低氮、磷胁迫对坛紫菜叶状体生理生化特征的影响

以坛紫菜耐低氮(N)、磷(P)品系9号Ⅳ叶状体为材料,研究了低N、P胁迫不同时间水平对坛紫菜品质及自由基含量、过氧化氢(H₂O₂)含量、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性和游离脯氨酸(Pro)含量等生理指标的影响。结果表明,在低N、P胁迫条件下,作为坛紫菜品质重要指标的光合色素、粗蛋白和游离氨基酸含量均显著下降,而其余各项生理指标均随胁迫时间增加表现为动态变化的过程,由此推测耐低N、P型坛紫菜叶状体应答低N、P胁迫的生理过程为:低N、P胁迫→活性氧含量上升→细胞膜氧化受损,产生大量膜脂过氧化物→细胞感受到过量的活性氧信号→抗氧化系统和渗透压调节系统共同响应,清除活性氧→自由基含量下降。该实验结果为全面了解坛紫菜应答低N、P胁迫的生理机制奠定了基础,同时也为后续坛紫菜抗逆新品种的选育提供了理论指导。     

坛紫菜叶状体对失水胁迫的抗氧化生理响应

失水胁迫是潮间带中高潮区坛紫菜(Pyropia haitanensis)的主要胁迫因子。本研究以坛紫菜叶状体为材料, 探讨其在不同失水程度下细胞中超氧阴离子自由基( ·)含量、过氧化氢(H₂O₂)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性、过氧化氢酶(CAT)活性、谷胱甘肽还原酶(GR)活性、还原型谷胱甘肽(GSH)含量和抗坏血酸(ASA)含量的动态变化过程。结果表明, 坛紫菜叶状体生理适应的关键转变点在失水率达到60%时。当失水率低于60%时, 细胞内的活性氧成分以毒性较低的H₂O₂为主, APX活性、ASA含量和GSH含量无显著变化, SOD、CAT和GR活性呈现显著下降趋势; 但当超过60%时, 细胞内的活性氧成分转变为以高毒性的  ·为主, 抗氧化酶SOD、CAT、APX活性无显著上升, 但GR活性、ASA含量和GSH含量均有显著上升。由此间接说明, 坛紫菜细胞在高度失水胁迫时所产生的活性氧成分, 主要是由GR、ASA和GSH作为清除剂去除的。本研究旨在通过探讨细胞抗氧化系统在坛紫菜失水胁迫应答中的作用机制, 为深入了解坛紫菜失水耐受性的生理过程提供理论依据。

     

高温静水胁迫培养对坛紫菜品质的影响

以坛紫菜耐高温型品系Z-61 F4代叶状体为实验材料,野生型坛紫菜（WT）叶状体为对照,研究了常温（21℃）静水和高温（30℃）静水培养不同天数（0、2、4、6、8、10 d）后,坛紫菜藻体中光合色素含量、粗蛋白含量、总氨基酸含量和4种主要呈味游离氨基酸含量等品质指标的变化情况。结果表明,常温静水培养对坛紫菜耐高温型品系的品质没有显著影响,甚至短时间的常温静水培养还有利于提高野生型品系藻体的品质;但高温静水培养会显著降低耐高温型品系和野生型品系的品质,只是耐高温型品系的品质下降速度要慢于野生型。此外,本研究还发现,耐高温型坛紫菜品系还可以通过调节藻体细胞内别藻蓝蛋白（APC）和游离氨基酸的含量来增强自身对高温胁迫的抵抗能力。本研究结果为全面认识坛紫菜的抗逆性机理提供了基础资料,同时也为后续坛紫菜抗逆新品种的选育提供了理论指导。     

