亚洲玉米螟pdp1的克隆及功能分析

【目的】克隆获得亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）蛋白酶激活受体类转录因子pdp1（protease- activated receptor-domain protein1）（Ofpdp1）cDNA序列（GenBank登录号：KC857457）,明确其基因结构特征,并进一步研究该基因的表达特性及其在生长发育过程中的作用,为亚洲玉米螟的遗传控制提供潜在的靶标基因。【方法】采用RT-PCR和PCR技术,克隆Ofpdp1 cDNA序列,利用相关软件进行生物信息学分析;利用qPCR（quantitative real-time polymerase chain reaction）研究卵期及幼虫期Ofpdp1表达特征;在原胚期利用RNA干扰技术（RNAi）研究其生物学功能。【结果】克隆得到基因Ofpdp1,全长为960 bp,开放阅读框804 bp,编码267个氨基酸,同源比对发现OfPDP1 C-末端与其它昆虫PAR bZIP（basic leucine zipper）转录因子非常相似,含有3个高度保守的结构域,系统发育分析的分类结果与生物学上物种分类相吻合。qPCR结果显示Ofpdp1的mRNA表达量在卵发育76 h左右存在显著的表达高峰。在亚洲玉米螟原胚期,注射Ofpdp1的双链RNA（dsRNA）48 h后,Ofpdp1 mRNA表达量被沉默了71%。【结论】成功地从亚洲玉米螟中克隆得到Ofpdp1,Ofpdp1进化非常保守,属于PAR bZIP亚家族;Ofpdp1可能在幼虫定型时期胚胎生理结构的变化过程中起到重要作用。     

亚洲玉米螟GOBP2的克隆、原核表达及多克隆抗体制备

 【目的】克隆、序列分析和原核表达亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）GOBP2（OfurGOBP2)的cDNA。【方法】以亚洲玉米螟触角为材料,采用RT-PCR结合RACE方法克隆OfurGOBP2的cDNA序列,并在pGEX-4T-2/BL21（DE3）系统中进行原核表达, 进一步利用制备的抗体检测OfurGOBP2蛋白。【结果】从亚洲玉米螟触角中获得了GOBP2的cDNA序列（GenBank登录号为DQ673101）,序列分析表明,OfurGOBP2开放阅读框489 bp,编码162个氨基酸残基,氨基酸序列中有6个保守的半胱氨酸位点,具有气味结合蛋白的典型特征。一致性分析显示,OfurGOBP2与其它鳞翅目昆虫GOBP2编码的氨基酸一致性较高,表明昆虫的GOBP2在分子进化过程中是保守的。进一步将OfurGOBP2与表达载体pGEX-4T-2连接,转入大肠杆菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导成功表达了相对分子质量为41 kD的可溶性融合蛋白。SDS-PAGE分析和Western印迹检测结果表明,OfurGOBP2能够高效表达,并与预测的融合蛋白分子量相符。利用制备的多克隆抗体对亚洲玉米螟GOBP2进行Western-blot分析,证明其能够特异识别OfurGOBP2蛋白。【结论】成功克隆了编码并表达亚洲玉米螟气味结合蛋白GOBP2 的cDNA序列,并制备了多克隆抗体,可用于深入研究亚洲玉米螟GOBP2的结构和功能。     

亚洲玉米螟幼虫P450基因片断的克隆与序列分析

根据G enB ank中昆虫P 450氨基酸保守序列设计了1对简并引物,以亚洲玉米螟田间自然种群基因组DNA为模板,扩增得到一条长度为603 bp的特异性DNA片段,编码201个氨基酸。将此氨基酸序列与G en-B ank中已知序列采用B last及C lusta lW EB I软件进行同源性分析,结果表明该氨基酸序列与CYP 4家族的同源性较高,达37%~53%,初步推测此序列为CYP 4家族的一员。     

