方法存在病原菌耐药性增强、药物残留、环境污染等诸多弊端,很难满足我国水产病害防控需求。相对于化学药物,疫苗可以安全有效的预防鱼类传染     

鱼肠道弧菌外膜蛋白疫苗对牙鲆免疫效果的初步研究

为研究鱼肠道弧菌外膜蛋白疫苗对牙鲆的免疫效果,用该种疫苗对牙鲆进行了免疫试验.给牙鲆注射鱼肠道弧菌外膜蛋白疫苗,饲养25 d后分别用鱼肠道弧菌、鳗弧菌和溶藻弧菌进行攻毒,20 d后分别统计各组鱼的免疫保护率.结果表明,该疫苗对鱼肠道弧菌、鳗弧菌和溶藻弧菌的免疫保护率分别为84.6%、30.8%、33.3%.     

牙鲆淋巴囊肿病毒灭活疫苗制备及应用

淋巴囊肿病毒（Lymphocystis virus）属于虹彩病毒科（I ridoviridae）,病毒粒子含DNA正二十面体,直径一般200-250nm,该病毒的感染性在18～20℃水中能保持5d以上,是感染高峰期。淋巴囊肿病是一种慢性皮肤瘤。牙鲆淋巴囊肿主要症状表现在鱼类的皮肤上、鳍上和眼球等处出现小水泡状的肿状物,这些肿状物多呈白色、淡灰色、灰黄色、个别囊肿物因寄生部位充血而略显红色,囊肿大小1～10mm并紧密相连呈桑椹状。淋巴囊肿病全年可见,     

腹水病(Virulent ascitesosis disease)和溃烂病(Ulcer disease)致病病原四联疫苗制备及免疫牙鲆效果评价

腹水病和溃烂病是海水工厂化养殖牙鲆（Paralichthys olivaceus）危害严重的疾病。作者用本实验室分离鉴定的腹水病、溃烂病致病菌-迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda,Et）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus,Val）、杀鲑气单胞菌（Aeromonas salmonicida,As）和同行实验室赠予的鳗弧菌（Vibrio anguillarum,Van）制备灭活菌苗,设计四种不同配比四联疫苗,按正交试验要求,分别腹腔注射接种免疫牙鲆,检测单抗原抗体效价,统计分析筛选出组合合理的四联疫苗,配比为Et：Val：Van：As=2：1：1：2,并进行了疫苗安全性、稳定性评价及免疫牙鲆效果观察。发现该四联疫苗是安全的,稳定的,可在4℃下存放1年以上活性不降低,能有效刺激牙鲆特异性免疫系统产生免疫应答,免疫后7天血清抗体效价明显升高,免疫后14d血清抗体效价达到最高水平,为2^10;人工攻毒试验测定相对免疫保护率为60％。表明,筛选出的牙鲆腹水病和溃烂病四联疫苗安全有效,可同时预防腹水病、溃烂病的发生和流行。     

鲤鱼淋巴囊肿病

正病原或病因本病是由虹彩病毒科的淋巴囊肿病毒(Lymphocystis virus)引起的一种慢性皮肤瘤传染病。病毒粒子20面体,有囊膜。临床症状病情较轻时,发病鱼无明显症状,病情严重时食欲减退甚至不摄食,病鱼的皮肤、鳍条及体表各部位形成大小不一的囊肿物,颜色有白色、粉红色和黑色,较大的囊肿物上有肉眼可见的红色小血管。     

牙鲆抗淋巴囊肿系肌肉营养成分的分析

为研究牙鲆抗淋巴囊肿系及其亲本雌核发育系的肌肉品质,采用常规方法分析比较7月龄体质量分别为(219.88±33.82) g、(213.53±27.20) g和(237.51±26.04) g的母系、父系和抗淋巴囊肿系牙鲆肌肉的营养成分。试验结果显示：牙鲆抗淋巴囊肿系肌肉鲜样中的水分、蛋白质和灰分含量与亲本系无显著差异(P>0.05),但粗脂肪含量显著低于母系(P<0.05),而与父系差异不显著(P>0.05);3系均含有18种氨基酸,除色氨酸和酪氨酸含量差异显著(P<0.05)外,其他16种氨基酸含量均差异不显著(P>0.05)。根据氨基酸评分和化学评分,3系的第一限制性氨基酸均为色氨酸,必需氨基酸指数分别为抗淋巴囊肿系(87.40)>母系(79.86)>父系(79.04),必需氨基酸组成符合联合国粮食及农业组织/世界卫生组织标准;抗淋巴囊肿系的饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸含量显著低于亲本系,而母系的二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸的含量丰富,显著高于抗淋巴囊肿品系和父系(P<0.05)。综上所述,牙鲆抗淋巴囊肿系及其亲本系的营...     

