凡纳滨对虾热休克蛋白70的原核高效表达

将凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）热休克蛋白70基因（heat shock protein 70，HSP70）克隆到原核表达载体pET-3c中，经酶切和DNA测序鉴定后，将重组质粒转入表达宿主BL21（DE3），在不同温度、时间下经IPTG诱导表达。收集菌液，进行SDS-PAGE和Western blot检测，并用软件Bandscan分析蛋白表达水平。结果表明，成功构建含凡纳滨对虾HSP70基因的重组表达载体pET-3c／HSP70，表达的目标蛋白相对分子量约为72kD，并能与小鼠抗人HSP70抗体特异性结合。37℃诱导5h目标蛋白表达量最高；但25℃诱导目标蛋白的可溶性比例达80％，目标蛋白占全菌总蛋白70％以上，均较37℃为高。     

凡纳滨对虾热休克蛋白90基因cDNA全长克隆及表达分析

为探究咪唑类物质KK-42提高凡纳滨对虾存活率的机理,克隆出HSP90全基因序列,采用real-time PCR法研究该基因的时空表达状况。将体长3.5～5.0cm的凡纳滨对虾幼虾随机分成2组,分别用1.95×10-4 mol/L的KK-42溶液和不含KK-42的溶液浸泡1min后,在相同条件下常规饲养。试验结果显示,凡纳滨对虾HSP90开放阅读框为2160bp,编码720个氨基酸,包含HSP90家族的保守序列。HSP90在凡纳滨对虾脑、肌肉、眼柄和肝胰腺中均有表达,其中肝胰腺中的表达水平较高。KK-42处理后,肝胰腺中HSP90mRNA水平升高69.1%以上(P0.05),其中第2d和3d,mRNA含量分别升高了505.5%和481.7%(P0.01)。结果表明,KK-42能诱导凡纳滨对虾肝胰腺HSP90的表达,这可能是KK-42提高凡纳滨对虾存活率的机制之一。     

复方中草药对凡纳滨对虾热应激蛋白70基因表达的影响

为了研究复方中草药对凡纳滨对虾热应激蛋白70基因mRNA表达的影响,试验凡纳滨对虾随机分为2组,第1组喂食基础饵料辅以1％的复方中草药,第2组喂食基础饵料作为对照。采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）对2组凡纳滨对虾的肝组织进行HSP70基因的mRNA表达检测,并以18SrRNA为内参照进行基因表达水平的半定量分析,结果显示第1组的凡纳滨对虾的肝组织HSP70基因的mRNA的表达显著高于第2组（P〈0．05）,说明复方中草药可提高凡纳滨对虾HsP70基因mRNA的表达量。     

保幼激素拮抗物KK-42对凡纳滨对虾HMGR表达的抑制

为研究保幼激素拮抗物KK-42促生长的分子机制,实验克隆出甲基法呢酯(MF)合成的关键酶——3-羟-3-甲基-戊二酰还原酶A(HMGR)部分mRNA序列,并研究该基因时空表达以及KK-42对其表达的影响。将体长3.5~5.0 cm凡纳滨对虾幼虾随机分为2组,分别用1.95×10^-4 mol/L的KK-42溶液或不含KK-42的溶液浸泡处理1 min,之后在相同条件下常规饲养。不同组织中HMGR mRNA水平定量分析采用realtime PCR,血淋巴中MF滴度测定采用正相高效液相色谱法。结果显示,HMGR mRNA水平在大颚器官(MO)最高,其次是眼柄,肌肉和肝胰腺水平最低。在实验观察期间,眼柄与MO两种组织中HMGR的表达模式明显不同,前者各时间点mRNA水平变化较小,无统计学差异(P>0.05);后者mRNA含量分别在第1、7天显著高于第0天;实验期间血淋巴MF滴度逐渐升高。KK-42处理可显著抑制HMGR表达,但眼柄和MO中HMGR转录的下调模式仍不相同,前者mRNA水平在各时间点之间没有明显差异(P>0.05);而在MO下调幅度出现明显波动,其中在第1和7天,mRNA含量分别下降了82.5%和90.7 %;血淋巴MF滴度逐渐下降。结果表明,KK-42可显著抑制凡纳滨对虾多种组织(尤其是MO和眼柄)HMGR转录,降低血淋巴MF滴度,这可能是其促生长的机制之一。     