特异腐质霉来源漆酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

漆酶是一种含铜的多酚氧化酶,在有机农药残留和木质素的降解方面具有潜在的工业价值。从特异腐质霉Y1(Humicola insolens Y1)中分离到了漆酶基因Lac1,其全长1 803 bp,编码600个氨基酸,与NCBI蛋白数据库比对结果表明,与来源于Chaetomium globosum CBS 148.51(XP_001228806)的多酚氧化酶序列相似性最高为71%,表明是一个新的漆酶基因。将其克隆入毕赤酵母表达载体pPIC9r中,通过PCR和SDS-PAGE检测证实基因已经整合入酵母基因组中且能分泌表达。在3 L发酵罐中,重组Lac1蛋白表达量达到3.79mg/mL发酵液,酶活性达到1.3 U/mL发酵液。酶学性质分析结果显示,漆酶的最适作用温度为65℃,最适反应pH为4.5,且在pH 6～11的范围内酶的相对活力均在70%以上。     

葡萄白藜芦醇合酶基因cDNA克隆及原核表达

从贝达葡萄中提取总RNA,采用RT-PCR方法,克隆到了白藜芦醇合酶(resveratrol synthase,RS)基因的全长cDNA。将其与圆叶葡萄(Vitis rotundifolia)、华东葡萄(Vitis pseudoreticulata)、河南毛葡萄(Vitis ficifolia)、河岸葡萄(Vitis vulpine)、酿酒葡萄(Vitis virufera)、羊蹄甲(Bauhinia)、花生(Arachis hvpogaea)、虎杖(Polygonum cuspiaatum)、大黄(Rheum officinale)进行氨基酸同源性比对,结果表明:分离的RS基因与其他葡萄的RS基因编码的氨基酸同源性达到97%以上,与其他属的RS基因编码的氨基酸同源性达到64%以上。生物信息学分析表明,该蛋白分子量为43kD,等电点pI=6.2,包含392个氨基酸残基。将RS的全长cDNA插入到表达载体pET28a中构建重组表达质粒pET28a-RS,转化大肠杆菌BL21,SDS-PAGE电泳检测结果表明,以30℃、0.5mmol.L-1IPTG诱导4h时该基因表达效果最好,诱导产物为1个约43kD的蛋白,为...     

玉木耳漆酶基因Aclac的克隆及原核表达

【目的】对玉木耳漆酶基因Aclac进行克隆及原核表达分析,为深入研究漆酶基因在玉木耳子实体发育中的生物学功能提供理论依据。【方法】克隆Aclac基因的cDNA和DNA全长序列,对其进行生物信息学分析,并将目的基因连接至pET-28a质粒上以构建原核表达载体pET28a-Aclac,将其转化大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达。【结果】克隆获得的Aclac基因cDNA序列长度为1734 bp,编码577个氨基酸残基;Aclac基因DNA序列长度为2521 bp,含14个内含子。AcLAC蛋白理论分子量为64.75 kD,理论等电点为5.70,不稳定指数为34.01,无跨膜区域,存在1个信号肽,在4个铜离子结合区高度保守,且含有Cupredoxin超家族蛋白保守功能域。AcLAC蛋白与真菌的漆酶蛋白聚为一支,其中,AcLAC蛋白与木耳属真菌的漆酶蛋白亲缘关系最近。AcLAC融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）表达宿主中成功表达,分子量为67 kD。【结论】克隆获得的Aclac基因属于Cupredoxin超家族基因,可在原核表达系统中异源表达,推测其与其他真菌漆酶基因在生物学功能上具有一致性,丰富了真菌漆酶资源。     

漆酶基因异源表达及其酶活性的研究进展

近年来由于漆酶在生物漂白和农作物秸秆利用等方面具有广阔的应用前景,对漆酶的研究越来越受到国内外学者的重视。然而,自然界漆酶的产量和酶活较低,难以适应工业化生产需求。此外,漆酶的产酶效率低,成本高。实现漆酶的异源高效表达是解决这一问题的有效途径。目前,国内外已有多种来源的漆酶基因被成功克隆,并在不同的宿主细胞中实现异源表达,但迄今为止漆酶基因异源表达结果仍然不理想,离真正实现漆酶的高效表达还有一定距离。     