不同高温胁迫条件下的坛紫菜中植物激素分析

为了研究高温胁迫条件下内源性植物激素的变化趋势与坛紫菜在高温耐受性之间的相互关系,实验以在宁波象山采集的"浙东1号"坛紫菜叶状体为样品,以液相色—谱质谱联用的选择离子模式作为分析手段,系统地分析了高温胁迫条件下,坛紫菜中11种植物激素含量的变化。结果显示,在高温胁迫环境中共检测出7种植物激素,分别为异戊烯腺苷、异戊烯腺嘌呤、反式玉米素核苷、吲哚乙酸、茉莉酸甲酯、水杨酸和茉莉酸。在20、25、28和35°C下,茉莉酸和茉莉酸甲酯的含量随着刺激温度的上升而升高;吲哚乙酸、反式玉米素核苷、异戊烯腺苷和异戊烯腺嘌呤在高温组中的含量要明显低于对照组,呈现下降的趋势。以28°C作为胁迫温度,在不同胁迫时间下,吲哚乙酸、反式玉米素核苷、异戊烯腺苷和异戊烯腺嘌呤的含量随着胁迫时间的延长而降低;水杨酸和茉莉酸甲酯的含量随着胁迫时间的延长而上升;茉莉酸的含量先升高后下降。在恢复培养过程中,水杨酸、茉莉酸、吲哚乙酸和茉莉酸甲酯的含量均呈现下降、升高又下降的变化趋势,而反式玉米素核苷、异戊烯腺苷和异戊烯腺嘌呤的含量则随着恢复培养过程的进行而逐渐下降。高温胁迫下,坛紫菜在促进生长类激素和胁迫抑制类激素的共同调控下进行胁迫防御,维持自身生长。然而,坛紫菜的防御能力有限,且高温胁迫引起的藻体自损伤可能难以修复。     

坛紫菜响应高光胁迫的分子机制

坛紫菜（Neoporphyra haitanensis）生活于中高潮区,退潮后会遭受到周期性的强光胁迫,但高潮复水后坛紫菜叶状体可以快速恢复正常生长,表明坛紫菜具有极强的耐高光能力。然而,其耐高光机制尚不明确。为此,本研究挑选了两个耐高光能力具有显著差异的坛紫菜新品系作为研究对象（绿色品系：9-IV;桔色品系：WO141-3）,测定了高光胁迫下两个品系藻体的光合速率、抗氧化酶活性等生理指标,构建了两个品系的差异转录表达谱,并结合荧光定量分析技术获得了调控坛紫菜耐高光的关键通路和基因。具体结果如下：在高光胁迫下,两种坛紫菜品系叶状体的丙二醛含量均显著上升,光系统部分基因表达量显著降低,藻体光合能力显著下降。进一步分析发现,WO141-3品系在高光处理1 h具有更强的高光抗性,而9-IV品系在处理4 h后具有更强的高光抗性,造成这种差异的主要原因是：高光胁迫处理1 h时,WO141-3品系具有更高的活性氧清除能力、更强的非光化学淬灭能力以及更低的色素含量和捕光蛋白基因表达量;而在高光胁迫处理4 h时,9-IV品系的活性氧清除能力和非光化学淬灭能力更强,色素含量和捕光蛋白基因表达量都更低。以上结果说明,坛紫菜藻体可以通过激活非光化学淬灭机制和抗氧化系统,以及降低色素含量和捕光蛋白基因表达应对高光胁迫,避免遭受过度光损伤和氧化损伤。本研究结果为阐明紫菜的耐高光机理奠定了理论基础。     

低盐胁迫下坛紫菜叶状体的转录组分析

为探索坛紫菜叶状体响应低盐胁迫的分子生理学机制,本研究采用第二代高通量测序技术,分析比较在正常盐度(26,对照组)和低盐度(3,胁迫组)下培养不同时间(3、6和9 h)的坛紫菜叶状体转录组数据。结果显示,测序数据经de novo组装,获得了33 872条unigenes,平均长度为612 bp;与对照组相比,3个胁迫组分别产生了1108、1638和1881条差异性表达基因。GO功能富集分析显示,一些可能与低盐胁迫相关的重要生物过程得到了显著富集,如单分子有机物代谢过程,单糖的合成代谢和分解过程,糖质新生,有机物分解代谢过程等。KEGG代谢通路富集分析发现,低盐胁迫不同时间富集到的代谢通路存在很大差异,低盐胁迫3 h响应的差异性表达基因富集到3个KEGG代谢通路,其中2个与氨基酸合成相关,1个与光合作用相关;而低盐胁迫6和9 h的差异性表达基因则大多富集到与糖类功能相关的代谢通路。荧光定量PCR(q RT-PCR)验证结果显示,所选取的8个差异性表达基因的表达趋势与高通量测序结果相一致。上述结果说明,坛紫菜叶状体在受到低盐胁迫时,应激反应具有时间特异性,早期主要通过合成或者降解蛋白质来抵御低盐环境,随着胁迫时间延长,细胞通过改变可溶性物质的含量、减慢能量代谢等途径以抵御低盐逆境。     

甲胺磷、辛硫磷对坛紫菜叶状体的生理效应

In this paper, the effects of methmidophos and phoxim with different concentrations and schedule on soluble protein content and chlorophyl a (Chla) content in Porphyra haintanensis were studied under experimental and ecological conditions. The results showed as follows: (1) there were some time-effect and dose-effect relationships between the pollutants and Chla contents. The Chla content of most of groups decreased with the increasing of dose and prolonging of the exposure time. In the same concentration, the toxicities of phoxim to Chla content was stronger than that of methmidophos. (2) All concentration groups in this study didn‘t show the significant time-effect and dose-effect relationships between pollutants and the soluble protein. And there was no significant difference of the soluble protein content among various groups.     