白斑综合征病毒感染对凡纳滨对虾热休克蛋白60和90表达的影响

采用实时荧光定量PCR技术分析白斑综合征病毒(WSSV)感染凡纳滨对虾不同时段鳃、肠、肝胰腺、肌肉、类淋巴和血细胞组织中热休克蛋白(HSP)60和90基因mRNA转录水平的变化。结果显示,HSP60和HSP90在这6个组织中都有表达,WSSV感染影响各组织中HSP60和HSP90 mRNA转录水平的表达,WSSV感染抑制HSP60在鳃、肠、肌肉和血细胞的表达,促进HSP90在鳃、肠、肝胰腺、肌肉、血细胞和类淋巴的表达,表明HSP60和HSP90参与WSSV感染免疫反应。     

凡纳滨对虾细胞色素P450家族新基因CYP4V18的克隆及KK-42对其转录的抑制

为探讨咪唑类物质KK-42促进凡纳滨对虾(Litopenaeaus vannamei)生长的分子机制,本研究克隆出与蜕皮和生长相关的CYP4V18基因的全序列,研究了该基因的时空表达,并结合测定血淋巴20-羟基蜕皮甾酮(20E)滴度。将体长3.5～5.0 cm凡纳滨对虾幼虾随机分为2组,分别用1.95×10-4mol/L的KK-42溶液或不含KK-42的溶液浸泡处理1 min,之后在相同条件下常规饲养。CYP4V18 mRNA水平定量分析采用real-time PCR,血淋巴中20E滴度测定采用反相高效液相色谱法。结果显示,CYP4V18开放阅读框为1 545 bp,编码515个氨基酸,包含CYP450保守序列;系统进化显示,CYP4V18与CYP4家族基因的亲缘关系最近。CYP4V18 mRNA水平在肝胰腺最高,分别是脑、Y-器官和肌肉的4、26和32倍。KK-42处理可显著抑制CYP4V18表达,在第2、4和6天分别降低了72.3%(P<0.05)、82.6%(P<0.05)和187.7%(P<0.01)。与同期对照组相比,KK-42处理之后血淋巴20E滴度在第2、4和6天分别升高1.7%、6.5%和13.5%。结果表明,KK-42可显著抑制凡纳滨对虾肝胰腺CYP4V18转录,升高血淋巴20E滴度,这可能是KK-42促生长机制之一。     

保幼激素拮抗物KK-42对凡纳滨对虾FAMeT时空表达的影响

保幼激素拮抗物KK-42对凡纳滨对虾(Penaeus schmitti)的生长具有显著的促进作用,并已在大塘养殖中得到推广应用,但其作用机制尚不清楚.为给今后科学合理地使用KK-42提供理论依据,本研究对直接调节甲壳动物生长的重要激素甲基法呢P(MF)合成的关键酶--法呢酸O-甲基转移酶(FAMeT)的时空表达以及KK-42对其表达的影响进行探讨.将体长3.5～5.0 cm凡纳滨对虾幼虾随机分为2组,分别用1.95×10~4 mol/L的KK-42溶液或不含KK-42的溶液浸泡处理1min,之后在相同条件下常规饲养.不同组织中FAMeT mRNA水平定量分析采用real-time PCR,血淋巴中MF滴度测定采用正相高效液相色谱法.结果显示,对照组FAMeT在眼柄、肌肉组织中的表达模式与大颚器官明显不同:在实验观察期间,前者组织中mRNA水平相对较低且变化较小,而在大颚器官则出现明显的波动,第2天、6天、7天、8天FAMeT mRNA含量比第0天均增加1倍以上(P<0.01).实验期间血淋巴中MF滴度逐渐升高.KK-42处理后,上述3个组织中FAMeT表达均出现不同程度下调,尤以大颚器官最为显著,mRNA水平降低19.7%～63.4%(第8天除外);KK-42处理也导致MF滴度下降.研究表明,KK-42可显著抑制凡纳滨对虾眼柄、肌肉、特别是大颚器官FAMeT转录,降低血淋巴MF滴度,这可能是其促生长的机制之一.     