亚洲玉米螟piggyBac类似因子的克隆及序列分析

为了深入了解piggyBac转座子家族的生物学特性及分子进化特点,采用简并PCR、反向PCR、RT-PCR和RACE等方法在农业害虫亚洲玉米螟中克隆到2个piggyBac类似因子,分别命名为OfPLE1和OfPLE2。利用生物信息学软件分析Of-PLE基因编码区序列结构以及与其他物种的系统发育关系,结果表明,OfPLE1全长1 866 bp,编码607个氨基酸;OfPLE2全长1 724 bp,编码434个氨基酸。两者同源性高达70%,与粉纹夜蛾piggyBac同源性分别为32%和26%,亲缘关系较远。     

亚洲玉米螟Pgi基因全长的同源PCR克隆

为从核酸水平上研究亚洲玉米螟Pgi基因,以GenBank中的鳞翅目昆虫Pgi基因mRNA序列为参考序列,利用MEGA 5.0软件、IDT在线程序及Primer Primer5.0软件等设计用于扩增亚洲玉米螟Pgi基因编码序列的引物,同时利用PCR扩增及序列分析验证引物的有效性。结果表明:测定的亚洲玉米螟Pgi基因编码序列与Genbank中美国白蛾、苜蓿黄蝶等鳞翅目昆虫Pgi基因mRNA序列均具有较高的相似度(达78%~85%),表明,设计的引物均具有较强的有效性,能成功地扩增出亚洲玉米螟Pgi基因编码序列。     

黄鳝脂肪酸去饱和酶及延长酶基因cDNA的克隆与表达

为了解黄鳝合成长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)的能力,利用Trizol提取黄鳝肝脏总RNA,经RT获得cDNA,基于脂肪酸去饱和酶(FAD)及延长酶(FAE)基因同源系列设计简并引物进行黄鳝cDNA的PCR扩增、测序,获得黄鳝FAD及FAE基因部分片段序列。然后分析黄鳝FAD及FAE的同源性和系统进化情况及黄鳝胚胎和胚后发育期仔鱼该两个基因的表达水平。结果表明:黄鳝FAD与军曹鱼的△6去饱和酶同源性高达85%,其次是大菱鲆(83%),FAE与军曹鱼、线鳢、澳大利亚金枪鱼等的同源性高达89%;但FAD和FAE在系统发育树中均自呈一支。FAD和FAE基因在黄鳝胚胎和胚后发育阶段均有表达,以出膜后2～4 d表达量最高。提示黄鳝具有合成LC-PUFA的能力,但不同发育阶段合成能力不同。     

来源于枯草芽孢杆菌的漆酶cotA基因克隆与表达及其酶学性质研究

漆酶作为一种含铜离子的多酚氧化酶,在环境保护、生物能源、食品工业和纸浆漂白等工业中有重要的应用价值。从枯草芽孢杆菌168菌株中克隆漆酶cotA基因,全长1 542 bp,编码513个氨基酸,外加一个终止密码子。将该基因在大肠杆菌Transetta（DE3）菌株中通过微好氧发酵法进行异源表达和纯化,获得的重组酶蛋白CotA的最适反应温度为60℃,最适pH为4.5。该酶在60℃具有较好的热稳定性,保温90 min后仍有71.70%的剩余酶活。最适反应条件下,重组酶对ABTS的Km为63.9±5 μmol/L,kcat为39.1±1/s,最大反应速率为0.005 μmol/L·min·mg,且在最适反应条件下,微好氧发酵法获得的重组酶蛋白CotA的比活（557.8 U/mg）是低温诱导法（0.2 U/mg）的2 655.4倍。因此,通过微好氧发酵法可以显著提高重组漆酶CotA的比活力。     

辣椒疫霉漆酶基因Pclac3克隆表达

辣椒疫霉是一种侵染性植物病原,能引起多种茄科及葫芦科植物的病害。利用同源克隆法从辣椒疫霉基因组内克隆了漆酶基因Pclac3,该基因全长1 881个核苷酸,编码626个氨基酸,与已知的真菌漆酶基因具有较高的同源性,并且具备漆酶基因的保守区域。利用PCR将该基因克隆于pPIC9K载体,并转化于毕赤酵母GS115,经过1%甲醇诱导表达获得其异源表达产物。将表达产物进行SDS-PAGE检测,获得分子量大约为90 kDa的特异蛋白。利用ABTS法对Pclac3的表达产物粗酶液进行酶活性分析发现,其活性在第11天时最大,达到45 U/mL。这为研究辣椒疫霉漆酶基因家族及探索卵菌漆酶生物活性及其潜在的应用提供了理论依据。     

