海产蟹类血卵涡鞭虫间接荧光抗体快速检测技术

以寄生于三疣梭子蟹血淋巴中的血卵涡鞭虫虫体为抗原,制备了多克隆血清抗体.抗体经健康梭子蟹血淋巴吸附处理后,间接ELISA检测效价达7 680.应用该抗体建立了血卵涡鞭虫的间接荧光抗体检测技术(IFAT).采用常规显微镜检、PCR及IFAT 3种方法对采集的养殖青蟹、梭子蟹及海捕梭子蟹等18个样本进行了检测.检测结果显示:常规显微镜检阳性检出率为33.3%,而IFAT及PCR检测阳性率77.8%,符合率达100%;阳性虫体被染上黄绿色荧光,而正常梭子蟹血细胞则未被染色;可检测到血卵涡鞭虫不同生活阶段的营养体、腰鞭孢子及合孢体阶段.为血卵涡鞭虫的流行病学调查及生活史研究提供了简便实用的方法.     

海产蟹类血卵涡鞭虫病间接荧光抗体快速检测技术

以寄生于三疣梭子蟹血淋巴中的血卵涡鞭虫虫体为抗原,制备了多克隆血清抗体。抗体经健康梭子蟹血淋巴吸附处理后,间接ELISA检测效价达7680。应用该抗体建立了血卵涡鞭虫的间接荧光抗体检测技术(IFAT)。采用常用显微镜检、PCR及 IFAT三种方法对采集的养殖青蟹、梭子蟹、及海捕梭子蟹等18个样本进行了检测。检测结果显示：常规显微镜检阳性检出率为33.3%,而IFAT及PCR检测阳性率77.8%,符合率达100%;阳性虫体被染上黄绿色荧光,而正常梭子蟹血细胞则未被染色;可检测到血卵涡鞭虫不同生活阶段的营养体、腰鞭孢子及合孢体阶段。本文为血卵涡鞭虫的流行病学调查及生活史研究提供了简便实用的方法。     

海产甲壳类血卵涡鞭虫病研究进展

血卵涡鞭虫是导致海产甲壳类疾病的主要寄生虫病原之一,国内迄今尚未见相关报道。本文结合作者近年来对海水养殖甲壳类病害的研究结果,较系统地综述了国外甲壳类寄生血卵涡鞭虫的研究进展,包括分类地位、生活史、传播途径、流行病学、组织病理以及诊断方法,并提出了相应的防治措施,旨在为中国海水养殖蟹类血卵涡鞭虫病害的研究与防治提供参考。     

血卵涡鞭虫的发生及流行研究进展

血卵涡鞭虫(Hematodinium)是一类危害海水甲壳类动物的致病性寄生甲藻,自1931年以来感染超过40多种甲壳类动物,导致了一些经济类甲壳动物的大量死亡。为有助于加强对血卵涡鞭虫的防控,从季节、环境、宿主类型和传播模式方面,总结了血卵涡鞭虫流行和发生的原因。     

三疣梭子蟹 Portunus trituberculatus (Miers) 血卵涡鞭虫病诊断与综合防治措施

血卵涡鞭虫是导致海产甲壳类疾病的主要寄生虫病原之一，国内迄今尚未见相关报道。本文根据作者近年来对海水养殖梭子蟹血卵涡鞭虫病的研究结果．就该病在养殖梭子蟹当中的流行情况及诊断方法进行介绍，并提出了相应的综合防治措施，旨在为我国海水养殖接类血卵涡鞭虫病害的研究与防治提供参考。     

环介导恒温扩增技术检测血卵涡鞭虫

血卵涡鞭虫病是海水甲壳类的重要寄生虫病,其流行范围广、死亡率高、危害非常严重。本研究根据GenBank中已登录的血卵涡鞭虫(Hematodinium sp.)ITS1序列设计了1套引物,该引物可识别目标基因中6个不同区段。以此套引物建立了一种基于环介导恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)的血卵涡鞕虫病诊断方法。特异性试验结果表明,该套引物对血卵涡鞕虫检测具有较高的特异性,能有效检出血卵涡鞕虫。敏感度试验结果表明,该LAMP技术的灵敏度比常规PCR技术高4个数量级。分别运用LAMP和常规PCR技术对25份临床疑似病例进行检测,LAMP方法共检出感染病例25份,常规PCR检出感染病例23份。该技术能在65℃恒温条件下45～60min完成目的DNA的扩增,可直接通过肉眼观察反应产物中是否产生白色沉淀或经SYBRGreenI染色后通过颜色变化、扩增产物的琼脂糖凝胶电泳来定性判断结果,这将为血卵涡鞕虫病的临床诊断提供一种更加简便、快速、实用的方法。     