高温胁迫下条斑紫菜叶状体HSP70基因的表达谱分析

采用实时荧光定量RT-PCR技术检测了条斑紫菜叶状体在25℃高温胁迫下PyHSP70-1基因的相对表达量变化。定量分析显示PyHSP70-1基因表达受到高温胁迫的显著诱导。在持续高温胁迫下,PyHSP70-1表达量在8 h时达到最大,此后一直维持在较高水平,且与对照差异显著。在短暂高温胁迫结束后PyHSP70-1表达量最大,随着恢复时间的增加,其mRNA量逐渐减少,在恢复的24 h时间内,mRNA量仍然显著高于对照。结果表明PyHSP70-1是诱导型HSP,受热激诱导表达,在热激胁迫中维持细胞蛋白与膜的稳定,对细胞具有重要的保护作用。     

高光胁迫下坛紫菜定量PCR内参基因的筛选

为了筛选不同高光光强胁迫下坛紫菜中表达水平最为稳定的内参基因,本研究采用qRT-PCR技术测定了植物中常用的6种内参基因UBC、TUB、18S、EF2、ACT和GAPDH在不同光照强度下培养的坛紫菜藻体中的绝对表达水平,并采用比较Ct值法、Ge Norm、Bestkeeper和NormFinder软件分析4种方法对6种候选内参基因的表达稳定性进行评估。结果显示,UBC的Ct值变化范围最小,18S的Ct值变化范围最大;ge Norm软件分析结果显示最稳定的内参基因为UBC和EF2;Bestkeeper和NormFinder软件分析结果类似,UBC基因的稳定值M均为最低值(分别为0.044和0.80),说明其表达水平最稳定。研究表明,UBC基因可以作为不同光照条件下坛紫菜基因表达qRT-PCR分析的最适内参基因。     

坛紫菜抗高温品系的筛选

坛紫菜抗高温品系的筛选=Selection of a high-temperature resistant strain of Porphyra haitanensis (Rhodophyta)［刊,中］/严兴洪（上海水产大学,上海200090）,马少玉//水产学报,—2007,31(1).-112～117 从已获得的4种坛紫菜优质高产品系中,筛选出抗高温的优良品系YZ-3。在28 ℃和29 ℃下培养15 d后,YZ-3品系的壳孢子成活率分别达73.2%和52.6%,分裂率分别为100%和82.8%;而对照组野生型（WT）品系的壳孢子成活率分别只有10.3%和4.6%,分裂率分别为89.7%和65.9%;YZ-3品系的壳孢子成活率和分裂率均远高于WT品系。把在常温(24 ℃)下培养35 d的壳孢子苗,再分别培养在24、28和29 ℃作抗高温试验,培养25 d后发现,YZ-3品系的幼苗平均体长分别增加了33.6、23和15倍,而WT品系的苗平均体长分别只增加了7.7、1.4和0.9倍;YZ-3品系的苗平均体长分别是WT品系的3.8、8.8和7.4倍。在28 ℃和29 ℃组,WT品系幼苗培养15 d就大面积腐烂; 而YZ-3品系幼苗培养25 d也不腐烂。上述结果表明YZ-3品系是抗高温的。图6表3参15 关键词：坛紫菜;叶状体;品系;高温;壳孢子;生长 E-mail：xhyan@shfu.edu.cn     