凡纳滨对虾饲料添加剂的研究进展

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)俗称南美白对虾,是目前世界养殖产量最高的三大虾种之一,具有对水环境抗逆能力强、营养要求低、生长速度快,虾体含肉量大、肉质鲜美、营养丰富等诸多优点,自1998年来,在广东、广西、海南等省(区)广为     

凡纳滨对虾血蓝蛋白的抗黑曲霉活性

 以凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)为研究对象, 运用亲和层析、SDS-PAGE、Western-blotting、抗真菌实验等技术探索对虾血蓝蛋白的抗黑曲菌活性。结果发现, 血蓝蛋白在质量浓度为0.1～0.8 mg/mL时对黑曲霉(Aspergillus niger)生长表现出明显的抑制活性。在此基础上, 选取0.2 mg/mL血蓝蛋白作用后的黑曲霉进行显微观察分析。光学显微镜观察结果表明, 血蓝蛋白能抑制黑曲霉孢子生长。扫描电镜分析显示, 在血蓝蛋白作用下, 黑曲霉孢子囊萎缩, 分生孢子集聚成团, 菌丝裂解、扭曲、变短、无分生孢子囊。由此推测, 对虾血蓝蛋白具有抗黑曲菌活性, 其抗菌机制可能与血蓝蛋白抑制黑曲菌孢子生长和促使病态菌丝产生等有关。本研究对揭示血蓝蛋白的非特异性免疫机理和寻找新的对虾疾病免疫学防治途径等具有重要意义。

     

凡纳滨对虾养殖成本控制浅析

本文主要从养殖管理、饵料选择投喂及苗种选择等几方面介绍了凡纳滨对虾在养殖过程中成本控制技术要点,为指导生产实践提供借鉴。     

凡纳滨对虾精氨酸激酶的多克隆抗体制备及组织特异性表达分析

精氨酸激酶（arginine kinase,AK）在调节无脊椎动物磷酸精氨酸与ATP之间能量平衡的过程中具有重要作用。在前期工作基础上,设计特异引物,以凡纳滨对虾肌肉组织cDNA为模版,克隆得到了1 071 bp的凡纳滨对虾精氨酸激酶的完整开放阅读框;将它克隆到原核表达载体pGEX-4T-2上,转化BL21 (DE3) 菌株,经诱导后表达出GST-AK融合蛋白。以纯化的融合蛋白作为抗原免疫小鼠,制备多克隆抗血清,经检测该抗原与抗体识别良好。利用得到的抗体对凡纳滨对虾AK在蛋白质水平上的特异性表达进行分析发现,精氨酸激酶在对虾的肌肉、心脏、神经、血细胞和胃组织中具有高的表达量,而在眼柄、肝胰腺、鳃和皮肤组织中表达量较低。为进一步研究精氨酸激酶在对虾体内的功能奠定了基础。     

盐度和营养对凡纳滨对虾蜕壳和生长的影响

采用实验生态学方法以初始体质量为(2.01±0.02) g的凡纳滨对虾为研究对象,投喂不同蛋白水平饲料,实验周期30 d,研究了盐度和饲料蛋白水平对凡纳滨对虾蜕壳和生长的影响。实验采用5×3析因设计,盐度梯度设置为6、12、18、24、30五个水平,饲料蛋白水平梯度设置为30%、36%、42%三个水平。结果表明:(1) 对虾蜕壳相对增重率呈现出随盐度上升而降低的变化趋势,以盐度为6时蜕壳相对增重率为最高。盐度和饲料蛋白水平及其交互作用对实验对虾蜕壳相对增重率影响差异显著(P＜0.05);对虾的特定生长率随盐度升高而上升,盐度和饲料蛋白水平对特定生长率影响差异显著(P＜0.05),其交互作用对特定生长率影响差异不显著。(2) 实验对虾的蜕壳频率,在低盐度水平下随盐度的增加而显著增加(P＜0.05),盐度18时蜕壳频率达到最高,之后随盐度的升高蜕壳频率下降,差异不显著。各盐度水平下,以中等蛋白质水平饲料组(36%)对虾蜕壳频率较高。方差分析表明,盐度和饲料蛋白水平对蜕壳频率影响差异显著(P＜0.05),其交互作用对蜕壳频率影响差异不显著。(3) 对虾蜕壳间期随盐度升高呈先延长后缩短的变化趋势。盐度对对虾蜕壳间期影响差异显著(P＜0.05),饲料蛋白水平单因子以及它和盐度的交互作用对对虾蜕壳间期影响不显著。     