转Bt基因玉米对亚洲玉米螟的抗性研究

以普通玉米杂交组合N3030为对照,通过田间调查、盆栽接虫试验、室内饲养和组织切片,系统研究了转B t基因玉米杂交组合N3030B t对亚洲玉米螟的抗性表现.结果表明,转B t基因玉米N3030B t上的虫孔率、百株幼虫数、百株隧道数和百株隧道长均极显著低于对照;1-3龄幼虫取食转B t基因玉米后1-2 d死亡,死亡率达90%以上;4龄以后死亡率为0,但其生长发育均受到一定的抑制;组织切片观察表明,亚洲玉米螟幼虫取食转B t基因玉米后,中肠肠壁细胞端部的微绒毛出现不同程度的溶解,大部分肠壁细胞排列松弛,细胞体缩短,细胞层变薄.该结果表明转B t基因玉米对亚洲玉米螟幼虫具有稳定的杀虫作用.     

亚洲玉米螟幼虫血细胞对外源体的包囊

    亚洲玉米螟幼虫血细胞包囊具双相性.当DEAE-sephadex珠子被诱导进亚洲玉米螟幼虫的血腔内后,颗粒细胞首先在3 min内吸附到珠子表面,浆细胞随后吸附形成多层浆细胞层,注射48 h后最终形成重叠细胞层的平滑囊鞘.完整的囊鞘显示有3层明显不同的区域.颗粒细胞起着最初识别血腔中的外源体作用,一旦珠子被颗粒细胞识别为外源体,颗粒细胞将裂解释放一些公认的物质诱导浆细胞识别外源体,于是包囊被立刻启动.总之,研究结果显示亚洲玉米螟幼虫包囊明显依赖血细胞之间的互相合作.     

甜高粱玉米螟虫害调查及防治技术研究

对甜高粱田内玉米螟进行了调查,并研究了不同药剂对其的防治效果。结果表明,甜高粱玉米螟以在1节内或钻过1节为害为主,且主要为害第6～8节。在成熟期,处理1和处理2的株高、生物产量和锤度均显著高于对照,透孔数显著低于对照;处理2的防治效果最好,增产率达18.77%。在天津甜高粱产区,可在心叶末期,用0.1%氯氟氰菊酯颗粒剂拌10倍细炉渣撒入心叶防治玉米螟。     

斯氏线虫对亚洲玉米螟种群的控制作用

采用均匀设计和自然种群生命表方法，研究了斯氏线虫Steinemema feltiae对亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis的控制作用．通过试验得出了应用斯氏线虫在甜玉米地控制亚洲玉米螟的最佳施用剂量和施用次数组合，即施用剂量为1．0万条／株，施用次数为2次(心叶中期喷第1次，5d后喷第2次)．     

异小杆线虫对亚洲玉米螟越冬代幼虫的侵染力

测定了异小杆线虫（Heterorhabditisbacteriophora）对亚洲玉米螟（Ostriniafurnacalis）的侵染力,结果表明：在供试剂量下,该种昆虫病原线虫对亚洲玉米螟的致死中量LD(50)=17．78±2．74（条线虫／玉米螟幼虫,IJ／L）,置信区间为23．15～2．41IJ／L,越冬代玉米螟幼虫对该种线虫高度敏感,应进一步进行田间防治试验。     

贵州省亚洲玉米螟的种群发生动态

为绿色高效地防控亚洲玉米螟,于2011—2015年采用灯诱法在贵州省贵阳市花溪区、息烽县和安顺市平坝县进行高原山地环境下亚洲玉米螟成虫的灯诱种群发生动态研究。结果表明:贵州亚洲玉米螟成虫始见于4月,终见于9月中旬至10月中旬,高峰日在7月下旬至8月上旬。全年累计诱虫量最高663头,最低175头;高峰旬累计诱虫量占全年诱虫量的比例最高可达33.71%,最低为17.13%;灯下虫峰数量1~2个,主峰明显,多在7月下旬至8月上旬。贵州亚洲玉米螟的灯诱种群发生动态与田间的发生危害基本一致。