应用PCR方法检测患“黄水病”锯缘青蟹中的血卵涡鞭虫

"黄水病"是目前锯缘青蟹养殖过程中的主要疾病之一,病蟹主要症状表现为肌肉白浊,体液呈土黄色或浊白色牛奶状。因该病流行范围广、发病率和死亡率高,给青蟹养殖业主造成巨大经济损失,严重地影响了青蟹养殖的健康发展。本研究从病蟹体液中发现大量疑似血卵涡鞭虫的寄生原虫,应用已建立的梭子蟹血卵涡鞭虫病的PCR检测方法对患"黄水病"青蟹进行检测。结果从患病青蟹组织的DNA中扩增出产物大小为585bp的特异性目的片段,经序列分析比较,与三疣梭子蟹上发现的血卵涡鞭虫的序列同源,同源性达99.7%。综合病原流行病学调查、组织病理学、电镜观察等分析结果,初步确定血卵涡鞭虫是引起养殖青蟹"黄水病"的重要病原。     

硫酸铜治疗卵形鲳鲹淀粉卵涡鞭虫病的研究

为更科学地使用硫酸铜治疗淀粉卵涡鞭虫病,该研究以卵形鲳鲹 (Trachinotus ovatus) 为动物模型,探讨了硫酸铜对眼点淀粉卵涡鞭虫 (Amyloodinium ocellatum) 生活史各个阶段的有效驱杀浓度和作用时间,并评估其对卵形鲳鲹幼鱼的安全质量浓度范围。结果显示,卵形鲳鲹幼鱼对硫酸铜的耐受性强,安...     

硫酸铜治疗卵形鲳鯵淀粉卵涡鞭虫病的研究

为更科学地使用硫酸铜治疗淀粉卵涡鞭虫病,该研究以卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)为动物模型,探讨了硫酸铜对眼点淀粉卵涡鞭虫(Amyloodinium ocellatum)生活史各个阶段的有效驱杀浓度和作用时间,并评估其对卵形鲳鲹幼鱼的安全质量浓度范围.结果显示,卵形鲳鯵幼鱼对硫酸铜的耐受性强,安全质量浓...     

黄姑鱼淀粉卵涡鞭虫病的防治

近年来,在黄姑鱼育苗和苗种培育过程中经常感染淀粉卵涡鞭虫病。该病主要危害鱼苗和鱼种,一般在4～7月或9～10月发生,水温22—28℃,pH7．3～8．3时容易发生,病程短、传染快,如不及时处理易并发细菌感染。     

梭子蟹肌孢虫的组织分布与形式特点

利用透射电镜技术研究了梭子蟹肌孢虫在三疣梭子蟹体内的组织分布和形式特点,结果显示,梭子蟹肌孢虫主要寄生在骨骼肌、血淋巴、鳃、胃和肠,而在心脏、肝胰腺、性腺和神经等部位未发现。在胃和肠的结缔组织以及骨骼肌中发现梭子蟹肌孢虫的分裂体,表明其可以在这些组织的细胞中增殖,尤其是在骨骼肌细胞中,大量不同发育时期的虫体显示了该虫对骨骼肌的亲嗜性。梭子蟹肌孢虫的分裂体以及其他增殖期的细胞仅寄生于宿主细胞内,而成熟的孢子可存在于宿主细胞内和细胞外基质中。梭子蟹肌孢虫的孢子有6种存在形式,在宿主细胞内和宿主细胞外基质中各有3种。孢子在宿主细胞内的存在形式:1孢子直接寄生于宿主细胞质中,自由游离,无膜包围;2孢子被单层膜包围,类微绒毛样突起物部分溶解,这种情况见于专业性吞噬细胞——无颗粒细胞内;3孢子被层状环形膜结构包围,类微绒毛样突起物清晰,这种情况见于非专业性吞噬细胞内。孢子在宿主细胞外基质中的存在形式:1孢子自由游离,无膜包围,类微绒毛样突起物清晰;2多个孢子被体液性被囊包围,类微绒毛样突起物清晰;3孢子无膜包围,孢外壁与类微绒毛样突起物消失。本研究阐明了梭子蟹肌孢虫在三疣梭子蟹体内的组织分布和孢子的存在形式,为进一步研究微孢子虫在宿主蟹体内的迁移规律提供了重要的基础数据。     