模拟探究凡纳滨对虾磷脂在贮藏过程中的水解机理

为探究凡纳滨对虾磷脂(PL)在贮藏过程中的水解机理,本研究建立了磷脂相关酶与磷脂酰胆碱(PC)的体外模型,模拟凡纳滨对虾磷脂水解反应。实验分别从凡纳滨对虾体内分离纯化得到磷脂相关酶与PC,进行体外反应,并采用"鸟枪"脂质组学法及气相色谱—质谱法分析水解反应前后PC、溶血磷脂(LPL)及游离脂肪酸(FFA)的组成和含量变化,进而推断磷脂的水解机理。结果显示,凡纳滨对虾体内磷脂水解酶包括脂肪酶、磷脂酶A_1(PLA_1)、磷脂酶A_2(PLA_2)、磷脂酶C(PLC)及磷脂酶D(PLD),其中PLA2活力最高,可达177.87 U。体外模拟反应中,凡纳滨对虾PC含量由516.45显著降至146.14 mg/g,总FFA含量由36.42上升至568.57 mg/g,其中多不饱和脂肪酸(PUFA)显著增加了280.5 mg/g。通过相关性分析水解前后磷脂水解酶活力变化与PC含量变化,发现PC的变化与PLA2显著相关(R=0.91)。研究表明水产品中PC变化是磷脂相关酶催化的水解反应,其水解产物主要为FFA与LPC,且PLA_2对水产品贮藏过程中磷脂的水解影响最大。本实验建立了新型的体外水解模型,并初步探究了磷脂的水解机理,为水产品贮藏及磷脂酶的研究及应用奠定了理论基础。     

冻融循环过程中虾过敏原的免疫原性变化

采用凡纳滨对虾为研究对象,分别将过敏原提取物在-3,-20和-80 ℃的贮存条件下反复冻融1~5次,通过测定每次冻融后的蛋白浓度,过敏原免疫原性等探讨过敏原在不同温度循环下的变化,分析冻融循环对过敏原提取物活性的影响。结果表明,虾过敏原提取物在-80、-20、-3 ℃冻融循环5次时,蛋白浓度分别下降33.1%、30.0%和24.2%;在-80和-20 ℃冻融循环4次时,主要过敏原条带发生降解,-3 ℃冻融循环5次,主要过敏原条带不会发生变化。在-80和-20 ℃冻融循环5次以及在-3 ℃冻融3次时,过敏活性降低;在-80和-20 ℃冻融5次,主要过敏原的免疫印迹条带消失,在-3 ℃冻融的免疫印迹条带没有变化。因此,应尽量减少过敏原蛋白冻融次数,保证贮存在-80和-20 ℃的过敏原冻融循环4次以内以及-3 ℃冻融循环2次以内,以保证实验结果的准确性。     

玉足海参与凡纳滨对虾的混养效果

在室内条件下进行了玉足海参与凡纳滨对虾的混养实验,分析了单养与混养两种条件下养殖水体营养盐结构以及底质成分的变化,测定了对虾与海参的存活率与生长性能。结果显示,混养海参可以明显改变养殖系统的营养盐结构,可使水体中的磷酸盐和硝酸盐浓度有所升高,同时也可有效地控制系统中氨氮浓度。混养海参也可以大幅度地降低沉积物中有机质和硫化物含量,实验结束时混养组硫化物含量为(7.71±1.33)mg/kg,仅相当于单养组浓度的1/3。混养海参对对虾生长及存活具有明显的促进作用,其中混养组对虾体长特异增长率为(0.69±0.13)%/d,显著优于单养组(0.45±0.06)%/d;混养组对虾成活率可达72.5%±22.9%,显著高于对照组55.0%±17.5%。在混养系统内,对虾不会对海参的生存造成负面影响,海参能够有效地选择摄食和利用沉积物中的营养物质(对食物中有机质的同化率可达36.36%±13.79%),并以较快的速度生长。结果表明,在对虾养殖系统中混养玉足海参具有明显的环境与经济效益。本研究可为我国海水养殖业的可持续发展提供一定的科学依据。     