坛紫菜自由丝状体响应琼胶寡糖的激发

为了研究琼胶寡糖对坛紫菜自由丝状体藻丝生长和壳孢子囊枝形成的激发的影响,实验采用琼胶寡糖激发坛紫菜自由丝状体,以液相氧电极检测坛紫菜丝状体净光合放氧速率的变化;以对羟基苯乙酸(POHPAA)化学发光法检测坛紫菜丝状体的H_2O_2释放量;利用LC-MS检测红藻糖苷含量变化;利用实时定量PCR技术检测坛紫菜丝状体H_2O_2产生相关基因(Phrboh、Ph SOD)和红藻糖苷合成相关基因(Phnho1、Phgpdh、Phtps)的表达情况;并利用显微镜观察法检测壳孢子囊枝数量的变化。结果发现,琼胶寡糖能够激发坛紫菜自由丝状体的系列响应,表现在净光合放氧速率以及光合同化产物红藻糖苷的含量和生物合成出现增加;H_2O_2释放量持续增加,与产生H_2O_2相关的2个酶基因Phrboh和Ph SOD的表达增强。此外,琼胶寡糖也能够促进在坛紫菜自由丝状体的发育,在培养第30天时,琼胶寡糖处理组的壳孢子囊枝形成率达到59%,显著高于对照组46%。综上所述,琼胶寡糖能够增加坛紫菜自由丝状体的光合速率和光合同化产物,并通过形成H_2O_2的酶的表达来诱导活性氧的释放;琼胶寡糖还能促进坛紫菜自由丝状体的繁殖发育。     

坛紫菜叶状体蛋白质双向电泳样品制备方法的比较

蛋白质样品的制备是双向电泳分析的关键。为探索适用于坛紫菜叶状体蛋白质双向电泳样品的制备方法,实验对3种常用植物蛋白质分离方法进行了优化和改进,并分别同3种蛋白质裂解液联用,比较了9种方法的总蛋白质得率及双向电泳图谱效果。结果发现,采用三氯乙酸/丙酮沉淀法与裂解液C(7 mol/L 尿素,2 mol/L 硫脲,2%CHAPS,2%TritonX-100,2% IPG Buffer pH 3~10,65 mmol/L DTT)联用的方法,坛紫菜叶状体的蛋白质得率最高,且双向电泳图谱显示此法获得的蛋白质点数最多,蛋白点形状规则,水平和垂直拖尾情况较轻,图像清晰。实验结果还发现,在进行双向电泳分析时,采用pH 4~7的胶条可以使坛紫菜叶状体蛋白质得到更为有效的分离。     

坛紫菜种质材料DNA指纹图谱的构建

采用20对简单重复序列(SSR)引物对福建省坛紫菜种质资源库中保存的44个坛紫菜种质材料进行了遗传分析,共检测到了81个多态性位点,每对引物检测到的等位基因介于2~6个之间,平均为4.05个,引物的PIC值介于0.15~0.79之间,平均为0.57。然后根据3对引物(Phes08,Phes03和PC13)扩增出的16个多态性位点构建了44个坛紫菜种质材料的指纹图谱库,使得每一种质材料均具有其特异的DNA指纹图谱。并根据指纹图谱中各扩增位点条带的有无,将指纹图谱转化成了计算机可以识别的数码指纹,开发了相应的数码指纹识别软件,为坛紫菜种质的自动化鉴定及坛紫菜种质资源库的信息化管理奠定了基础。     

5.8S rDNA-ITS区片段的序列分析在坛紫菜种质鉴定中的应用

为探讨DNA序列标记技术在坛紫菜种质鉴定中的应用,对10个野生坛紫菜种质材料的5.8S rDNA-ITS区进行PCR扩增和序列分析,结果发现扩增的片段长度在1 208~1 219 bp之间,可以分为ITS1区,5.8S区和ITS2区3个部分,其中5.8S区片段的长度完全一致,均为160 bp;ITS1区和ITS2区片段的长度也非常接近,只有几个碱基的差异。多重序列比对发现10个种质材料的ITS区（包括ITS1和ITS2）序列都存在一定差异,序列同源性在95.82％~99.73％之间,而5.8S区序列则完全一致,但与其它种紫菜的5.8S区序列有很大差异,序列同源性在79.7％~95.0％之间。由此认为5.8S rDNA-ITS区这种高度保守区和高变区交替排列的形式可以成为坛紫菜种质鉴定及系统进化分析的强有力工具。     

坛紫菜核糖体蛋白S7基因的克隆与表达分析

为了研究坛紫菜在高温胁迫条件下的分子应答机制,应用引物退火控制(ACP)技术对耐高温型纯系(Z-61)叶状体在高温胁迫条件下的差异表达基因进行筛选时,获得了一条核糖体蛋白S7基因的全长序列,命名为Phrps7(GenBank登录号:JF719273).该基因序列全长702 bp,包含一个585 bp的开放阅读框,其编码195个氨基酸的核糖体S7蛋白( PhRPS7),蛋白分子式为C984H1604N294O283S2,由5条α螺旋,6个片层及6个环状连接组成,与多个物种的RPS7蛋白具有较高的序列一致性(＞55％).系统进化树分析表明,PhRPS7蛋白与真菌的亲缘关系较近,而与其它物种的亲缘关系较远.实时荧光定量PCR分析结果表明,Phrps7基因的表达水平与高温胁迫密切相关,在高温胁迫刚开始时(0 ～6d),Phrps7基因的表达水平极显著上调,而随着胁迫的继续(＞6 d),表达量又有所下调,但仍显著高于胁迫开始前.     