多效价载体疫苗免疫大菱鲆效果评价

采用注射与浸泡2种方法,对构建的多效价载体疫苗MVAV6203A-1进行了免疫保护效果和血清效价的研究.结果显示,用多效价载体疫苗注射免疫大菱鲆(Scophthalmus maximus),可同时获得对鳗弧菌(Vibrio anguillarum)和嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的免疫保护效果,免疫相对保护率分别为80.6％和77.0％;用ELISA方法测定血清效价的结果显示,免疫MVAV6203A-1后大菱鲆血清效价最高达到2 048,均值为891,明显高于对照组的97;用多效价载体疫苗浸泡免疫大菱鲆后,对鳗弧菌与嗜水气单胞菌的免疫相对保护率分别为62.2％和11.7％.血清效价分析显示,实验组与对照组的均值均为64.上述结果表明,所构建的疫苗MVAV6203A-1可有效提高大菱鲆对鳗弧菌和嗜水气单胞菌的免疫力,并且免疫和攻毒的途径可能是影响免疫保护效果的因子.本研究旨在为鳗弧菌与嗜水气单胞菌引起的鱼类疾病防治提供技术支撑.     

四川省2018年口蹄疫疫苗免疫效果评价

为了解四川省2018年口蹄疫疫苗免疫效果,随机抽取5个厂家的5种类型的口蹄疫疫苗进行免疫效果评价试验。在第二次免疫4周后检测口蹄疫抗体水平,结果表明:猪O型口蹄疫灭活疫苗、猪O型口蹄疫合成肽疫苗、猪O-A型口蹄疫二价灭活苗、牛羊O型-亚洲I型口蹄疫双价疫苗等4种类型的疫苗,各厂家疫苗的免疫抗体合格率均达到农业部规定70%以上要求;牛羊O型-亚洲I型-A型口蹄疫三价疫苗4个厂家的O型和A型抗体合格率均达到农业部规定70%以上要求,其中2个厂家的亚洲I型抗体合格率未达到70%以上。     

鱼类的淋巴囊肿病

淋巴囊肿病据外观病状即可进行诊断,是发现最早的鱼类病毒性疾病之一,于1874年就有记载,也是最早有文字记载的鱼类病毒病,目前国外曾报告包括海水、淡水和半咸淡水在内的9科42目125种鱼类患淋巴囊肿病。在淡水鱼上主要是危害丽科的鱼,如各种慈鲷和短鲷;海水鱼类有鲈形目、鲽形目和纯形目中的一些种类。     

人工感染淋巴囊肿病毒牙鲆的免疫球蛋白水平变化

用患淋巴囊肿病牙鲆体表肿瘤纯化的淋巴囊肿病毒对健康牙鲆进行人工感染,应用抗牙鲆免疫球蛋白单克隆抗体通过间接酶联免疫法（ELISA）检测感染之后的牙鲆血清总抗体水平和抗LCDV特异性抗体水平的变化规律。结果表明,感染7d后,牙鲆血清中特异性抗体和总抗体水平都显著升高。抗LCDV特异性抗体水平在405nm处的OD值从对照的0.129上升至0.238;随着感染时间延长抗体水平持续升高（第14天0.247,第21天0.410）,在第28天达到最高值0.436,然后开始缓慢降低（第35天0.385,第98天0.357）;总抗体水平在405nm处的OD值从对照的0.135上升至0.250;随着感染时间延长抗体水平持续升高（第14天0.266,第21天0.561）,在第28天达到最高值0.613,然后开始缓慢降低（第35天0.480,第98天0.475）。通过间接免疫荧光技术（IFAT）在感染第14天以后的牙鲆的肠、胃中检测到病毒。