三疣梭子蟹精子活力评价方法的研究

采用染色法和钙离子载体A23187诱导精子顶体反应法,对三疣梭子蟹精子的活力进行评价研究.结果表明,采用台盼蓝染色无法清晰辨别死、活精子.采用曙红B染色,精子分别呈现不同的染色特征:活精子无色,细胞边界清晰可辨,在光学显微镜下观察可见顶体中央突起的圆锥状结构和辐射臂;死精子细胞边界有稍许模糊,核杯和顶体均着色.最适的曙红B浓度和染色时间分别为2%和2 min.钙离子载体.A23187诱导精子顶体反应的结果显示:在诱导时间和A23187浓度分别为50 min和30μg·mL-1时,校正顶体反应率达到(92.73±2.43)%.对这两种活力检测方法的比较分析显示,曙红B染色法和钙离子载体A23187诱导精子顶体反应法的活力检测值与样品理论值呈显著正相关(P<0.01),他们二者之间亦呈显著正相关(P<0.01),说明这两种方法均可用于精子活力检测,其结果具有可比性.     

池塘养殖三疣梭子蟹的生长规律

为探讨池塘养殖三疣梭子蟹的生长规律和雌雄差异，本研究对1～6月龄池塘养殖三疣梭子蟹各生长指标进行了比较分析，并采用Logistic模型分别拟合三疣梭子蟹的体重(BW)、体长(BL)、体高(BH)、全甲宽(FCW)、甲宽(CW)、大螯长节长(MLC)、大螯不动指长(FFLC)、第一步足长节长(MLFP)等8个形态性状的生长特征。结果显示，三疣梭子蟹雌性和雄性的生长存在差异，早期雄性生长较快，后期雌性生长较快，而雌雄混合分析介于二者之间。三疣梭子蟹各生长性状的Logistic模型拟合结果显示，除雌性MLC和MLFP以及雌雄混合分析的MLFP之外，其余性状R²均达到0.990以上；雌性和雄性体质量的极限生长值分别为290.27和195.91g，快速生长区间分别为2.74～5.10月龄和2.33～4.14月龄，拐点分别为3.92和3.24月龄。研究表明，三疣梭子蟹的生长过程均符合“慢-快-慢”的特征，雄性比雌性更早进入快速生长期，但是快速生长期的持续时间不及雌性。本研究对三疣梭子蟹不同生长指标的规律特征，以及各指标在混合养殖条件下雌性和雄性的优势阶段进行了研究，为实现三疣...     

三疣梭子蟹卵黄磷蛋白纯化及其ELISA测定方法

采用凝胶过滤层析法纯化了三疣梭子蟹成熟卵巢的卵黄磷蛋白(vitellin,Vn),采用变性凝胶电泳(SDS-PAGE)确定了Vn亚基数量和分子量,以纯化的Vn为抗原,制备了三疣梭子蟹Vn多克隆抗血清,纯化后得到Vn抗体,在此基础上比较和优化了三疣梭子蟹Vn测定的酶联免疫吸附法(ELISA)参数,建立了稳定的三疣梭子蟹Vn含量测定的ELISA方法。结果表明:(1) SDS-PAGE 显示三疣梭子蟹成熟卵巢中的Vn含有分子量为100、75和66 ku的3个亚基,Western-blotting检测表明,这3个亚基均具有较强的免疫特异性;(2) 样品直接包被法比双抗体夹心法具有更高的线性相关性,Vn抗体最佳稀释倍数为1∶90 000,最佳包被时间为8 h,一抗和二抗反应时间分别为2 h和1 h,显色时间为20 min;(3) 该方法定性检测的灵敏度为14.9 ng/mL左右,标准曲线方程为y=0.000 9x+0.399 1(R²=0.986 1),其中x和y分别代表Vn浓度和OD₄₅₀值,工作范围为200～900 ng/mL;(4) 应用该方法测定三疣梭子蟹卵巢中Vn含量,结果表明,批次内和批次间平均变异系数分别为3.59%和3.10%,重复性良好。     