高温下芽孢杆菌对坛紫菜生长及生理的影响

坛紫菜是我国东海区栽培的重要经济海藻,其生长适温为20°C,极限高温为29°C。高温和病原菌均会导致坛紫菜生长受抑、藻体病烂。为研究高温下藻际微生物对坛紫菜生长的影响,本文以坛紫菜叶状体和藻际芽孢杆菌(实验证明该菌株在20°C下为紫菜的益生菌)为材料,检测了在28°C下藻际芽孢杆菌对坛紫菜相对生长率(RGR),抗氧化酶(SOD、POD)活性,可溶性蛋白、游离脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)和藻胆蛋白含量等生理指标的影响。结果显示,28°C下,在实验初始阶段,菌藻共培养组坛紫菜比纯培养对照组有较高的RGR,但随着培养时间的延长,两组的RGR无显著性差异;4 d后两组坛紫菜均出现腐烂,菌藻共培养组的藻体腐烂程度更为剧烈;培养24 h后,菌藻共培养组的SOD、POD活性和MDA水平均显著高于对照组,而渗透调节物质可溶性蛋白和Pro显著低于对照组;共培养组中,坛紫菜的藻胆蛋白含量均显著高于对照组。该研究表明,28°C下,虽然在短期内藻际芽孢杆菌会促进坛紫菜的生长,但随着培养时间的延长反而不利于坛紫菜的生长,且加剧活性氧和渗透压胁迫,表明该菌的生态功能因环境变化而发生了改变。     

坛紫菜优良品系“申福2号”的特性分析与海区中试

以人工选育的坛紫菜优良品种“申福1号”( SF-1)、优良品系“申福2号”(SF-2)和野生型品系(WT)为材料,通过室内培养与海区中试,对SF-2的优良特性和生产适用性进行评估.结果发现,与WT相比,SF-2的叶状体在生长速率、藻胆蛋白含量、藻体厚度及产量上均存在十分显著的优势.在相同的室内培养条件下,SF-2叶状体的绝对生长速率显著高于WT,培养至90d时,其平均长度为(391.6 ±47.37) cm,是WT的10倍.3个品系(种)的叶状体活体吸收光谱在350～750 nm范围内均存在5个明显的吸收峰,SF-1与SF-2之间的各峰值差别较小,但均明显高于WT.SF-2叶状体的藻胆蛋白(PE+PC)含量为(90.81±3.98) mg/g,是WT的1.95倍左右,比SF-1的含量稍高.SF-2叶状体的平均厚度为(31.95±4.16) μm,分别比WT与SF-1薄38.7％和14.0％.SF-2的壳孢子放散量约为28.6万个/壳,比SF-1提高了43.0％,可以满足生产采苗需求.海区栽培的前四水鲜菜重量,SF-2为24 000 kg/hm2,比WT和SF-1分别增加30.1％和6.7％.上述结果证实,SF-2的海区壳孢子放散量可以达到生产要求,叶状体的生长速率、生长期、产量和品质比WT均明显提高,生长优势十分明显.所以,该品系有望在生产上进行大规模栽培.     

不同培养条件对长紫菜叶状体生长及生理响应的研究

为探索长紫菜在不同培养条件下的生理响应,研究了在不同温度、盐度和光照培养条件长紫菜叶状体的生长及生理响应,主要测定藻体的生长、光合色素、可溶性蛋白和丙二醛(MDA)含量、抗氧化酶活性等生理指标的变化。结果表明,在培养温度为17～20 ℃时,长紫菜藻体可以保持较高相对生长速率,当温度高于23 ℃时,其生长明显受到抑制,藻体发红并出现溃烂;长紫菜叶状体在盐度25～35下可以保持较快生长,在低于盐度25的条件下,藻体的光合色素、可溶性蛋白、丙二醛(MDA)的含量以及过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性均产生显著的变化,并观察到藻体变薄、发白、腐烂现象;在光照为3 000～6 000 lx时,藻体生长速率较为稳定,藻体在光照为9 000 lx条件下的叶绿素a含量低,可溶性蛋白和MDA含量以及POD活性都出现显著增高,并观察到发红及溃烂现象。因此,适合长紫菜叶状体生长的温度为17～20 ℃,盐度为25～35,光照在6 000 lx左右。