七种不同结构糖源对凡纳滨对虾三大营养物质代谢的影响

本实验研究了不同结构糖源饲料对初始体质量为(0.14±0.01)g的凡纳滨对虾生长、体组成及相关代谢的影响。实验共设7个处理,基础饲料中分别添加7种结构不同的糖源:葡萄糖、果糖、葡萄糖+果糖(1∶1)、蔗糖、麦芽糖、玉米淀粉和糊精,添加水平为20%。每处理设3个平行,每个平行放50尾虾,实验期56 d。结果表明,实验饲料对凡纳滨对虾的特定生长率和蛋白质效率有显著影响,呈现多糖蔗糖其他,其中葡萄糖组最低;实验饲料对凡纳滨对虾的全虾水分、灰分、蛋白质无显著影响,但对脂肪、肝糖原、肌糖原的影响显著。不同结构的糖源饲料对糖代谢相关酶及产物产生显著影响,对脂肪和蛋白代谢酶及产物影响不显著。     

凡纳滨对虾肠道内产消化酶益生菌的分离与筛选

为获得具有消化酶活性且安全的益生菌,从凡纳滨对虾肠道中初步分离得到576株细菌,对菌株进行产蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶能力的定性及定量测试,筛选出产酶种类多且产酶能力强的菌株11株。对筛选出的11株菌进行了幼虾浸浴实验、药敏性实验和溶血性实验,以评价其生物安全性。将11株菌的菌悬液添加到凡纳滨对虾幼虾的养殖水体中进行浸浴实验,浸浴结束后用鳗弧菌进行刺激,测定不同浸浴组幼虾相关免疫基因的相对表达量,以确定其对幼虾的保护效果。综合消化酶活性、菌株对幼虾的保护效果及生物安全性,筛选得到4株效果较好的菌株。菌株的16S r DNA分子鉴定结果表明,细菌1号、2号和4号分别与芽孢杆菌(Bacillus sp.PCSAS2-38,GQ284495.1)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus strain N419,JN400121.1)及苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis strain EA26.1,KC758847.1)的相似性均为100%,9号菌株与荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus strain PSB-03,FJ866782.1)相似性达到99%,为后续益生菌制剂的开发奠定了前期基础。     

凡纳滨对虾含溴结构域蛋白基因cDNA序列的克隆和表达特征

含溴结构域蛋白(bromodomain/BRD-containing protein, BCP)是一种高度保守的蛋白,属于含溴结构域和额外终端域(bromodomain and extraterminal, BET)蛋白超家族成员。该蛋白在有丝分裂过程中通过募集不同的染色体修饰蛋白,达到了广泛调控基因复制及转录的作用,其表达水平的变化常与肿瘤及炎症的发生相关联。本研究根据实验室前期转录组结果提示信息,首次获得了凡纳滨对虾2 229 bp的BCP基因cDNA序列(LvBRD, GenBank注册号:MH638256),利用在线软件进行了生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR (qPCR)技术分析了该基因的组织表达特征和其在对虾白斑综合征病毒(WSSV)、苏云金芽孢杆菌以及副溶血性弧菌侵染过程中的表达变化特征。结果显示,LvBRD编码的蛋白质有一个保守的可以参与细胞周期调控过程的溴结构域(bromodomain,BRD);组织表达分析表明该基因主要在凡纳滨对虾血细胞、肝胰腺和鳃组织中表达;在WSSV和病原菌感染后早期(0.5～12 hours past infection,hpi),Lv-BRD的表达可以被显著诱导,在血细胞中呈明显上调的表达趋势,表明该基因在一定程度上参与了对虾体内由病原引发的天然免疫应答反应。上述研究结果为进一步研究Lv-BRD基因在对虾抗病毒免疫及干扰素调控过程中的功能和作用机制奠定了基础。