三疣梭子蟹受精卵离体孵化技术

为了探究三疣梭子蟹受精卵的离体孵化技术及效果,本研究先后开展了受精卵块最适分离液种类及作用条件的筛选、分离液处理不同发育期受精卵离体孵化的差异、分离液处理对受精卵卵膜的结构影响,及分离液处理受精卵对孵化后幼体活力的影响实验。结果显示,木瓜蛋白酶是一种较为理想的分离液,在浓度为0.09 g/mL,分离时间30 min时,分离率可达到99%以上;经过分离液处理后的各期受精卵均能孵化出幼体,卵内溞状幼体期离体胚胎孵化率最高,为89.0%±3.3%,未经处理的对照组为70.0%±4.8%;卵裂期离体胚胎孵化率最低,为58.0%±3.9%,对照组为31.0%±2.3%,与对照组相比,处理组的孵化率明显提高。透射电镜结果显示,经过分离液处理的受精卵卵膜结构疏松,且厚度降低,符合处理组孵化率增加这一现象,干露、福尔马林溶液胁迫和行为学测试对不同处理组的幼体进行质量评价的结果显示,处理组和对照组幼体活力无显著差异。研究表明,实验所获得的分离液可以有效提高三疣梭子蟹受精卵的分离率和孵化率,且不影响幼体质量,可为三疣梭子蟹及其他甲壳动物受精卵的离体孵化提供参考。本研究可为三疣梭子蟹的苗种繁育提供新的技术手段,也将为基因编辑辅助育种等技术的实施奠定基础。     

三疣梭子蟹颗粒血细胞单克隆抗体的研制及7种甲壳类动物血细胞的交叉反应研究

为研究虾蟹类甲壳动物血细胞膜表面是否具有相同的抗原决定簇及共同抗原表位的生物学特征,采用制备的抗三疣梭子蟹颗粒血细胞单克隆抗体,通过激光共聚焦扫描显微镜(laser scanning confocal microscopy,LSCM)、免疫印迹(Western blot)和流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)等多种方法,测定了7种甲壳类动物(凡纳滨对虾、中国明对虾、刀额新对虾、口虾蛄、中华绒螯蟹、日本板蟹及美洲黄道蟹)颗粒血细胞及透明血细胞与三疣梭子蟹颗粒血细胞单克隆抗体发生特异性结合的抗原表位。LSCM可观察到该株抗三疣梭子蟹颗粒血细胞单克隆抗体与中华绒螯蟹和日本板蟹血细胞交叉反应结果为阳性,分析发现在中华绒螯蟹血淋巴中阳性颗粒血细胞在其颗粒血细胞总数中占76.74%,阳性透明血细胞在其透明血细胞总数中占70.59%,日本板蟹阳性颗粒血细胞在其颗粒血细胞总数中占73.86%,阳性透明血细胞在其透明血细胞总数中占16.67%,其余5种甲壳类动物均为阴性;Western blot测试结果显示该株单克隆抗体仅与中华绒螯蟹血细胞反应,且发生反应的抗原决定簇位于分子量为30 ku的蛋白带上;FCM分析发现该株单克隆抗体与中华绒螯蟹透明血细胞和颗粒血细胞均可发生交叉反应,阳性率分别为57.72%和77.05%,与日本板蟹透明血细胞阳性反应极少,阳性率仅为9.57%,与颗粒血细胞发生阳性反应的阳性率为82.59%。     

三疣梭子蟹低盐耐受性相关甲基化标记的开发及验证

为开发三疣梭子蟹低盐耐受性相关甲基化标记,采用甲基化敏感性高分辨率熔解曲线法(methylation sensitive high resolution melting curve, MS-HRM)进行了三疣梭子蟹低盐耐受性相关甲基化位点的筛选和应用。结果显示,从三疣梭子蟹转录组数据库中共开发了8个甲基化标记,其中6个标记与低盐度耐受性显著相关,在低盐度条件下表现出显著的去甲基化或甲基化,这些标记分别位于V-ATP酶(V-type proton ATPase)、CLC型氯离子通道、琥珀酸脱氢酶、NAD(P)转氢酶(NAD(P)、磷酸乙醇酸性磷酸酶、NADH还原酶基因,为三疣梭子蟹耐低盐新品种的分子标记辅助选育提供候选工具。研究表明,“宁象1号”耐低盐能力显著高于野生群体,且选育群体中位点Pt-M1、Pt-M2的去甲基化率达到100%,可能有利于低盐条件下保持体内Na⁺和Cl^-的平衡。     

三疣梭子蟹EcR基因的克隆及表达分析

为研究蜕皮激素受体(EcR)在甲壳动物生长和生殖过程中的作用,采用反转录PCR(RT-PCR)和cDNA 末端快速扩增(RACE)技术,克隆了三疣梭子蟹蜕皮激素受体 (PtEcR)基因全长cDNA序列(GenBank登录号:KC354381),运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法,分析该基因在不同组织、蜕皮时期和二次卵巢发育阶段的表达特 征。结果表明,PtEcR cDNA全长2 231 bp,包含1 269 bp ORF,编码422个氨基酸;推导的PtEcR氨基酸序列与已公布的其他甲壳动物EcR进行比对,发现一致性 达67%～97%;系统进化树分析PtEcR与其它甲壳动物EcR聚为一支,而昆虫EcR聚为另一支。PtEcR在检测的三疣梭子蟹10个组织中均有表达,其中在Y-器(YO)表达量最高。在蜕皮周期中,自蜕皮后期至蜕皮前期D2亚期PtEcR在YO中的表达量一直较低;至D3亚期和D4亚期,PtEcR表达量显著升高,这与血 淋巴中20-羟基蜕皮酮(20E)浓度在D3/D4亚期显著升高相协同,表明PtEcR在三疣梭子蟹蜕皮过程中起着重要的作用。二次卵巢发育阶段,PtEcR在YO和肝胰 腺(Hp)中的表达量自Ⅱ期逐渐升高至Ⅳ期达到最高;卵巢(Ov)中,则在Ⅰ、Ⅲ期较低,Ⅱ、Ⅳ期较高,表明PtEcR可能参与卵巢发育和卵黄发生。     

三疣梭子蟹LGBP基因的重组表达及微生物结合实验

将扩增得到的三疣梭子蟹LGBP基因开放阅读框与表达载体pET-22b(+)连接,转化E.coil BL21(DE3)plysE后IPTG诱导表达。经SDS-PAGE检测,发现诱导组比空载体和未诱导组多出一条分子量约为41 ku的表达产物,与预测的重组蛋白分子量大小基本一致。重组质粒在不同IPTG浓度和不同温度条件下诱导表达产物的SDS-PAGE分析结果显示,低浓度0.4 mmol/L IPTG和30 ℃诱导能有效减少菌体蛋白的本底表达。用纯化的重组蛋白连续免疫小鼠,4周后得到抗血清,经Western-blotting检测,其具有很好的特异性。微生物结合实验表明,重组表达的pET-LGBP具有较强的生物活性,其与丹麦啤酒酵母、巨大芽孢杆菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、大肠杆菌等均有结合能力。     

三疣梭子蟹快速生长品系核心种质有效群体含量

三疣梭子蟹是我国海水养殖的重要种类之一,良种选育核心种质的繁衍与更新是制约品种选育成功的技术瓶颈。根据Doyle和Talbot提出的计算有效群体含量的计算公式,对2008年三疣梭子蟹快速生长品系核心育种群有效群体含量进行估算,得出实际群体有效含量为213,实际近交系数为0.002 3,其近交系数较小,近交衰退控制在较低的水平。但三疣梭子蟹保种数量和留种方式仍然困扰育种群体控制,因此,借鉴畜禽的保种模式,从留种方式、雌雄比例、保种数量等方面对三疣梭子蟹快速生长品系核心基础群进行保种研究。结果表明,采用随机留种,雌雄1∶1比例交尾,雌雄数量各131只,此保种模式既能保证三疣梭子蟹快速生长品系核心基础群遗传多样性处于较高水平,使其具有较大的选育潜力,又能使保种成本维持在一个合理水平。此研究模式也为理论保种模式,需要在以后的实际群体选育过程中逐步完善。